UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN.

M FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS.

Diagnstico Molecular.

Producto Integrador de Aprendizaje III.

Diagnstico Molecular de enfermedad infecciosa causada por Prin:
Scrapie.

Bernal Vega Diana Sofa 1717837.

Guzmn Lucio Katia Melina 1717843.
Snchez Czares Mara Luisa 1717860.

SEMESTRE: 6xto.

Dra. Griselda Edith Menchaca Rodrguez.

Ciudad universitaria, San Nicols de los Garza.

19 de Mayo del 2017.

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Introduccin:
El Scrapie es una enfermedad degenerativa del sistema nervioso central de ovinos y caprinos
causada por priones, se caracteriza por producir irritabilidad y prurito intenso (Mndez y
Ramos 1996). El agente etiolgico corresponde a una protena infecciosa denominada prin
(PrPSc), una isoforma alterada e infectiva que se origina de una protena normal constitutiva
de la membrana celular (PrPC), que adquiere una conformacin estructural anmala con
peculiaridades inusuales, como son: su alto grado de insolubilidad (lo que le confiere la
resistencia a los mtodos de inactivacin), incapacidad de producir respuesta inmune en el
organismo afectado, gran capacidad para convertir la protena celular en patolgica, la que
se deposita formando placas amiloides en diferentes rganos, principalmente en el sistema
nervioso central (Faras 2013). Esta enfermedad se caracteriza por presentar prolongados
perodos de incubacin, por lo que los signos clnicos slo se presentan poco antes de la
muerte del animal, lo cual hace difcil realizar un diagnstico temprano, por ende, los
animales sanos estn expuestos a contraerla (Faras 2013). El diagnstico puede realizarse
mediante un anlisis histopatolgico, inmunohistoqumico, bioqumico (Western blot o
inmunotransferencia) y ultraestructural (SAF). A nivel histopatolgico, los cerebros de los
animales infectados parecen normales, pero microscpicamente se puede observar
astrogliosis, vacuolizacin intracelular y prdida neuronal. (Garca 2006), la desventaja que
presenta la deteccin de Scrapie a travs de microscopia es que slo se realiza post mortem.
Mientras que las tcnicas moleculares se basan en la inmunodeteccin de la PrPSc y en la
remocin proteoltica previa de la PrPC endgena. Para detectar el marcador especfico de la
enfermedad, la PrPSc in situ, existen tcnicas moleculares que permiten diferenciar la PrPSc
de la PrPC en muestras de tejido, basndose en la resistencia del prin frente a la accin de la
proteinasa K, en combinacin con la deteccin inmunolgica del ncleo resistente o PrP. Por
lo que los inmunoensayos son de gran importancia, debido a su mayor sensibilidad y
especificidad en los resultados, entre estos se encuentran: Inmunohistoqumica (prueba
estndar) o bien, para la realizacin de pruebas diagnsticas rpidas como Western Blot o
Inmunoensayo enzimtico (ELISA) (Faras 2013).
La inmunohistoqumica permite localizar componentes tisulares in situ mediante el uso de
anticuerpos especficos y molculas marcadoras para la deteccin de agregados de PrPSc. El
principio terico de la aplicacin de la Inmunohistoqumica en las muestras fijadas en

