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Primera seccin
Utilizar una pipeta estril para adicionar 600 L de agua estril directamente en el vial
para rehidratar el antibitico, realizando una solucin de 50 mg/mL
Las bacterias previamente liofilizadas de E. coli BL21 (DE3) que contienen el plsmido
DHRF, debern ser rehidratadas con 250 L de medio LB broth directamente en el vial
y dejar rehidratar por lo menos 10 min y almacenar a 4 C hasta su uso.
Segunda seccin
Adicionar 500 L de ampicilina a una concentracin de 50 mg/mL al resto del medio del
paso 3 para obtener el medio LB/ampicilina broth y almacenar a 4 C hasta su uso.
Tercera seccin
Materiales de avance para el subcultivo e induccin de la expresin de DHRF
12. Alicuotar 25 L de 100 mM IPTG en tubos epppendorf de 2 mL. Un tubo por equipo.
Ingeniera Celular y Metablica
1. Preparacin de 2x PBS
2. Preparacin de la lisozima
Quinta seccin
Separacin de la fraccin soluble e insoluble de los cultivos inducidos y
preparacin de las muestras para el SDS-PAGE
5. Las clulas lisadas podrn almacenarse a -20 C hasta su uso. Antes de iniciar a
trabajar con ellas, las muestras debern ser descongeladas a temperatura ambiente.
Sexta seccin
Materiales de avance para la preparacin de afinidad cromatgrafica
Ingeniera Celular y Metablica
Pagina 66 mat/equipo
Para preparar 5 L del amortiguador,mezclar 500 ml de 10x TGS con 4.5 l de gua
destilada y alcenar a temperatura ambiente.
Los integrantes de cada equipo debern plaquear la cepa de E. coli BL21 (DE3), en cada
una de las cajas que contienen nicamente el medio LB/amp agar, utilizando un ngulos
de 45 para rastrillar y ganar una mayor superficie en el medio, como se muestra en la
siguiente figura.
Posteriormente, colocar las cajas en una incubadora a 37C toda la noche, o a temperatura
ambiente durante 2-3 das.
Las mejores colonias de E. coli (de 1-2) con 1 mm de dimetro debern ser seleccionadas
y almacendas en una bolsa sellada a 4 C hasta su uso.
1. Alicuotar 100 L del cultivo de toda la noche en un tubo de 1.5 mL, etiquetar el tubo
con -induccin y marcar con el nombre del equipo.
2. Centrifugar el tubo a 16,000 x g por 2 min.
3. Descartar el sobrenadante sin tocar el pellet.
4. Adicionar 100 L del amortiguador de Laemli al pellet y resuspender por pipeteo.
5. Calentar el tubo a 95 C por 5 min.
6. Marcar esta muestra con el nombre del equipo y almacenar a -20 C hasta su uso para
el SDS-PAGE.
1. Preparar una dilucin 1:10 del cultivo, mezclando 900 L de LB/amp broth con
100 L del cultivo de toda la noche en un tubo y agitar muy bien por inversin.
2. Leer la obsorvancia a 600 nm. Utilizar como blanco 1 ml de LB/amp broth.
X mL del cultivo toda la noche= 11 mL x 0.3/ OD600 del cultivo toda la noche
1. Calcular la cantidad del cultivo de toda la noche que podran necesitar para
preparar un subcultivo con OD600 de 0.3 y registrar el valor:
4. Agitar el cultivo de toda la noche para resuspender todas las clulas y adicionar el
volumen calculado en el paso 1 hacia el tubo de 50 mL con LB/amp broth.
5. Incubar las bacterias en una incubadora con agitacin a 37 C durante 1 hora.
6. Registrar el tiempo de inicio del cultivo:____________________
7. Registrar el tiempo en que se detuvo el cultivo:____________________
1. Alicuotar 100 L del cultivo de toda la noche en un tubo de 1.5 mL, etiquetar el
tubo con + induccin y marcar el tubo con el nombre del equipo.
2. Centrifugar el tubo a 16,000 x g por 2 min.
3. Descartar el sobrenadante sin tocar el pellet.
4. Adicionar 100 L del amortiguador de Laemli al pellet y resuspender por pipeteo.
5. Calentar el tubo a 95 C por 5 min.
6. Marcar esta muestra con el nombre del equipo y almacenar a -20 C hasta su uso
para el SDS-PAGE.
1. Asegurarse que el volumen de las muestras se encuentre igual entre todos los
estudiantes, si no es as completar con agua.
2. Separar la fraccin soluble e insoluble del lisado celular por centrifugacin a
16,000 x g por 20 min.
3. Verter cuidadosamente el sobrenandante de las clulas lisadas en tubo nuevo
y marcar como fraccin soluble y el nombre del equipo.
4. Remarcar el tubo de las cluas lisadas con fraccin insoluble.
5. Adicionar 1 mL de amortiguador de lisis 2 en la fraccin insoluble y
resuspender el pellet utilizando una jeringa de 3 mL.
6. Remover 50 L de la fraccin soluble y colocarlo en un tubo limpio de 1.5
mL y marcar como Soluble PAGE. Adicionar 50 L de amortiguador Laemli
y agitar fuertemente.
7. Remover 50 L de la fraccin insoluble y colocarlo en un tubo limpio de 1.5
mL y marcar como Insoluble PAGE. Adicionar 50 L de amortiguador
Laemli y agitar fuertemente.
8. Calentar ambas muestras a 95 C por 5 minutos y almacenar a -20 C hasta su
anlisis por SDS PAGE.
Ingeniera Celular y Metablica
Lavado de la columna
1. Recalentar las muestras SDS PAGE a 95 C por 5 min y centrifugar por 2 min a
1600 x g.
2. Colocar los geles y ensamblar el equipo.
3. Cargar los geles utilizando una punta limpia cada vez cargando los siguientes
volmenes de cada muestra como sigue: