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Chapitre IV : Analyse des protines dans les aliments

Limportance nutritionnelle et technologique des protines dans les produits agricoles et


alimentaires fait que leur analyse est trs ralise aussi bien dans les laboratoires de recherche
que dans ceux du contrle.

I-Dosage des protines par dtermination de lazote (mthode indirecte) :

Dans un produit biologique (lait, srum...) lazote peut se trouver sous forme minrale et
organique (protines, phospho-amino-lipides...) ; pour le doser dans sa totalit, il faut dtruire
les composs organiques de manire obtenir tout l'azote sous une mme forme minrale. On
effectue pour cela une minralisation. L'azote est ensuite dos par dosage acide-base.

Mthode de Kjeldahl.

L'analyse des protines dans les denres alimentaires consiste doser l'azote total selon la
mthode de Kjeldahl et multiplier la teneur en azote par un facteur conventionnel.

Principe :
La matire organique est dtruite par oxydation, sous l'effet combin de l'acide sulfurique et
de catalyseurs. Dans ces conditions l'azote contenu dans laliment est transform en sel
d'ammonium. L'ammoniac libr de ce sel en milieu basique est entran par distillation et
recueilli dans une solution acide.
- La teneur en protines est obtenue par multiplication de la teneur en azote trouve par un
facteur de conversion (qui correspond l'inverse de la teneur en azote dans la protine).
Comme la teneur en azote est variable (en fonction des acides amins prsents et de leurs
proportions), un facteur de conversion diffrent devrait tre utilis pour chaque sorte de
protines.
Ce facteur est appel coefficient de digestibilit , selon lorigine de laliment, on a :

Protines vgtales : % N * 5,7.


Protines animales : % N * 6,25.

1. Minralisation
La minralisation est effectue l'aide d'un excs d'acide sulfurique concentr et chaud, en
prsence d'un mlange de catalyseurs (K2SO4 et CuSO4).
En prsence d'acide sulfurique concentr et chaud, le carbone, l'oxygne, l'hydrogne et
l'azote des composs organiques se retrouvent sous forme de CO2, H2O et NH3. L'acide
sulfurique tant en excs, on a :

2 NH3 + H2SO4 2 NH4 + + SO4 -2

L'azote total est donc obtenu sous la forme minrale NH4 + (ions ammonium).

Au cours de la minralisation, l'acide sulfurique est partiellement dcompos et rduit en


SO2 et SO3 qui forment des fumes blanches irritantes et toxiques.
L'utilisation d'un mlange de catalyseurs permet d'avoir une minralisation plus rapide.

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- K2SO4 permet d'lever la temprature d'bullition de l'acide sulfurique 350-400 C ; on
peut ainsi effectuer la minralisation ces tempratures sans avoir de pertes trop importantes
d'acide sous forme de vapeurs ;
- CuSO4 est le catalyseur de minralisation proprement dit : il augmente la vitesse de la
minralisation.

2. Distillation ou dosage de lazote total


Aprs minralisation, l'azote se trouve dans le minralisat sous forme de NH4+. Le dosage de
l'azote total est un dosage acide-base (titrage). Les ions ammonium du minralisat se trouvant
dans un excs d'acide sulfurique, on ne peut les doser directement. Dans un premier temps on
va dplacer les ions ammonium du minralisat sous forme de NH3 (ammoniac), puis il faudra
rcuprer l'ammoniac seul pour pouvoir le doser l'aide d'une solution talonne d'acide fort.

Pour isoler l'ammoniac on procde par distillation.

2.1. Dplacement de NH4+ en NH3


Pour transformer les ions ammonium du minralisat en ammoniac, on doit alcaliniser le
minralisat, pour cela on utilise un large excs de base forte : la lessive de soude (NaOH).
Le minralisat est ainsi tout d'abord neutralis puis alcalinis. On a alors :

NH4 + + OH- NH3 + H2O

La lessive de soude tant en excs, tous les ions ammonium sont transforms en ammoniac et
donc tout l'azote se retrouve sous forme de NH3.

2.2. Isolement de l'ammoniac


Il est ralis par distillation : on chauffe le minralisat alcalinis, le NH3 se dgage sous
forme de vapeurs que l'on capte, que l'on condense et que l'on recueille pour le dosage.
2.3. Dosage de l'ammoniac
On peut procder par dosage direct ou par dosage en retour.

