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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
Bacteriloga
1
NOTA DE ADVERTENCIA
2
VALIDACIN DE UNA TCNICA INMUNOCROMATOGRFICA PARA LA
APROBADO
3
VALIDACIN DE UNA TCNICA INMUNOCROMATOGRFICA PARA LA
APROBADO
4
Dedicatoria
Dedicamos este trabajo a todas las personas que hacen parte de nuestras
familias, en especial, a nuestros abuelitos, que aunque ya no se encuentran
con nosotras fueron pieza fundamental en nuestra formacin personal y
profesional. Todos ellos han sido los que nos han apoyado, animado y
orientado ante las dificultades que se nos han presentado, no solo en la
elaboracin de este trabajo, sino tambin en todo el camino de nuestra vida y
carrera.
Por esto, de todo corazn les decimos a ustedes, queridas familias, que este
gran triunfo no es solo nuestro, sino que tambin les pertenece a ustedes.
5
Agradecimientos
6
Tabla de Contenido
Resumen ..................................................................................................... 9
Palabras clave ........................................................................................... 11
Introduccin ............................................................................................... 15
Planteamiento del problema y Justificacin............................................... 18
Objetivo General........................................................................................ 20
Objetivos Especficos ................................................................................ 20
Importancia Forense.................................................................................. 21
Marco Terico............................................................................................ 22
Metodologa............................................................................................... 34
Obtencin de las muestras .................................................................... 35
Realizacin de las manchas .................................................................. 39
Tratamientos .......................................................................................... 41
Soportes................................................................................................. 43
Secado de las manchas y escobillones ................................................. 44
Rotulacin .............................................................................................. 44
Determinacin de sangre humana con el Kit Rapid Signal - Occult Blood
............................................................................................................... 45
Evaluacin del lmite de deteccin. ........................................................ 46
Establecimiento de los parmetros estadsticos .................................... 47
Repetibilidad .......................................................................................... 49
Resultados................................................................................................. 51
Discusin de resultados............................................................................. 87
Determinacin del lmite de deteccin ................................................... 87
Determinacin de la Especificidad del Kit .............................................. 89
Sensibilidad:........................................................................................... 90
Repetibilidad .......................................................................................... 91
Tratamientos .......................................................................................... 92
Soportes utilizados................................................................................. 94
7
Antigedad............................................................................................. 97
Soportes sometidos a polvo negro revelador y ester de cianoacriolato . 97
Comparacin del kit Rapid Signal Occult Blood Cassette de la casa
comercial Orgenics con el kit de ABAcard Hema Trace de Abacus
Diagnostics, para una nica muestra de sangre humana ..................... 98
Conclusiones ........................................................................................... 100
Recomendaciones ................................................................................... 102
Bibliografa............................................................................................... 103
Anexo 1 ................................................................................................... 106
8
Resumen
9
Por otra parte, una de las treinta y seis muestras de los sujetos participantes
del estudio, escogida al azar, se dispuso sobre tela paal y as, fue expuesta
a diferentes tratamientos: contacto con hipoclorito a concentracin de 5,6 %
m/v, y con tierra a profundidad de 50 centmetros sometida a condiciones de
lluvia, exposicin a cambios ambientales, a polvo negro revelador y a ester
de cianoacriolato (estos dos ltimos utilizados en el Laboratorio de
Dactiloscopia).
10
Palabras clave
1
Castro, M., Gascn, S., Pujol M.. 1996. Validacin de mtodos analticos. A.E.F.I. Seccin
catalana. Madrid.
11
Inmunocromatografa: La cromatografa es la separacin de los componentes
de una mezcla y su posterior deteccin. En la inmunocromatografa la
columna presenta unida a su superficie un ligando, una molcula ante la que
tiene afinidad una o ms de las protenas presentes en la mezcla a separar.
Al atravesar la columna el ligando secuestra la protena afn, y deja pasar el
resto. La naturaleza del ligando son anticuerpos que retienen en la columna a
aquellas protenas que contienen los eptopos que reconocen.
Figura 1. Inmunocromatografa
12
Precisin: Es el grado de concordancia de los resultados de la prueba,
cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiples tomas de una muestra
homognea. (Solo aplica para variables cuantitativas).
13
concentracin que da el 1 % de absorcin en la espectroscopa de absorcin
atmica, y a la relacin entre los valores positivos encontrados y los
autnticos valores positivos conocidos en ensayos inmunolgicos y
microbiolgicos. Deben desaconsejarse tales aplicaciones indebidas del
trmino en la qumica analtica.
14
Introduccin
2
. Gisbert Calaburg, JA. Medicina legal y toxicologa. Captulo XIV por Villanueva C. E..
Ediciones cientficas y tcnicas S.A. Reimpresin de la cuarta edicin de 1991.
15
Para obtener un resultado confiable al realizar el anlisis a estas manchas de
sangre, es necesario contar con tcnicas validadas, si esto no se lleva a
cabo, podran generarse grandes perjuicios, no solo a los sujetos procesales,
sino a la institucin y al profesional encargado.
16
Siendo la hemoglobina, el antgeno, insensible a una variedad de agentes
ambientales excepto a la exposicin a ciertos detergentes y blanqueadores
domsticos, es importante determinar hasta qu punto estos agentes pueden
afectar la determinacin de la misma, por tal motivo, el kit evaluado puede
ser utilizado en circunstancias en las cuales la hemoglobina, se encuentre
envejecida y/o degradada, requiriendo un mnimo de equipos, y generando
resultados que son sencillos de interpretar.
Por otra parte, cabe anotar que el nmero de muestras para anlisis de
inmunohematologa en los laboratorios de Biologa Forense es por lo general
elevado, en virtud a que muchas veces se analizan varias evidencias con
bastantes manchas de sangre; por lo tanto, la cantidad de pruebas
empleadas tambin lo es, ya que se utiliza un cassette por mancha, siendo
as que el costo por anlisis se eleva en forma apreciable. De all la
importancia de emplear un kit que adems de su buen desempeo, sea
econmico y de fcil aplicacin, aunque el envase donde se encuentra el
buffer de extraccin de ste no es el apropiado, ya que debido a su
estructura, dificulta ligeramente la inmersin de la muestra en el ya
mencionado buffer.