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formalina, consiste en la bsqueda de eptopes y utilizacin de anticuerpos elaborados
especficamente para priones (Cifuentes 2014; Garca 2006).
La electroinmunotransferencia (Western Blot) detecta la PrPSc inmunolgicamente desde
tejido medular (fresco o congelado) caracterizando la protena prinica patgena segn su
movilidad electrofortica y detectando sus bandas de glicosilacin y de peso molecular. Esto
se realiza mediante un tratamiento previo de las muestras con proteinasa K. Los extractos se
desnaturalizan con calor y Dodecil Sulfato de Sodio (SDS), para ser analizado por
electroforesis en gel de poliacrilamida. Posteriormente, la protena desnaturalizada se
transfiere a una membrana de nitrocelulosa para ser detectada con un anticuerpo marcado.
Mediante el Western blot y empleando tambin anticuerpos especficos se pueden detectar
las tres formas de glicosilacin (isotipos) de la PrPSc y con ello la tipificacin de cepas
prinicas (Cifuentes 2014; Garca 2006).
La tcnica de inmunoensayo enzimtico (ELISA) tambin detecta la PrPSc desde tejido fresco
o congelado. Las muestras se homogenizan y son sometidas a tratamiento previo con
Proteinasa K y luego son centrifugadas; el sobrenadante obtenido se diluye y posteriormente
se analiza. Se pueden utilizar distintos anticuerpos. La PrPSc es capturada en una microplaca
usando un anticuerpo anti-PrP o un ligando, adems de un segundo anticuerpo anti-PrP
asociado a un sistema de deteccin (Garca 2006).
Como el agente etiolgico de esta enfermedad corresponde a una protena infecciosa PrPSc,
este ser usado como marcador molecular y se utilizar para su deteccin las tcnicas de
inmunohistoqumica y ELISA por el grado de sensibilidad y especificidad que tienen.

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Justificacin:
La Organizacin Mundial de Sanidad Animal, indica que Scrapie posee una mayor incidencia
en pases europeos, entre los que se destacan Alemania, Blgica, Espaa, Finlandia, Reino
Unido e Irlanda. Los rebaos infectados con Scrapie provocan fuertes prdidas en la
produccin, lo cual afecta en la economa de los pases que lo presentan (Faras 2013). La
incidencia de Scrapie vara segn el pas y la raza de estas. La tasa de mortalidad en un rebao
afectado es de 3 a 5% puede llegar incluso hasta un 20% en rebaos gravemente afectados
(Vargas et al. 2001). En la actualidad, se sabe que la enfermedad puede transmitirse entre
especies cuanto mayor sea la similitud estructural entre los priones de ambas (Belay 2004).
La similitud entre los priones humano y ovinos ha permitido la transmisin de la enfermedad
al hombre a travs del consumo de la carne de animales infectados (Wilson et al. 2012). Por
ello, es muy necesario el estudio de esta condicin para desarrollar sistemas de deteccin que
sean eficaces para la protena prinica causante de Scrapie en ovinos y bovinos, as como
tambin la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Las tcnicas de diagnstico molecular
empleadas se basan en la deteccin del marcador PrPSc asociado a la enfermedad. De las
tcnicas moleculares anteriormente mencionadas se elegirn principalmente la tcnica
inmunohistoqumica debido a que es una prueba confirmatoria por su alta especificidad, a la
vez, se elegir ELISA ya que presenta una alta sensibilidad, lo cual es de suma importancia
en el presente trabajo (Faras et al. 2009).

Hiptesis:
Con las tcnicas ELISA e inmunohistoqumica es posible la deteccin confiable y eficaz de
la protena (PrPSc) causante de la enfermedad de Scrapie en ovinos y caprinos
principalmente.

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Metodologa:
Obtencin de las muestras.
Se usaron 50 muestras provenientes de 50 caprinos mayores a 2 aos, sin importar raza, sexo,
ni causa de muerte. Las muestras, se obtuvieron a travs del uso de tijeras de diseccin,
realizando el corte de los ltimos 5 cm del recto. Para iniciar con la tcnica se colocaron las
muestras en solucin de buffer de formalina al 10%, para su fijacin durante 1 semana.
Posteriormente a esto, se obtuvieron cortes de tamaos de 0,5-1 cm de distancia de la unin
mucocutnea rectal, dichos cortes fueron depositados en cassetes histolgicos para su
procesamiento, estos fueron sometidos a deshidratacin y aclaramiento por medio de un
procesador de tejidos automticos (Leica TP-1020).
Se obtuvieron cortes seriados de 5m de grosor y se montaron en portaobjetos. Se prosigui
con la tincin de Hematoxilina-Eosina (anlisis histopatolgico) y la tcnica
Inmunohistoqumica (Cifuentes 2014).