2.3.1. Dosage direct


L'ammoniac est recueilli dans une solution d'acide borique (H3BO3). L'acide borique est un
acide faible qui ne ragit pas avec l'ammoniac, il sert simplement de pige ammoniac. (Il
doit tre en excs par rapport l'ammoniac).
L'ammoniac ainsi pig est neutralis au fur et mesure de son arrive par une solution
talonne d'acide fort (Hcl ou H2SO4) en prsence d'un indicateur color : l'indicateur de
Tashiro ou indicateur RB (mlange de rouge de mthyle et de bleu de mthylne) amen au
pralable sa teinte sensible (gris sale). On a:

NH3 + H+ NH4+

(Lorsque l'ammoniac arrive dans l'acide borique il alcalinise le milieu qui vire au vert, on
verse alors la solution talonne dacide fort pour ramener l'indicateur sa teinte).

2.3.2. Dosage indirect


L'ammoniac est recueilli dans un volume connu et en excs d'une solution talon d'acide fort
(Hcl ou H2SO4). L'excs d'acide est ensuite dos l'aide d'une solution talonne de base
forte, en prsence d'un indicateur color.

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On a :

NH3 + H+ NH4+ ensuite H+ + OH- H2O

Il existe dautres mthodes de dosage des protines, mais cest la mthode de Kjeldahl qui est
la plus utilise, cest la mthode de rfrence. On cite parmi elles :

Inconvnient :

La dure est longue (60-180mn), cest d au temps ncessaire la digestion de lchantillon.

Actuellement, on a conu un appareil appel : Kjelfoss qui utilise les oprations de la


mthode de Kjeldahl programmes de faon automatique, le premier rsultat est obtenu 12 mn
aprs lintroduction de lchantillon et les rsultats suivants sont obtenus toutes les 3 mn.

Autres mthodes

Il existe dautres mesures et analyses qui se font sur les protines, dont :

Dosage par colorimtrie.


Dosage par pyrolyse.
Dosage par la mthode de Buiret : Dveloppement dune coloration pourpre du
complexe : ions cuivriques-liaisons peptidiques en milieu alcalin .
Dosage par la mthode de Lowry : Mme principe, avec utilisation des acides
phospho molybdiques et phospho tungstiques et formation de coloration bleue.
On utilise aussi des mthodes physiques, comme la spectrophotomtrie, la
fluoromtrie, la rflexion IR

Dtermination de la valeur qualitative des protines

La qualit des protines est dtermine en fonction de leur digestibilit et de leur valeur
biologique, elle peut tre modifie par des traitements technologiques. On utilise beaucoup de
techniques :

Mesures chimiques : on dtermine la composition en acides amins et la teneur en aa


essentiels comme la mthionine, la cystine, le tryptophane,
Mesures enzymatiques : par des systmes de digestion enzymatique in vitro.
Mthodes microbiologiques : par utilisation de certains microorganismes pour le
dosage daa limitant.

Mesures biologiques de la qualit protique

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Ce sont des essais qui se font sur des animaux de laboratoire pour mesurer la qualit des
protines consommes.

Mthodes de bilans (entre et sortie) permettant de faire la distinction entre la valeur


biologique et la digestibilit.
Mthodes de croissance qui fournissent un renseignement global sur la qualit des
protines.

Ces mthodes sont longues et demandent des locaux (laboratoire, matriel, ), on les
applique titre exprimental.

Les rsultats :

Digestibilit protique = N absorb/N ingr.


Valeur biologique relle des protines = N retenu/N absorb.
Coefficient de digestibilit protique= N retenu/ N ingr.

Chapitre V : Analyse des minraux dans les aliments

Les sels minraux sont essentiels l'organisme, notamment parce qu'ils :


- contrlent l'quilibre hydrique (pression osmotique).
- rglent l'quilibre acide-base (pH).
- font partie de certaines structures (os, dents).
- entrent dans la composition des enzymes, des hormones.
- catalysent de nombreuses ractions du mtabolisme.

Les lments minraux quon retrouve dans les aliments sont de deux classes : les lments
majeurs (macro lments) et les oligolments (micro lments).

Selon les quantits mises en jeu dans l'organisme, ils sont diviss en 2 groupes :
- les lments principaux ou macrolments : Ca, P, K, Cl, Na, Mg
- les lments traces ou oligolments : Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, F, Si, Se, etc.
-Il existe aussi les oligolments toxiques : (mtaux lourds), par rapport leur masse molaire
qui est grande, ex : le pb : 207 g.