17
Planteamiento del problema y Justificacin
18
ORGENICS, el cual cuenta con caractersticas importantes, tales como ser
econmico y de rpida ejecucin. Esta tcnica presenta un mayor porcentaje
de especificidad, sensibilidad y repetibilidad frente a la utilizada actualmente
en el laboratorio de biologa del Instituto Nacional de Medicina Legal y
Ciencias Forenses - Regional Bogot.
19
Objetivo General
Objetivos Especficos
20
la mancha de sangre, siendo estas las siguientes: manchas de extractos
vegetales tales como: rbano, remolacha, cscara de pltano verde, y
productos farmacuticos como el isodine.
Importancia Forense
Esta validacin permitir contar con otro insumo que aportar la informacin
necesaria (especificidad, sensibilidad, repetibilidad, etc.) para la
determinacin de sangre humana en muestras de inters forense, de manera
gil, acertada y econmica, con la utilizacin del kit RapidSignal Occult
Blood Cassette de la firma ORGENICS.
21
Marco Terico
22
aglutinan cuando se les adiciona suero antiglobulina o suero de Coombs. Si
este anticuerpo se pone previamente en contacto con una protena humana
agotar su capacidad de reaccin y al adicionarlo al sistema de hemates ya
no ser capaz de aglutinarlos. El diagnstico es positivo en lo que respecta a
la especie cuando la reaccin es negativa, es decir, la no aglutinacin
indicara que la capacidad de aglutinar del suero de Coombs, quedo
absorbida por las globulinas de la mancha, y por tanto, que estas eran
humanas.2
Esta prueba cuenta con una muy baja sensibilidad, ya que si la muestra es
muy escasa, presentar aglutinacin, prestndose el resultado a
confusiones, debido a que se puede pensar que sea sangre de origen
animal, lo cual no permite diferenciar y esclarecer el origen de la aglutinacin.
Adems, esta tcnica puede presentar reaccin cruzada con los primates,
debido al grado de relacin gentica que tenemos los humanos con ellos.
Igualmente, su realizacin es dispendiosa en cuanto a tiempo y metodologa
se refiere, puesto que es necesario, como primera medida sensibilizar
glbulos rojos O Rh + con anti-CDE, (reactivo que actualmente va a ser
retirado del mercado, lo cual hace an ms pertinente y urgente nuestro
estudio). Consecuentemente, se deben realizar diluciones del suero de
23
Coombs (1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128), adems, los tiempos de incubacin
son bastante prolongados, por tanto la obtencin de los resultados se
extiende por un amplio periodo de tiempo, demorando as un poco ms la
entrega del informe a la autoridad.
Dicho test utiliza un Tris Buffer pH 7,5 para extraer la muestra, detectando la
hemoglobina humana, la cual es una protena eritrocitaria intracelular
altamente especializada, responsable de realizar intercambio gaseoso; est
compuesta por cuatro subunidades, cada una tiene una cadena de globina
con el hem en una hendidura hidrofbica. Existen cuatro tipos diferentes de
cadenas de globina: , , , , las cuales se presentan en pares. La
combinacin de estos pares determinan el tipo de hemoglobina, los cuales
pueden ser embrionarias, fetales (HbF) y de adulto (Hb A2 y Hb A).3
3
Mckenzie, S. B.. 2000. Hematologa clnica. Editorial manual moderno. Segunda edicin.
Mxico, D.F.. pgs 50-51.
24
Este estudio reporta la prueba como muy sensible, detectando hasta
diluciones 1:1000000 cuando se utiliza Buffer - Tris y 1:100000 cuando se
utiliza agua estril. Adems es muy especfica (excepto en el caso de
primates) y estable debido a que el antgeno no es afectado por una variedad
de condiciones ambientales y tiempo. Este test es sencillo, rpido, requiere
una mnima cantidad de equipos y son fciles de interpretar. 4
4
Laboratorios Human, Hexagon OBTI. Prueba inmunolgica para sangre oculta. Prueba
inmunocromatogrfica de 1 paso para la deteccin de sangre oculta en materia fecal.
5
Abacus diagnostics Inc.. ABAcard Hematrace for the forensic identification of human
blood. Immunoassay for the qualitative detection of human blood at crime scenes and in
forensic laboratories.
6
Castro M, Gascn S, Pujol M, et al. Validacin de mtodos analticos. A.E.F.I., Seccin
Catalana. Madrid; 1996.
25
La primera se refiere a la verificacin del cumplimiento de las condiciones
establecidas para un proceso o mtodo analtico, que se lleva a cabo antes
de la comercializacin del producto. Este tipo de validacin se aplica cuando
se elabora un nuevo mtodo analtico. Es tpico de los laboratorios de
investigacin y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un protocolo
perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios
necesarios para demostrar el buen funcionamiento del mtodo; mientras que
la segunda se realiza cuando la idoneidad del proceso o mtodo analtico, se
basa en la garanta constatada a travs de los datos analticos del producto
ya comercializado. Se aplica a mtodos no validados previamente y de los
que se tiene una amplia historia de resultados. Este tipo de validacin se
aplica para mtodos por cromatografa lquida, mtodos espectrofotomtricos
y mtodos volumtricos.4
26
El fundamento de la prueba consta en que la hemoglobina humana presente
en la muestra reacciona con un reactivo que contiene partculas de color azul
y un anticuerpo monoclonal anti Hb-humano. El complejo migra a la zona de
prueba donde es capturado por un segundo anticuerpo inmovilizado directo
contra hemoglobina, formando una lnea de prueba color azul que indica un
resultado positivo. El reactivo que no reaccion contina migrando y se une
en una segunda lnea a anticuerpos Ig-G inmovilizados. Esta lnea
corresponde a una lnea de control, que indica el correcto funcionamiento y el
apropiado manejo del reactivo.
7
Laboratorios Orgenics, RapidSignal Occult Blood - Cassette.
27
prueba, se encuentran: flujo vaginal, semen, orina, materia fecal, saliva y
sudor. Su composicin se describir a continuacin:
8
Gispert, C.. Diccionario de medicina Ocano Mosby. 4 edicin. Ocano grupo editorial s.a.