Tincin de Hematoxilina-Eosina.
Se coloc el primer corte de una de las muestras en un portaobjetos (Citoglas) cubierto con
una capa de albumina como medio adherente, este fue secado en estufa a 37 C por 30
minutos. Despus, los portaobjetos se mantuvieron a 60C por 30 min y se colocaron en una
estufa (Elconap B-1-P) a 37C durante toda la noche (Faras 2013).

Tabla 1. Criterios de seleccin de muestra en la tincin de Hematoxilina-Eosina para

realizar inmunohistoqumica (Faras 2013).
Apta: Muestra en donde por medio del microscopio se observaron al menos 4
folculos linfoides.
No apta: Cuando en la muestra se observaron menos de 4 folculos linfoides.

Inmunohistoqumica.
Se montaron los cortes en portaobjetos Probe On Plus. Fue necesario desparafinar y
rehidratar estos cortes con baos en xilol y alcoholes descendentes. Posteriormente, se
inhibi la actividad endgena de la peroxidasa presente en el tejido. Para ello, se mantuvieron
las muestras en agua oxigenada al 3%, con metanol absoluto durante 10 min. Despus, se

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sumergieron en agua Bidestilada y se incubaron en cido frmico al 98% durante 5 min a
temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron y se neutralizaron en solucin tampn Tris-
HCl (0,1 M, pH 7.6) durante 2 min.
Transcurrido este tiempo, las muestras se transfirieron a una solucin recuperadora de
antgenos pH 7,6 (Target Retrieval Solution) y se incubaron en autoclave durante 20 min a
120C. Las muestras fueron transferidas a una solucin de Tris Buffer Salino-Tween 20
(TBST) pH 7,6 durante 10 min y se agregaron 150 L de solucin de proteinasa K en cada
pocillo con dosificador (Isolon) y se incubaron nuevamente durante 90 segundos a
temperatura ambiente, seguido de esto se realizaron 3 lavados con TBST pH 7,6. Seguido de
esto, se agregaron 150 L del anticuerpo primario monoclonal F99/97.6.1 (dilucin 1:1000),
y se incubaron las muestras por 20 min a 37C, nuevamente se realizaron 3 lavados con TBST
pH 7,6.
Seguido de esto, se incubaron con 150 L del anticuerpo secundario policlonal anti-ratn
biotinilado por 15 min a 37C y se adicionaron 150 L de estreptavidina(HRP) y se
incubaron durante 10 min.
Se aplic el revelado de la reaccin inmunolgica mediante incubacin protegida de la luz
directa con 150 L de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), durante 5 min. Para finalizar, se
sometieron los portaobjetos a tincin de Hematoxilina de Mayer por 10 min para contrastar
con el tejido adyacente (Para poder visualizar mejor la reaccin) (Cifuentes 2014).

Tabla 2. Criterios de evaluacin de resultados de prueba inmunohistoqumica (Faras

2013).
Positivo: Cuando en uno o ms folculos se observ un precipitado granular
rojo.
Negativo: Cuando no se observ inmunotincin en el tejido siempre y cuando la
muestra haya presentado el mnimo de los 4 folculos linfoides.

Inmunoensayo enzimtico (ELISA).

Para la deteccin de protenas prinicas mediante inmunoensayo enzimtico, se utiliz un kit
comercial (TeSeE, Bio-Rad) el cual consta de dos pasos, la purificacin y concentracin de