Les mtaux lourds sont un ensemble de corps de masse atomique relativement leve qui
peuvent tre toxiques mme trs faibles teneurs (plomb, mercure,), ils provoquent le
risque dun effet cumulatif par ingestion rpte de laliment ou par augmentation continue du
niveau de pollution en un lment.

Les plus surveills habituellement dans les aliments sont : larsenic, lantimoine, le plomb, le
mercure, le cadmium, le chrome, le nickel, et ltain.

Le dosage des minraux dans les aliments rpond une double proccupation :

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-Dune part, la connaissance de la valeur nutritionnelle de laliment quil sagisse des
lments majeurs ou des oligo lments .

-Dautre part, de vrifier si laliment contient certains minraux en quantit dangereuse pour
la sant du consommateur qui ils soient prsents naturellement dans laliment ou dus une
pollution. Cest ce dernier souci qui est en gnral le but de la recherche des mtaux lourds.

Ainsi le dosage des minraux dans les aliments se fait :

sur des lments qui se trouvent en quantit notable et ne ncessitent pas une
recherche dune grande sensibilit comme le phosphore, le calcium, le magnsium,
sur des traces.

Le choix de la mthode donc, dpend de la concentration des lments minraux.

Le problme de la prsence des matires organiques :

Le facteur qui constitue un obstacle pour lanalyse des lments minraux dans les aliments,
est la prsence de la matire organique, seule leau en est dpourvue, donc il faut dtruire
cette matire.

La destruction de la MO peut tre une cause importante de contamination et de pertes, il est


essentiel de la conduire avec prudence pour viter ces deux importants facteurs derreur
particulirement pour le dosage des lments traces. Et ceci par minralisation par
calcination ou incinration.

Parfois les contaminations proviennent et sajoutent aux quantits de minraux qui existent
dans laliment, les causes sont multiples : les broyeurs, les rcipients, les ractifs, les
poussires,donc des prcautions doivent tre prises concernant :

La nature et la propret des rcipients.


La puret des ractifs.
Latmosphre des lieux de travail.
La propret des fours.
La propret des appareils de dosage.

Mthodes de minralisation :

Le choix de la mthode dpend de :

-La nature du produit analyser : certains aliments qui font lobjet dune grande prise
dessai sont difficiles incinrer ou minraliser (aliments trs gras).

-Limportance des risques de pertes : elle est lie la teneur de llment doser, elle est
trs grande lorsquil sagit de faibles traces, dans ce cas on vite lincinration qui se fait
seulement dans le dosage des lments majeurs.

-Limportance des risques de contamination : cest li la quantit des ractifs utiliss


pour la minralisation.
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-Le prix de revient : les responsables des laboratoires recherchent les mthodes qui
demandent le moindre temps de travail donc le moindre cot.

1-Dosage des matires minrales totales (ou cendres) par incinration

La teneur en cendres d'un aliment s'obtient par incinration (ou combustion complte) dans un
four 550 - 800C. Laliment est mis dans ce four jusqu destruction de toute particule
charbonneuse. L'adjonction de ractifs chimiques peut faciliter ou acclrer la combustion.

Il faut prendre quelques prcautions :

-Monte progressive de la temprature du four.

-Bonne circulation dair, pour viter la formation de charbon, dur faire disparaitre par la
suite.

-Eviter les tempratures trop leves. Dans un four bien conu, la minralisation peut tre
ralise entre 400 et 450C.

-Utiliser des rcipients en bon tat.

Ce procd peut tre appuy par laction dagents oxydants : acide nitrique, nitrate
dammonium ou de magnsium, ils aident dtruire les dernires traces des particules
charbonneuses.

On peut aussi ajouter des substances raction alcaline (MgO, MgNO3, KOH ).

Une fois les cendres de laliment obtenu, on les fait passer en solution.

Toutefois, la teneur en cendres ne correspond pas exactement la teneur en matires


minrales de la denre (pertes de substances par volatilisation ou augmentation sensible de
poids par formation de carbonates ou d'oxydes).

Exemples :
Bl : matires minrales 2.16 % cendres 1.90 % pertes de S, Cl, ...
Lait : matires minrales 0.69 % cendres 0.80 % augmentation due la formation de
carbonates
Pommes : cendres 0,25 % idem lait

Les cendres insolubles dans l'acide chlorhydrique sont principalement constitues de silice et
silicates. Ce rsidu aussi appel "sable" est assimil de la terre et autres impurets d'origine
minrale. Sa teneur est un indice de puret de certaines denres (pices, caf, cacao...)