Barcelona, Espaa.
28
espermatocitos secundarios, los que finalmente dan a lugar a los
espermatozoides propiamente dichos. La prstata segrega una parte del
lquido que finalmente formar parte del semen. Finalmente, en la base del
tejido esponjoso del pene, hay un tercer par de pequeas glndulas,
llamadas glndulas de Cowper que proporcionan el ltimo componente del
liquido seminal. Este fluido seminal contiene elementos protectores para los
espermatozoides, que los aslan de los cidos que normalmente se
encuentran en la uretra y en aparato reproductor femenino; tambin contiene
glucosa, fructosa, ribosa, inositol y sorbitol como sustratos para el
metabolismo de los espermatozoides. Contiene espermita, colina,
etanolamina, albmina, globulinas, as como diferentes enzimas como la
aminoxidasa, la fosfatasa cida y la P30. Tambien contiene lectinas, zinc y
calcio. El volumen eyaculado normalmente es de 1 a 6 mL. 9
9
Guyton, Arthur Clifton. 2006. Tratado de fisiologa mdica. 11 edicin. Madrid, Espaa.
Editorial elsevier/saunders.
.
29
PTA), factor Hageman, as como vitaminas (tiamina, riboflavina, niacina,
piridoxina, cido pantotnico, biotina, cido flico y B12).
Normalmente hay muchas enzimas en la saliva. Algunas como la ptialina
(alfa amilasa), ayudan a la digestin; y existen otras como la hialuronidasa,
lipasa, beta-glucoronidasa, condroitinsulfatasa, decarboxilasas de
aminocidos, catasala, peroxidasa, colagenasa y neuraminidasa. La cantidad
segregada de saliva oscila alrededor de los 15 cc/hora. 7
La orina es un lquido excretado por los riones a travs de las vas urinarias,
con el cual se eliminan sustancias innecesarias para el organismo.
Desempea un papel importante en la regulacin del balance de lquidos y
electrolitos y del equilibrio entre cidos y bases. En las personas sanas es
clara y de color ambarino. La cantidad de orina producida diariamente es de
1 a 1,5 litros, valor que aumenta si se ingieren muchos lquidos y disminuye
en caso de sudoracin intensa. La orina normal contiene un 96% de agua y
un 4% de slidos en solucin. Cerca de la mitad de los slidos son urea, el
principal producto de degradacin del metabolismo de las protenas. El resto
incluye nitrgeno, cloruros, cetosteroides, fsforo, amonio, creatinina y cido
rico. 7
30
salud. La secrecin del sudor se produce a raz del aumento de temperatura
causado por el ejercicio, miedo, dolor, nervios, etc. 7
31
lquido incoloro, con olor a ester, no txico, y no cancergeno, aunque puede
causar problemas respiratorios si se inhalan sus vapores, problemas en la
piel cuando cae sobre ella en estado lquido, y puede volverse txico cuando
se encuentra a altas temperaturas, por tal motivo, para su uso, es
indispensable portar gafas, guantes, y mscaras o tapabocas.
Los monmeros inician a polimerizarse por bases dbiles, (como los iones
hidroxilo en agua o vapor de agua). Esta facilidad y rapidez para la iniciacin
de la polimerizacin es la responsable no solamente de la propiedad de
adherencia sino tambin de revelar las huellas dactilares, gracias a que se
observa un compuesto slido blanco delimitando la huella a analizar.
Por tanto al polimerizarse los monmeros de cianoacriolato, y al reaccionar
con agua, permite revelar huellas latentes y huellas recientes. As, que es
necesario que este compuesto se polimerice para poder actuar, y revelar de
esta forma las huellas dactilares. 10
32
as mismo puede llegar a interferir en este tipo de anlisis, es el polvo negro
revelador, o negro de humo, el cual se obtiene al quemar el gas natural con
una cantidad limitada de aire, de modo que se produzca la mxima cantidad
de humo, el gas se quema debajo de una placa de hierro giratoria y
refrigerada con agua, de la que se rasca el holln depositado. Tambin se
produce negro de humo quemando trementina, petrleo, alquitrn y aceites
grasosos. El negro de humo es una de las variedades ms puras de carbn
amorfo.11
10
Foster + Freeman, mvc3000: Superglue fuming cabinet. User manual 16. USA INC.
Virginia 20166.
11
www.textoscientificos.com
33
Metodologa
Tipo o diseo de
Experimental prospectivo
estudio
Universo Diferentes tipos de manchas, mezcladas o no con sangre humana
36 Muestras de sangre humana, 7 muestras de sangre de animales, 6
manchas de fluidos corporales, 4 manchas de diferentes extractos
Muestra
vegetales y diferentes sustancias, 2 manchas de sangre humana con
antigedad de 1 y 4 aos respectivamente.
Unidad de
Manchas de sangre sobre un determinado soporte
observacin
Manchas de sangre secas aplicadas sobre tela paal o sobre otros
soportes, manchas de fluidos corporales secas ausentes de sangre
Criterios de
visible, manchas de diferentes extractos vegetales y diferentes
inclusin
sustancias secas sin contaminacin de sangre, aplicadas sobre tela
paal.
Criterios de
Muestras que presenten algn tipo de contaminacin con hongos.
exclusin
Definicin y Cantidad de sangre humana o de mono Macacus Rhesus utilizado
medicin de sobre la tela paal o el soporte correspondiente, naturaleza de las
variables interferencias aplicadas, magnitud de la diluciones realizadas a las
Independientes muestras, y antigedad de las manchas.
Prueba Positiva: La prueba se confirma como positiva para sangre
Definicin y humana por la aparicin de dos bandas prpuras en la ventana.
medicin de Prueba Negativa: La prueba se confirma como negativa para sangre
variables humana por la sola aparicin de la banda control en la ventana.
Dependientes Prueba Inconclusa o Invlida: La prueba se determina inconclusa o
invlida cuando no aparece la lnea control en la ventana.
Plan de tabulacin Especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo, valor predictivo
y anlisis negativo, lmite de deteccin y repetibilidad.