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la protena prinica y la deteccin mediante inmunoensayo de captura en microplaca
(ELISA).
Purificacin.
Se obtuvieron 40 muestras de 350 mg de bex cerebral de caprinos mayores a 2 aos, sin
importar raza, sexo, ni causa de muerte. las muestras fueron sometidas a dos ciclos de
trituracin con agitacin por 45 segundos, entre cada trituracin se centrifugaron a 10.000 x
g por 1 minuto. Se realiz una calibracin por duplicado obteniendo 250 l de la solucin de
cada triturado, a esos se les aadi 250 l de proteinasa K ((20 l/ml) y fueron
homogeneizadas e incubadas durante 10 minutos a 37C, posterior a la incubacin, se
agregaron 250 l de solucin de precipitacin que contena azul de bromofenol y se
centrifugaron a 12.000 x g durante 7 minutos a 20C. Se elimin el sobrenadante y se aadi
a cada muestra 25 l de tampn de solubilizacin para despus ser incubadas por 5 minutos
a 100C (Faras 2013).
Deteccin.
Se usaron 80 pocillos de la microplaca para las 40 muestras purificadas y su duplicado. Cada
pocillo estaba recubierto con un anticuerpo monoclonal antiPrP. Para el control positivo se
utiliz un pptido sinttico no infeccioso en tampn PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 8,1
mM Na2 HPO4 ; 1,5 mM KH2 PO4 ; pH 7,4) y el negativo en base a PBS pH 7,4
suplementado con albmina srica bovina (BSA). Los controles fueron incubados a 37C por
75 minutos, las muestras purificadas se diluyeron con 125 l de tampn PBS pH 7.4
suplementado con BSA y rojo fenol, a continuacin, fueron depositados 100 l de cada
muestra y los controles en los pocillos de la microplaca. La microplaca fue lavada y se agreg
100 l de solucin de conjugado que contiene un anticuerpo monoclonal anti-PrP conjugado
con peroxidasa y se incub por 60 minutos a 4C, transcurrido el tiempo de incubacin se
realizaron cinco ciclos de lavado y se aadieron 100 l de solucin de revelado (cido ctrico
ms acetato de sodio pH 7,4, H2O2 al 0,015% y dimetilsulfxido 4% ms el cromgeno
Tetrametilbenzidina) (Faras 2013).

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Anlisis de resultados:
De los 100 cortes histolgicos analizados (dos cortes por cada recto, uno de 0.5 y 1 cm), 90
de estos resultaron ser aptos y 10 no lo fueron, lo cual representa un 90% y 10%,
respectivamente. Para los cortes a una distancia de 0.5 de la unin mucocutnea rectal, 45 de
50 resultaron aptos, lo que representa un 90% de aptitud para dicha distancia. Estos mismos
resultados se obtuvieron para los cortes a un centmetro de distancia (Tabla 3) (Cifuentes
2014).
Tabla 3. Clasificacin de muestras aptas y no aptas segn la tincin H&E en base a la
distancia de 0.5 cm y 1 cm de la unin mucocutnea rectal (Cifuentes 2014).
Distancia a unin mucocutnea rectal.
Aptitud de muestra: 0.5 cm. 1 cm. Total.
Apta: 45. 90%. 45. 90%. 90. 90.
No apta: 5. 10%. 5. 10%. 10. 10.
Total: 50. 100%. 50. 100%. 100. 100.

Aptitud de muestras

10%

Aptos
No aptos

90%

Grfica 1. Porcentaje de la aptitud de muestras de recto de caprinos (Cifuentes 2014).

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Imagen 1. Cortes histopatolgicos de recto de caprino. A. muestra apta con ms de 4 folculos
linfoides y B. muestra no apta carente de folculos linfoides (Cifuentes 2014).

Imagen 2. Cortes histopatolgicos de recto de caprino en estudio inmunohistoqumico. A. muestra

positiva en prueba inmunohistoqumica mostrndose el precipitado granular rojo indicando presencia
de priones y B. muestra negativa carente de priones, en donde no se observa el precipitado
caracterstico (Cifuentes 2014).