2-Dosage spar des lments minraux


Le dosage d'lments tels que Na, Mg, Fe, I... sert plutt l'apprciation de certains aliments
dittiques (denres pauvres ou sans sodium, denres avec supplmentation en oligolments,
produits pour nourrissons...) ou la recherche de falsification (par exemple : dosage de K et P
dans les jus de fruits [dilution]).

Ces dosages sont effectus par les mthodes classiques de la chimie analytique
(Gravimtrie pour P, S, Cl, Si ..., titrimtrie pour S, Cl, Ca, Mg ..., colorimtrie pour P, Cl, Si,
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Fe) ou par absorption atomique (Na, K, Fe ...), en gnral aprs minralisation.

Exemples :

- dosage de Na et K par photomtrie de flamme


- dosage de Ca et Mg ou du fer, par spectrophotomtrie d'absorption atomique
- dosage du chlorure par titrimtrie selon Mohr ou Vollard ou par potentiomtrie
- dosage du phosphore par colorimtrie :
La teneur en phosphate est mesure sur la base de la teneur en bleu de molybdne ( 720 nm),
obtenu par raction avec du molybdate d'ammonium et rduction (par l'acide ascorbique par
exemple).

Mthodes de dosage :
Mthodes chimiques classiques :

La gravimtrie : cette mthode tait la plus pratique, son principe se base sur la sparation,
la filtration, le lavage et la fin la pese. (Pour beaucoup de minraux).

La titrimtrie : on obtient un volume par titrage (chlore).

La fluorimtrie : on utilise les proprits de fluorescence de certains composs forms par


des substances organiques avec les minraux (Hcl, HBr).

Les mthodes physiques :

Spectromtrie dmission :

On utilise le principe des rayonnements caractristiques produits et mis par des atomes
excits par llvation de la temprature. On emploie des appareils dots dquipements qui
permettent lexcitation des lments minraux : torches plasma .

Spectromtrie dabsorption atomique :

Elle se base sur le principe suivant : des atomes neutres excits (dans une flamme) absorbent
lnergie extrieure apporte par des photons. La mesure de la diminution de cette nergie
permet de mesurer la quantit dlments minraux rencontrs par le faisceau de photons.

La polarographie :

Principe se basant sur la polarit en utilisant deux lectrodes, lune polarisable et lautre non
polarisable qui donne un potentiel et une intensit quon dose elle-mme pouvant donner une
ide sur la teneur en minraux.

Electrodes spcifiques :

Le principe se base sur la diffrence de potentiel qui stablit entre une lectrode ionique
spcifique et une lectrode de rfrence est fonction de lactivit des ions contenus dans les
minraux.

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Chapitre VI : Analyse des vitamines dans les denres alimentaires

Une vitamine est une substance organique qui est la fois ncessaire au mtabolisme de
lorganisme vivant et qui ne peut tre synthtise en quantits suffisantes et dont labsence
dans la ration alimentaire a pour consquence moyen et long terme le dveloppement de
maladies de carence.

Les plantes et les microorganismes peuvent synthtiser les vitamines dont ils ont besoin.

Certaines vitamines sont synthtises indirectement dans lorganisme humain.

Il existe deux types de vitamines : celles qui sont hydrosolubles, cest--dire elles se
solubilisent dans leau et dautres qui sont insolubles dans leau et sont appeles vitamines
liposolubles.

On compte 13 vitamines, chaque vitamine possde un nom commun, un nom chimique et des
formes vitaminiques actives dans lorganisme.

Nom commun Nom chimique

Vitamine A Rtinol

Vitamine D Cholcalcifrol et ergocalcifrol

Vitamine E tocophrol

Vitamine K Phyllo quinone, mnaquinone

Vitamine B1 thiamine

Vitamine B3 (PP) Acide nicotinique

Vitamine B5 Acide pantothnique

Vitamine B6 Pyridoxal

Vitamine B 8 biotine

Vitamine B 9 Acide folique

Vitamine B 12 cobalamine

Vitamine C Acide ascorbique

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Quelques vitamines et leur importance :

-La vitamine A : elle est prsente sous forme desters de rtinol dans certains aliments (foie,
lait, beurre, ufs) mais galement sous forme de prcurseurs (carotnodes) dans les lgumes
et les fruits colors. Ces prcurseurs sont transforms en vitamine A lors de leur absorption
intestinale.