Se recolectarn los datos de las pruebas positivas y negativas
Mtodos o
teniendo en cuenta a qu diluciones se encuentran, con qu
tcnicas de
interferencia y en qu tipo de muestra estn. Los datos sern
recoleccin
recolectados por las investigadoras.
Para la extraccin de muestras de sangre de animales se tendrn en
cuenta las normas para manejo de animales en investigacin, (Vase
la siguiente pgina), para lo cual contamos con la colaboracin de la
Dra. Pilar Calvo, Medico Veterinario de la Clnica Veterinaria de La
Consideraciones Universidad de La Salle.
ticas
Para la extraccin de muestras de sangre y fluidos biolgicos
humanos, se tuvo en cuenta que se realiz en personas voluntarias,
que estuvieron informadas sobre el tipo de estudio que se llev a cabo.
(Vase la siguiente pgina).
34
Obtencin de las muestras
35
Adems, para la obtencin de las muestras de sangre de dichos animales, se
tuvieron en cuenta normas bsicas de bioseguridad, tales como:
36
de edades: nios, jvenes y adultos, tomando seis personas para cada
grupo.
37
Las muestras de orina y semen se recolectaron cada una en un
envase plstico especial para parcial de orina. Luego de la
obtencin de las muestras, se impregnaron dos fragmentos de tela
paal con dimensiones de un centmetro por un centmetro, hasta
que las telas quedaran suficientemente humedecidas con la
muestra. Posteriormente se dispusieron los fragmentos de tela en
una copa plstica pequea.
38
Fue necesaria tambin una muestra de cada uno de los diferentes extractos
vegetales y sustancias, tales como: rbano, remolacha, cscara de pltano
verde e isodine, (que por su apariencia fsica podran confundirse con sangre
humana). Estas se realizaron manchando dos fragmentos de un centmetro
por un centmetro de la tela paal con cada extracto o sustancia a estudiar.
39
tubo y se adicionaron 900 L de solucin salina, y as sucesivamente hasta
llegar a la dilucin 1/1000000. El volumen final de cada tubo fue de 900 L
(salvo en el ltimo tubo).
40
Tratamientos
41
Las manchas realizadas para estos dos ltimos tratamientos (exposicin a
polvo negro revelador y a ester de cianoacriolato), fueron transferidas cada
una a un fragmento de papel debidamente marcado, y posteriormente se
remitieron al laboratorio de dactiloscopia del Instituto Nacional de Medicina
Legal y Ciencias Forenses - Regional Bogot, para as poder ser expuestas a
cada uno de estos tratamientos.
42
Soportes
43
dactiloscopia los siguientes soportes con manchas de sangre humana diluida
1/1.000 y 1/10.000: cuchillo en buen estado, cuchillo oxidado, fragmento de
madera y vidrio. Estos soportes fueron expuestos a polvo negro revelador y
ester de cianoacriolato, y posteriormente fueron analizados de igual forma
que se analizaron estos mismos soportes sin tratamiento.
Todas las manchas realizadas en tela paal, los escobillones con los cuales
se extrajeron las muestras de los soportes, expuestos a tratamientos y los
otros dos escobillones de flujo vaginal, fueron puestos en el secador de aire
durante 48 horas, tiempo en el cual se encontraban totalmente secos.
Rotulacin
44
Determinacin de sangre humana con el Kit Rapid Signal - Occult Blood
Para las manchas realizadas en las diferentes telas, con las tijeras ya
limpias, se dividi la mancha en fragmentos an ms pequeos con el fin de
facilitar el proceso de sumersin de la muestra en el buffer Tris.
45
Luego de que la muestra estuvo en contacto con el buffer, se procedi a
agitar la muestra, con el objetivo de promover la extraccin de la misma.
Luego de transcurridos 10 minutos, tiempo en el cual el buffer actu lo
suficiente, se dispensaron dos gotas de la muestra en el pozo del cassette
indicado para esto, se observ correr la muestra mediante un color prpura, y
se esper de 5 a 10 minutos para finalmente obtener el resultado.
46
de vidrio de 13x100 con solucin salina y luego se realizaron manchas en
tela paal con dichas diluciones.
Los procedimientos utilizados con este ltimo kit, fueron exactamente los
mismos anteriormente nombrados, dilucin directa con buffer y dilucin con
solucin salina en mancha; para luego seguir los pasos indicados en el
inserto incluido en el kit.
47
los extractos vegetales y el isodine sin contaminacin de sangre, as como
los fluidos biolgicos ausentes de sangre visible.
Presencia Ausencia
Resultados
a b
positivos
Resultados
c d
negativos
Tabla 2. Tabla de 2 x 2
48
Finalmente, se procedi a aplicar las frmulas correspondientes a cada
parmetro estadstico, las cuales se enuncian ms adelante.