La inmunoreaccin se detect en un lector de ELISA (k = 450 nm) a travs de la medicin

de su densidad ptica (D.O.) (Faras et al. 2009). En base a los valores promedios de D.O.,
se valid la placa y se analizaron e interpretaron los resultados de las muestras, calificndolas
como positivas, negativas o sospechosas segn lo descrito por Bio-Rad. Las muestras fueron
analizadas de acuerdo al valor umbral (V.U.) calculado (Bio-Rad, 2003). As las positivas
fueron mayor o igual al V.U., las sospechosas correspondieron a las que se encontraron justo
debajo del V.U., tambin llamado valor lmite (V.U - 10%), y las negativas las menores a
dicho valor (Faras 2013).

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Para calcular el valor umbral se tom el promedio de las lecturas (D.O.) de los controles
negativos, ms una constante 0.210, resultando un valor de 0,22075. El valor lmite calculado
(V.U - 10%) fue de 0,198675 unidades de D.O (Faras 2013).
Se obtuvo que todos los controles positivos presentaron lecturas mayores o iguales a 1, y los
negativos menores o iguales a 0.0108, por lo que el total de las 40 muestras de bex de ovinos
y sus duplicados resultaron ser negativos a Scrapie (Tabla 4).

Tabla 4. Cuadro resumen resultados ELISA (Faras 2013).

Controles. Muestras analizadas. Total.
Positiva: 2. 0. 2.
Negativa: 4. 40. 44.
Sospechosa: 0. 0. 0.
Total: 6. 40. 46.

Discusin y conclusin:
El scrapie es una enfermedad neurodegenerativa de progresin lenta y de replicacin
silenciosa en el hospedador, lo que reduce la posibilidad de realizar una deteccin temprana
en los animales afectados. El diagnstico de la encefalopata espongiforme se basa en la
observacin de signos clnicos y la deteccin de alteraciones histopatolgicas en el SNC,
pero este ltimo solo puede realizarse post mortem. No existen pruebas rutinarias de
laboratorio para realizar el diagnstico en el animal infectado antes de la aparicin de los
sntomas.
La implementacin de tcnicas para el diagnstico temprano de scrapie es de suma
importancia debido a las prdidas econmicas que genera, as como tambin la transmisin
de la enfermedad de ovinos a humanos (Faras 2013; Wilson et al. 2012).
Para el diagnstico preclnico del scrapie se probaron dos tcnicas: inmunohistoqumica y
ELISA, ambas tcnicas estn basadas en la deteccin de la protena PrPSc asociada a la
enfermedad.
La deteccin con la prueba inmunohistoqumica se realiz con 50 muestras provenientes de
50 caprinos mayores a 2 aos, estas muestras con cortes de 0.5 cm y 1 cm de la unin
mucocutnea rectal fueron sometidas inicialmente a la tincin de Hematoxilina-Eosina, 45
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resultaron aptas debido a la presencia de al menos 4 folculos linfoides. Sin embargo, al
realizar la prueba inmunohistoqumica no se observ ningn precipitado granular rojo, por
lo que dichas muestras resultaron negativas a Scrapie (Cifuentes 2014). Esta tcnica es muy
especfica, ya que permite la observacin directa de los signos de la enfermedad,
especialmente lesiones espongiformes simtricas, sin embargo, la sensibilidad descrita para
ste mtodo es muy diversa y menos sensible que otras tcnicas (Grassi et al. 2008).
Para la deteccin mediante ELISA se utilizaron 40 muestras de bex cerebral de caprinos, el
anlisis se realiz por duplicado, tratando cada muestra como independiente. Del total de
muestras analizadas todas resultaron ser negativas para Scrapie. El porcentaje de
especificidad para esta tcnica fue de un 100%, lo cual concuerda con la literatura consultada
(Padilla 2004). La sensibilidad de la prueba no pudo ser calculada debido a que todas las
muestras analizadas resultaron negativas, pero se sabe que puede alcanzar una sensibilidad
del 100% (Grassi et al., 2008; Faras et al., 2009). La tcnica ELISA ofrece ventajas frente a
la inmunohistoqumica, puede utilizarse a gran escala y se realiza en un menor tiempo; y
aunque requiere de personal entrenado para el desarrollo de la prueba y la interpretacin de
resultados no es necesario contar con especialistas en la materia como en el caso de la
inmunohistoqumica, ya que no es suficiente con observar al microscopio la presencia del
inmunoprecipitado sino que debe buscarse un patrn caracterstico de la enfermedad, por lo
tanto se debe realizar por un mdico veterinario especializado. Otra de las ventajas que ofrece
ELISA es la obtencin de resultados cuantitativos y de fcil interpretacin debido a que se
trabaja en base a valores numricos y esto reduce la aparicin de falsos positivos o negativos.
La Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE) recomienda el uso de ELISA como
prueba de tamizaje, los casos positivos que resulten de esta prueba debern ser confirmados
o descartados con inmunohistoqumica.
Las tcnicas inmunohistoqumica y ELISA resultan ser confiables y eficaces para la
deteccin de la protena PrPSc causante de la enfermedad de Scrapie en ovinos y caprinos.
Sin embargo, cabe mencionar que la tcnica ELISA posee una mayor especificidad y
sensibilidad de las ventajas mencionadas anteriormente.
Un alineamiento in silico por medio del programa Bioedit de las secuencias aminoacdicas
de Ovis aries (ovino), Capra hircus (caprino), Bos Taurus (bovino) y Homo sapiens
(humano) determin que son muy pocas las mutaciones puntuales entre las secuencias. Por