-La vitamine D : dont les 2 principales formes sont la vitamine D2 (ergocalcifrol) dorigine
vgtale et la vitamine D3 (cholcalcifrol) dorigine animale, est une vitamine qui est en trs
faible quantit dans lalimentation humaine. La source essentielle dans lorganisme rsulte en
fait de la transformation dans les couches profondes de la peau sous laction des rayons UV
du soleil dun prcurseur : le 7 dshydro cholestrol. Ce dernier peut tre apport par
lalimentation mais pour lessentiel il est synthtis par le cholestrol.

-La vitamine K et certaines vitamines du groupe D : elles peuvent tre synthtises dans le
colon par la flore intestinale.

-La vitamine PP (niacine) : elle a une double origine : alimentaire et endogne, dans ce
dernier cas elle rsulte de la transformation par une srie de ractions enzymatiques dun
acide amin : le tryptophane.

Dosage des vitamines :

Le dosage des vitamines dans les aliments reste malgr les amliorations rcentes un travail
difficile dont lexprience et le savoir-faire sont ncessaires.

Pour le dosage des vitamines liposolubles, on utilise les techniques : lHPLC et la CPG.
Pour les vitamines hydrosolubles, les mthodes de dosage par voie microbiologiques et pour
certaines vitamines on utilise la colorimtrie et actuellement lHPLC.

Les vitamines doivent tre dabord extraites avant quelles soient doses.

1-Principe dextraction des vitamines :

Extraction des vitamines liposolubles : Elles sont extraites sparment.

La Vitamine A : est extraite par la soude, lther thylique et lther de ptrole.

La Vitamine D et K : par la potasse et lther de ptrole.

La Vitamine E : par des solutions mthanoliques dacide ascorbique et lther thylique.

Extraction des vitamines hydrosolubles :

La thiamine B1 : par voie enzymatique avec lamylase ou la diastase de malt.

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La riboflavine B2 : par Hcl ou voie enzymatique.

La Vitamine PP : Hcl.

La Vitamine B6 : Hcl et acide sulfurique.

Lacide pantothnique : par la phosphatase.

2-Techniques de dosage :

La plupart des vitamines sont sensibles la lumire et certaines soxydent rapidement, il faut
donc viter une lumire directe ou intense.

La meilleure lumire artificielle est fournie par des tubes fluorescents, dans certains cas on
utilise une verrerie ambre. Les traitements la chaleur sont viter.

Les mthodes d'analyse mises en jeu sont soit des mthodes chimiques et physicochimiques
soit des mthodes microbiologiques et biologiques :

1. Mthodes chimiques et physico- chimiques :


- par colorimtrie ou photomtrie : vitamine A, -carotne...
- par fluorimtrie : B1, B2...
- par HPLC
Presque toutes les vitamines peuvent tre analyses par HPLC, un exemple classique est la
sparation des tocophrols (vit. E) d'une huile de germe de bl.

2. Mthodes microbiologiques
Un microorganisme dont le mtabolisme et la croissance dpendent de la prsence et de la
concentration de la vitamine recherche est mis en prsence d'un extrait de la denre
examiner. L'intensit du rendement mtabolique ou de la croissance est mesure (titrimtrie,
gravimtrie ou autre) et compare avec celle obtenue partir dune srie de standards de
concentrations diffrentes.
Ce sont des mthodes trs sensibles et trs spcifiques, principalement utilises pour les
vitamines du groupe B.
Exemples :
vit. B2 avec Lactobacillus casei par titrage du lactate form, vit. B6 avec
Neurospora sitophila par mesure par gravimtrie du myclium.

3. Mthodes biologiques

Ces mthodes de tests sur animaux ne sont plus actuellement utilises que pour les
vitamines difficilement extractibles comme celles du groupe D.
Dans ce cas, on donne des rats rachitiques des doses diffrentes de la prparation tester et
on observe l'effet sur la sant des rats (mesure par rayons X des piphyses du tibia), test qui
ncessite beaucoup de temps (plusieurs semaines) et d'animaux, et qui, de plus, est peu prcis.
Maintenant la HPLC a largement remplac ce type de test.

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Dosages particuliers

- Dosage de lalcool : par distillation et densitomtrie (au moyen dun frquence-mtre).

- Dosage de lacide actique : par distillation et titration acide-base.

- Dosage des sucres-alcool (polyols) : par HPLC.

- Calcul de la valeur nergtique des denres alimentaires

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