Repetibilidad
49
MUESTRA DILUCION SOPORTE SECADO TRATAMIENTO SECADO
Sangre de animales Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
(gato, perro, caballo, seriadas de dimensiones de un secado por 48
gallina, cerdo, vaca, 1/10 centmetro por un horas
mono Macacus centmetro
rhesus)
Sangre humana de 36 Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
individuos seriadas de dimensiones de un secado por 48
1/10 centmetro por un horas
centmetro
Fluidos biolgicos Sin diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
(semen, sudor, orina, dimensiones de un secado por 48
materia fecal, saliva, centmetro por un horas
flujo vaginal) centmetro, excepto flujo
vaginal, en escobillones
Extractos vegetales y Sin diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
sustancias (rbano, dimensiones de un secado por 48
remolacha, cscara de centmetro por un horas
pltano verde e centmetro
isodine)
Manchas de sangre Sin diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
con 4 aos de dimensiones de un secado por 48
antiguedad centmetro por un horas
centmetro
Control positivo (una Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
de las 36 muestras de seriadas de dimensiones de un secado por 48
los individuos) 1/10 centmetro por un horas
centmetro
Control negativo Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
(buffer Tris) seriadas de dimensiones de un secado por 48
1/10 centmetro por un horas
centmetro
Seis diluciones Tela paal con En cabina de Cambios Cada En cabina de
Una de las 36 seriadas de dimensiones de dos secado por 48 Ambientales, tratamiento secado por
muestras de los 1/10 centmetros por dos horas Hipoclorito, Tierra, por un 48 horas, si
individuos(diferente al centmetros periodo de lo requiere
control positivo) 15 das
Polvo negro
revelador Ester de
cianoacriolato
Seis diluciones Cuchillo en buen estado En cabina de Sin tratamiento
seriadas de y oxidado, piedra, palo y secado por 48
1/10 telas de jean, dril, horas
algodn, tela
impermeable y cuero, de
un centmetro por un
centmetro
Tabla 4. Metodologa
50
Resultados
Segn el inserto dado en el kit Rapid Signal Occult Blood Cassette los
resultados posibles para la prueba son:
51
Figura 4. Negativo para hemoglobina humana
52
Resultados obtenidos para el control positivo
MUESTRA RESULTADO
Sangre humana Positivo 1/10.000
MUESTRA RESULTADO
Buffer tris Negativo
53
Resultados obtenidos para las manchas de sangre de animales
MUESTRA RESULTADO
Caballo Negativo
Cerdo Negativo
Gallina Negativo
Gato Negativo
Perro Negativo
Vaca Negativo
Mono Macacus rhesus Positivo 1/10.000
54
Figura 9. Gallina Figura 10. Gato
55
Resultados obtenidos para las manchas de sangre humana de los
dieciocho individuos de sexo femenino
56
Resultados obtenidos para las manchas de sangre humana de los
dieciocho individuos de sexo femenino
10.000 veces4
1.000 veces3
DILUCIN
100 veces2
10 veces1
Sin dilucin0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Nmero de Muestra
Figura 14. Nivel de la ltima dilucin que gener resultados positivos en las
dieciocho muestras de sangre de individuos de sexo femenino
57
Sexo Masculino (18 muestras)
58
Figura 23. Joven femenino 3 Figura 24. Joven femenino 4
59
Figura 29. Adulto femenino 3 Figura 30. Adulto femenino 4
60
Resultados obtenidos para las manchas de sangre humana de los
dieciocho individuos de sexo masculino
61
Resultados obtenidos para las manchas de sangre humana de
los dieciocho individuos de sexo masculino
10.000 veces4
1.000 veces3
DILUCIN
100 veces2
10 veces1
Sin dilucin0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Nmero de muestra
Figura 33. Nivel de la ltima dilucin que gener resultados positivos en las
dieciocho muestras de sangre de individuos de sexo masculino
62
Figura 36. Nio 3 Figura 37. Nio 4
63
Figura 42. Joven masculino 3 Figura 43. Joven masculino 4
64
Figura 48. Adulto masculino 3 Figura 49. Adulto masculino 4
65
Resultados obtenidos para las manchas de fluidos biolgicos
MUESTRA RESULTADO
Flujo vaginal Negativo
Orina Negativo
Semen Negativo
Sudor Negativo
Saliva Negativo
Materia fecal Negativo
66
Figura 56. Saliva Figura 57. Materia fecal
MUESTRA RESULTADO
Rbano Negativo
Remolacha Negativo
Cscara de pltano verde Negativo
Isodine Negativo
67
Figura 60. Cscara de pltano verde Figura 61. Isodine
MUESTRA RESULTADO
Mancha de sangre con 1 ao de antigedad. Positivo
Mancha de sangre con 4 aos de antigedad. Positivo
68
Resultados obtenidos para las manchas de sangre expuestas a
tratamientos
69
Resultados obtenidos para las manchas
de sangre expuestas a tratamientos
3
1.000 veces
100 veces
2
DILUCIN
10 veces
1
Sin dilucin
0
1 2 3 4 5
Nmero de muestra
Figura 64. Nivel de la ltima dilucin que gener resultados positivos en las
muestras de sangre humana expuestas a diferentes tratamientos.
70
Figura 67. Contacto con tierra a Figura 68. Exposicin a polvo
profundidad de 50 cms. y sometida negro revelador
a condiciones de lluvia
71
Resultados obtenidos para las manchas de sangre realizadas en
diferentes soportes
72
Resultados obtenidos para las manchas de
sangre realizadas en diferentes soportes
10.000 veces4
1.000 veces3
10 veces1
Sin dilucin0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nmero de Muestra
Figura 70. Nivel de la ltima dilucin que gener resultados positivos en las
muestras de sangre humana realizadas sobre diferentes soportes.
73
Figura 73. Cuchillo en buen estado Figura 74. Prueba para cuchillo
en buen estado
74
Figura 79. Tela de dril Figura 80. Prueba para tela de dril
Figura 83. Tela semi - impermeable Figura 84. Prueba para tela semi
Impermeable
75
Figura 85. Fragmento de madera Figura 86. Prueba para
fragmento de madera
\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\
76
Resultados obtenidos para las manchas de sangre humana realizadas
en diferentes soportes y expuestas a ester de cianoacriolato (E.C.) y a
polvo negro revelador (P.N.R.)
77
Resultados obtenidos para las manchas de
sangre humana realizadas en diferentes soportes
y expuestas a reactivos de dactiloscopia
1.000 veces
3
100 veces
2
10 veces
1
Sin dilucin
0
1 2 3 4
DILUCIN Nmero de muestra
ESTER DE CIANOACRIOLATO POLVO NEGRO REVELADOR
78
Resultados obtenidos para polvo negro revelador
79
Resultados obtenidos para ester de cianoacriolato
Figura 98. Palo con E.C. Figura 99. Vidrio con E.C.
80
Lmite de deteccin
MUESTRA RESULTADO
Sangre diluida con buffer Positivo hasta la dilucin 1/100.000 realizada
(sin mancha) a 100 L de sangre, equivalente a 0,01 L de
sangre
Sangre en mancha diluida Positivo hasta la dilucin 1/10.000 realizada a
con solucin salina 100 L de sangre, equivalente a 0,1 L de
sangre.
81
Resultados obtenidos al comparar el kit Rapid Signal Occult Blood
Cassette de la casa comercial Orgenics con el kit de ABAcard Hema
Trace de Abacus Diagnostics.