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lo que el mtodo de diagnstico molecular, no slo sera til en ovejas y cabras, sino tambin
en la deteccin de encefalopatas espongiformes en otros organismos, tales como el toro e
incluso el ser humano gracias al alto grado de conservacin en las protenas prinicas.

Referencias:
Belay ED. 2004. Chronic Wasting Disease and Potential Transmission to Humans.
Journal EID 10:977-984.
Cifuentes L., B.P. 2014. Aplicacin de la inmunohistoqumica para detectar scrapie
en tejido linfoide en mucosa rectal de caprinos. Tesis. Univ. de Chile, Fac. Cien. Vet.
29 p.
Faras R., G.A. 2013. Diagnstico Preclnico de Scrapie mediante
Inmunohistoqumica. Tesis. Univ. de Crdoba, Fac. Cien. Vet. 8 p.
Faras G, Machuca A, Bravo C, Madariaga M, Jara C, Lecocq C. 2009. Utilizacin
de inmunorreacciones para la deteccin de Scrapie en bex de ovinos provenientes
de la XII Regin de Chile. Revista SciELO 46:127-132.
Garca C., D. 2006. Desarrollo de mtodos moleculares y su aplicacin al estudio de
la resistencia gentica y patogenia molecular del scrapie. Tesis. Univ. del Pas Vasco,
Fac. Cien. Agr. 38 p.
Grassi J, Maillet S, Simon S, Morel N. 2008. Progress and limits of TSE diagnostic
tools. Journal Veterinary research 39:1-12.
Mndez J., D. 1996. Priones y enfermedades neurodegenerativas. Tesis. Univ.
Autnoma de Mxico, Fac. Odont. 116 p.
Organizacin Mundial de Sanidad Animal. 2004. Manual of diagnostic test and
vaccines for Terrestrial Animals, [Online]. Disponible en:
http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-
online/
Padilla D., D.A. 2004. Deteccin de protenas prinicas en cerebros de bovino
mediante inmunoensayo enzimtico. Tesis. Univ. de Chile, Fac. Cien. Vet. 68 p.
Vargas AM, Salto R, Sola MM, Hortelano P. 2001. Encefalopatas espongiformes
transmisibles. Bases moleculares, diagnstico y perspectivas terapeticas. Revista
Ars Pharmaceutica 42:520.

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 Wilson R, Plinston C, Hunter N, Casalone C, Corona C, Tagliavini F, Barron R. 2012.
Communication Chronic wasting disease and atypical forms of bovine spongiform
encephalopathy and scrapie are not transmissible to mice expressing wild-type levels
of human prion protein. Journal of General Virology 93:16241629.

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