Especificidad de especie
82
MUESTRA RESULTADO
Sangre humana Positivo hasta - 1/10.000
Sangre de mono Macacus rhesus Positivo hasta 1/10.000
Repetibilidad
Presencia Ausencia
Resultados
36 1 (sangre de mono
Positivos
Macacus rhesus)
Resultados
0 16
Negativos
83
Basndonos en esta tabla, los porcentajes de sensibilidad, especificidad,
valores predictivos positivos y valores predictivos negativos obtenidos fueron
los siguientes:
Sensibilidad:
a
S=
a+c
36
S= S = 100 %
36 + 0
Especificidad:
d
E=
(d + b)
84
Remplazando nuestros datos en la frmula, obtuvimos lo siguiente:
16
E= E = 94,11%
16 + 1
a
VPP =
(a + b)
36
VPP = VPP = 97,29%
36 + 1
El valor calculado representa que existe una probabilidad del 97,29% de que
las muestras analizadas presenten sangre humana cuando al aplicar la
tcnica da un resultado positivo.
85
Valores Predictivos Negativos:
d
VPN =
(d + c)
16
VPN = VPN = 100 %
16 + 0
El valor calculado representa que existe una probabilidad del 100% de que
las muestras analizadas no presenten sangre humana cuando al aplicar la
tcnica da un resultado negativo.
86
Discusin de resultados
87
Medicina Legal y Ciencias Forenses - Regional Bogota, encontrar sangre en
manchas (en algunos casos diluidas) es lo usual; por tal motivo, y para fines
de este estudio, conviene citar y tener en cuenta el lmite de deteccin
realizado al procedimiento en el cual se realiz mancha de cada dilucin.
Cabe anotar que dentro de los criterios de inclusin para que las muestras de
los donantes fueran tomadas en cuenta en este estudio, se encuentra el
lugar de residencia, debido a que las concentraciones de hemoglobina varan
con la altitud, por tal motivo el donante deba haber vivido como mnimo por
un ao en la ciudad de Bogot D.C, para de esta manera poder mantener
uniformidad entre las treinta y seis muestras.
88
para la deteccin de sangre humana en manchas con el kit Rapid Signal
Occult Blood casette de la casa comercial Orgenics, a pesar de las
variaciones de los valores normales de las concentraciones de hemoglobina
para cada grupo.
89
Por otro lado, es importante argumentar que al observar manchas de
sustancias de color aparentemente rojizo, las cuales pueden provenir de
algunos extractos vegetales o diferentes sustancias, siendo las ms comunes
las incluidos en este estudio, y sean estas analizadas con el kit Rapid Signal
Occultt Blood de la casa comercial Orgenics, podemos afirmar que se
obtendr un resultado en el cual se descarte la presencia de sangre humana
de una manera confiable, brindando la seguridad del resultado.
Esta determinacin permite que el kit sea confiable al usarlo como prueba
confirmatoria para el anlisis de manchas de sangre en el Instituto Nacional
de Medicina Legal Regional Bogota, ahorrando tiempo, mostrando
resultados con un mnimo ndice de falsos positivos, exclusivo para la sangre
del mono Macacus Rhesus, evitando la desviacin del caso, y as mismo,
perjuicios al personal de trabajo, dejando atrs realizar pruebas dispendiosas
que proporcionen resultados en un largo periodo de tiempo.
Sensibilidad:
Para la ciencia forense, igual que para cualquier otra ciencia, el porcentaje de
sensibilidad juega un papel extremadamente importante, debido a que el
90
perito puede mantener la seguridad de que la prueba esta detectando las
muestras positivas que son positivas, en este caso, para sangre humana.
Repetibilidad
91
Forenses, para anlisis de manchas de sangre, pues los resultados
obtenidos bajo la misma metodologa, realizada con el mismo kit, y ejecutada
por el mismo operador, no mostraron diferencia alguna entre los resultados
originales y su respectiva repeticin, manteniendo identidad en cada uno de
los resultados de las muestras, brindando de esta manera seguridad para su
uso.
Tratamientos
92
Las manchas de sangre humana sometidas a la accin del hipoclorito de
sodio (NaClO) de uso domstico, a una concentracin de 5,6 % m/v y con
volumen de un mililitro, equivalente a 0,056 g, tambin mostraron resultados
negativos en la prueba debido a que el anin hipoclorito (ClO) tiene
capacidad redox, por lo cual se le confiere una marcada actividad perjudicial
frente a todos los compuestos orgnicos, incluida la hemoglobina. As mismo,
los radicales hidroxilo que puedan quedar libres son igualmente lesivos para
dichos compuestos.
93
determinacin de manchas de sangre, el resultado proporcionado por este
ultimo laboratorio ser correcto. Lo anterior es un pequeo avance para
proponer un orden ante el manejo de las evidencias, pues se requiere mayor
cuidado en la manipulacin de stas cuando se buscan huellas dactilares, las
cuales pueden perderse parcial o totalmente al ser manipuladas como
primera medida por el laboratorio de biologa, sin embargo para lograr un
orden lgico ante el manejo correcto de una evidencia que necesite anlisis
por parte de estos dos laboratorios, se deben realizar en el futuro ms
estudios que puedan corroborar lo anteriormente citado.
Soportes utilizados
94
menor al encontrado en las manchas realizadas en tela de algodn,
posiblemente por la intervencin del escobilln humedecido con solucin
salina en el procedimiento de extraccin de la mancha, puesto que dicho
escobilln se utiliz como puente entre los soportes imposibles de sumergir
en el buffer y la realizacin de la prueba en s, produciendo as una dilucin
mayor a la conocida, la cual no se conoce con certeza, llevando as a que el
resultado se viera afectado.
95
Iguales resultados a los encontrados con los soportes de cuchillo en buen
estado, cuchillo oxidado, fragmento de madera, vidrio y cuero, se obtuvieron
con la tela semi-impermeable, lo cual se puede deber a que esta tela tiene un
tamao de poro pequeo, lo que impide que la muestra penetre fcilmente y
que posterior a esto, despus de un periodo de tiempo prolongado, la
muestra finalmente penetre, produciendo as que la extraccin de la mancha
en el buffer se dificulte debido a esta propiedad caracterstica del soporte.
96
Antigedad
97
pueda producir la perdida de una parte de muestra que sea de inters para
los anlisis del otro laboratorio.
98
validaciones, entre las cuales se encuentra la validacin de ABAcard Hema
Trace.
Los resultados obtenidos fueron iguales en ambos ensayos para una misma
muestra, mostrando la semejanza existente entre estas pruebas. Lo anterior
se considera de gran valor debido a que se puede tener una aproximacin de
la similitud en cuanto al lmite de deteccin en manchas de sangre humana
de dos pruebas pertenecientes a dos casas comerciales diferentes. Este
resultado ofrece un soporte ms para el uso del kit Rapid Signal Occult Blood
cassette de la casa comercial Orgenics en el laboratorio de biologa del
Instituto Nacional de Medicina legal y Ciencias Forenses Regional Bogot.
99
Conclusiones
100
La prueba demostr ser insensible a la exposicin a los reactivos
polvo negro revelador y ester de cianoacriolato en los soportes
evaluados.
101
Recomendaciones
102
Bibliografa
Castro, M., Gascn, S., Pujol M.. 1996. Validacin de mtodos analticos.
A.E.F.I. Seccin catalana. Madrid.
103
Knig, H. E., Liebich, H-G.. Traduccin: Ostrowski, E.B., Facorro, L.. 2005.
Anatoma de los animales domsticos: texto y atlas en color. Editorial mdica
panamericana. 2 edicin. Buenos aires, Argentina.
Ley 84 de 1989
104
Resolucin 8430 de 1993
www.textoscientificos.com
105
Anexo 1
FORMATO DE CONSENTIMIENTO
Dra Yolima Ins Gutirrez Castillo. Eliana Delgado Pea y Victoria del Pilar
Balln Torres
106
Propsito del Estudio
Esta investigacin pretende evaluar el desempeo del kit RapidSignal Occult
Blood Cassette de la firma ORGENICS, validando as la tcnica
inmunocromatogrfica utilizada por el mismo, para la deteccin de sangre
humana en manchas de inters forense en el Laboratorio de Biologa del
Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses Regional Bogot,
debido a que existen estudios que sugieren que este tipo de tcnicas
presentan buenos resultados en cuanto a la deteccin de manchas de
sangre.
107
sangre es detectada por la tcnica que estamos evaluando. Si se trata
de cualquier otro fluido, ste ser tomado por usted mismo(a) en
envase nuevo, desechable, y siguiendo las mismas indicaciones que
para las muestras de sangre. Si la muestra es de flujo vaginal, se
tomar con un escobilln, y si es de sudor, se tomar directamente en
tela paal. Luego si se depositarn en los envases nombrados
anteriormente.
108
identificarlo personalmente, manteniendo de esta manera la confidencialidad
de la informacin relacionada con su privacidad. Este consentimiento es
efectivo desde la fecha en que se firma.
Si tiene alguna duda acerca del estudio contacte al investigador del estudio
Dra. Yolima Gutirrez. Telfono 3334850 ext. 300 301.
109
PARA MUESTRAS DE SANGRE
_______________________ _______________________
Firma del Participante Nombre del Participante
_______________________ _______________________
Firma del Testigo Nombre del Testigo
_______________________ _______________________
Firma del Investigador Nombre del Investigador
_______________________
Fecha
110
PARA FLUIDOS CORPORALES
_______________________ _______________________
Firma del Participante Nombre del Participante
_______________________ _______________________
Firma del Testigo Nombre del Testigo
_______________________ _______________________
Firma del Investigador Nombre del Investigador
_______________________
Fecha
111
EN CASO DE SER MENOR DE EDAD
(Informacin para ser dada nicamente por un familiar o acudiente)
_______________________ _______________________
Firma de quien autoriza Nombre de quien autoriza
_______________________ _______________________
Firma del Testigo Nombre del Testigo
_______________________ _______________________
Firma del Investigador Nombre del Investigador
_______________________
Fecha
112
VALIDACIN DE UNA TCNICA INMUNOCROMATOGRFICA PARA LA
DETECCIN DE SANGRE HUMANA EN MANCHAS DE INTERS FORENSE
EN EL LABORATORIO DE BIOLOGA DEL INSTITUTO NACIONAL DE
MEDICINA LEGAL Y CIENCIAS FORENSES REGIONAL BOGOT,
EMPLEANDO EL KIT RAPIDSIGNAL OCCULT BLOOD CASSETTE, DE LA
FIRMA ORGENICS.
Tcnicas validadas
sensibles y especficas.
Ciencia forense
Mancha
Mancha
Mancha
Mancha Sangre
Sangre
Anlisis
Anlisis de
de manchas
manchas de
de sangre
sangre
Contexto
Neutrfilos
Linfocitos
Basfilos
Eosinfilos
Monocitos
Mancha de Sangre
Poniendo de manifiesto solamente la presencia
de peroxidasas en la muestra analizada
Se realiza siempre y cuando se
cuente con muestra suficiente.
PRUEBA DE INHIBICIN DE LA
ANTIGLOBULINA.
Pruebas de confirmacin
Muestra
DESVENTAJAS:
Segn la cantidad de muestra: macro tcnica o micro tcnica.
Baja sensibilidad mnima muestra.
Tiempo.
Reaccin cruzada con primates.
Prometen un avance
Pruebas inmunolgicas
Pruebas inmunolgicas
Reporta
Sensibilidad: Detectando hasta diluciones 1:1000000 cuando se
utiliza Buffer - Tris y 1:100000 cuando se utiliza agua estril.
Especificidad: Aceptable primates y algunos fluidos biolgicos
Estabilidad: Elevada debido a que el antgeno no es afectado por
una variedad de condiciones ambientales y tiempo.
Primate especifico.
Zona de reaccin
Hemoglobina Humana
Antgeno
Anti- Ac inmvil
Complejo antgeno - conjugado mvil
Zona control
Conjugado Mvil
RapidSignal Occult Blood -
cassette- Orgenics
Evaluacin de la repetibilidad
Perro Gato
Caballo Vaca 18 hombres Una Muestra:
Control positivo
Gallina Cerdo 18 mujeres
Macaco rhesus
Obtencin de las muestras
Muestras de Muestras de
Manchas de
fluidos extractos
sangre
biolgicos vegetales y
humana
sustancias
Fluidos Biolgicos
Extractos vegetales PURAS
y sustancias
Manchas antiguas
Cambios ambientales (Exposicin
a humedad, cambios de tempera-
tura, vientos fuertes, lluvias inten-
sas, etc.
Se dejaron bajo estas
Contacto con Hipoclorito al 5,6% condiciones durante
15 das
con volumen de 1 ml.
Exposicin a polvo
negro revelador Remitidas al laboratorio
Exposicin a ester de de Dactiloscopia
cianoacriolato
Algodn Dril
Cuero
Jean Semi-Impermeable
Evaluacin de los soportes
Vidrio
Cuchillo
Polvo negro
Cuchillo revelador
Diluciones
oxidado
de 1/1.000 y
Fragmento de
Ester de
madera 1/10.000
cianoacriolato
Vidrio
MUESTRA DILUCION SOPORTE SECADO TRATAMIENTO SECADO
Sangre de animales Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
(gato, perro, caballo, seriadas de dimensiones de un secado por 48
gallina, cerdo, vaca y 1/10 centmetro por un horas
mono Macaco rhesus) centmetro
Sangre humana de 36 Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
individuos seriadas de dimensiones de un secado por 48
(18 hombres y 18 1/10 centmetro por un horas
mujeres) centmetro
Fluidos biolgicos Sin diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
(semen, sudor, orina, dimensiones de un secado por 48
materia fecal, saliva, centmetro por un horas
flujo vaginal) centmetro, excepto flujo
vaginal, en escobillones
Extractos vegetales y Sin diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
sustancias(rbano, dimensiones de un secado por 48
remolacha, cscara de centmetro por un horas
pltano verde e centmetro
isodine)
Manchas de sangre Sin diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
con 1 y 4 aos de dimensiones de un secado por 48
antiguedad centmetro por un horas
centmetro
Tabla metodologa
Control positivo (una de Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
las 36 muestras de los seriadas de dimensiones de un secado por 48
individuos) 1/10 centmetro por un horas
centmetro
Control negativo Seis diluciones Tela paal con En cabina de Sin tratamiento
(Buffer Tris) seriadas de dimensiones de un secado por 48
1/10 centmetro por un horas
centmetro
Una de las 36 muestras Seis diluciones Tela paal con En cabina de Cambios Cada En cabina
de los individuos seriadas de dimensiones de dos secado por 48 Ambientales, tratamiento de secado
(diferente al control 1/10 centmetros por un horas Hipoclorito, Tierra. por un por 48
positivo) centmetro periodo de horas, si lo
15 das requiere
Polvo negro
revelador Ester de
cianoacriolato
Seis diluciones Cuchillo en buen estado y En cabina de Sin tratamiento
seriadas de oxidado, piedra, palo y secado por 48
1/10 telas de jean, dril, algodn, horas
tela semi - impermeable,
vidrio y cuero, de un
centmetro por un
centmetro
Seis diluciones Cuchillo en buen estado y En cabina de Polvo negro revelador Ester de
seriadas de oxidado, fragmento de secado por 48 cianoacriolato
1/10 madera y vidrio, de un horas
centmetro por un
centmetro
Positivo Negativo
Muestras de sangre de las 36 personas
1 Muestra de sangre
1.000 veces
3
DILUCIN
100 veces
2
10 veces
1
Sin dilucin
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Nmero de Muestra
10.000 veces 4
1.000 veces 3
DILUCIN
100 veces 2
10 veces 1
Sin dilucin 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Nmero de muestra
MUESTRAS RESULTADOS
Caballo Negativo
Cerdo Negativo
Gallina Negativo
Gato Negativo
Perro Negativo
Vaca Negativo
Mono Macacus Positivo 1/10.000
rhesus
Resultados
MUESTRAS RESULTADOS
Flujo vaginal Negativo
Orina Negativo
Semen Negativo
Sudor Negativo
Saliva Negativo
Materia fecal Negativo
Resultados
MUESTRAS RESULTADOS
Rbano Negativo
Remolacha Negativo
Cscara de Negativo
pltano verde
Isodine Negativo
Resultados
MUESTRAS RESULTADOS
Manchas de Positivo
sangre con 1 ao
de antigedad
Manchas de Positivo
sangre con 4 aos
de antigedad.
Resultados
100 veces2
DILUCIN
10 veces1
Sin dilucin0
1 2 3 4 5
Nmero de muestra
1 Algodn
Resultados obtenidos para las manchas de
2 Cuchillo
sangre realizadas en diferentes soportes
3 Cuchillo ox.
10.000 veces 4
4 Cuero
1.000 veces 3
5 Semi Imp.
100 veces 2 DILUCIN
6 Frag. madera
10 veces 1
7 Vidrio
Sin dilucin 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8 Jean
Nmero de Muestra 9 Dril
10 Piedra
Resultados
Resultados
Resultados
Resultadosobtenidos
obtenidos para
obtenidospara las manchas
laslas
para manchas
manchas de sangre
dede
sangre
humana
sangrerealizadas
humana realizadas en
en diferentes
diferentes
humana realizadas soportes yy expuestas
soportessoportes
en diferentes expuestas
aa reactivos
y expuestasreactivos de
de dactiloscopia
dactiloscopia
a reactivos de dactiloscopia
1.000 veces 3
100 veces 2
10 veces 1
Sin dilucin 0
1 2 3 4
DILUCIN Nmero de muestra
ESTER DE CIANOACRIOLATO POLVO NEGRO REVELADOR
MUESTRAS RESULTADOS
Sangre pura Positivo hasta
diluida con buffer 1/100.000
(sin mancha)
Sangre en mancha Positivo hasta
diluida con 1/10.000
solucin salina
Resultados
Presencia Ausencia
de sangre de sangre
Humana Humana
Resultados 36 1
positivos
Resultados 0 16
negativos
Resultados
a
S=
a +c