Semestre Ago-Dic 2017

Extraccin de DNA, RNA de Linfocitos y Electroforesis de muestras.

Equipo 2, Sptimo y A
Muoz Hernndez Edna Victoria, Regalado Rodrguez Mauricio y Medina Reyes Manuel Horacio. Viernes 1:00
p.m. 4:00 p.m. Extraccin de DNA (29-09-2017), Extraccin de RNA (6-10-2017) & Electroforesis (13-10-2017)
Ciclo Agosto-Diciembre 2017.
Laboratorio de Gentica, Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Zacatecas.
rrm.96@hotmail.com

Resumen: Por medio de este articulo nos vamos a dar cuenta en algunas de las formas ms utilizadas para la
extraccin del ADN, a partir de sangre perifrica que se puede utilizar para muchas finalidades por ejemplo para el
anlisis de algunas enfermedades que se presenten en cada uno de los individuos en particularidad y
posteriormente podamos dar una hiptesis de dicho resultados al realizar la practica con el fin de posteriormente el
ADN extrado lo analizaremos para detectar anomalas de la persona, en caso de tener sospechas de alguna
patologa.
La metodologa que se va a utilizar en esta prctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se
mencion, igualmente el ADN y las protenas pueden ser recuperados de la fase orgnica por precipitacin
secuencia, as con etanol se logra precipitar el ADN de la interface y con una precipitacin adicional pueden
recuperarse las protenas de la fase orgnica. Esta tcnica permite obtener ARN a partir de pequeas cantidades
de sangre perifrica de origen humano.
La electroforesis en gel de agarosa es de las ms utilizada para analizar y caracterizar cidos nucleicos de
distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permite separar molculas cargadas
en funcin a su tamao y forma. As molculas de ADN Y ARN de diferente tamao van a migrar de forma distinta
en una electroforesis en gel de agarosa, adems si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso
molecular (fragmentos de ADN Y ARN de tamao conocido), se puede calcular el tamao aproximado de las
molculas en estudio.
Palabras clave: DNA, RNA, Electroforesis, Agarosa, Marcador, Buffer, Cualitativo.

Introduccin Se han desarrollado diversos procedimientos

En los ltimos aos los avances en el campo
de la gentica molecular han mejorado de
forma notable el conocimiento de los
mecanismos fisiopatolgicos y el diagnostico
de distintas enfermedades en ADN se
encuentra la informacin gentica del
individuo, por tanto, el primer paso para llegar
a cabo un estudio de gentica molecular
implica la obtencin de muestra de cidos
nucleicos, especialmente de ADN. Las
tcnicas de extraccin de cidos nucleicos
son sencillas, pero es importante mantener
una serie de precauciones para evitar la
degradacin por nucleasas durante la
manipulacin. El objetivo es obtener la
mxima cantidad y la mayor calidad del ADN.
o protocolos de extraccin teniendo en cuenta
el origen o fuente del ADN. en los ltimos
aos las casas comerciales a desarrollado
diversos kits de obtencin del ADN a partir de
sangre, todo tipo de tejidos y cultivos
celulares que pretendan optimizar los
procedimientos para poder obtener un
mximo de ADN de buena calidad y en el
menor tiempo posible. A partir de sangre: las
clulas nucleadas de sangre perifrica son
una de las fuentes ms esequibles son las
ms utilizadas en medicina para la obtencin
de ADN genmico. La revelacin ms
importante de la gentica molecular fue
concebida en 1953, al ser descubierta la
estructura de la molcula de ADN por los
cientficos Watson y Crick. Segn Brker R.

descubrimientos precedentes llevados a
cabos por otros investigadores como Rosalind
Franklin, Maurice Wilkins y Linus Pauling
fueron sin lugar a dudas imprescindibles para
lograr este importante hallazgo que
revolucion el campo de las investigaciones
biolgicas. Desde entonces, varios mtodos
de purificacin utilizan perlas de cristal, perlas
magnticas, detergentes o los juegos
comerciales establecidos, con la finalidad de
obtener una molcula cada vez ms pura e
ntegra. Los autores aslan esta molcula con
diferentes objetivos, que van desde los
estudios relacionados a los procesos
evolutivos de las especies, hasta sus
aplicaciones en las ciencias forenses y en las
ciencias biomdicas, fundamentalmente
destinadas al diagnstico de diversas
enfermedades.
El trmino electroforesis se usa para describir
la migracin de una partcula cargada bajo la
influencia de un campo elctrico. Muchas
molculas importantes biolgicamente
(aminocidos, pptidos, protenas,
nucletidos, cidos nucleicos...) poseen
grupos ionizables y existen en solucin como
especies cargadas, bien como cationes, o
bien como aniones. Estas especies cargadas
se van a separar en funcin de su carga
cuando se aplica un voltaje a travs de los
electrodos. Existen muchos tipos de
electroforesis, que se engloban en dos
categoras fundamentales:
-Electroforesis de frente mvil.
-Electroforesis de zona.
Actualmente, slo se utiliza la electroforesis
de zona, en la cual la muestra se desplaza
sobre un soporte slido, como papel de filtro,
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celulosa o gel (agarosa, acrilamida...) y los
componentes de la muestra migran en forma
de pequeas bandas, tambin llamadas
zonas. La electroforesis en geles una tcnica
muy utilizada para separar molculas o
fragmentos de molculas de cidos nucleicos.
Los materiales ms comunes para separar
molculas de cidos nucleicos son polmeros
como la poliacrilamida o la agarosa. Estos
geles se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampn de
pH alrededor de 8. De esta forma, las
molculas de DNA o RNA sometidas a
electroforesis se desplazarn al polo positivo
ya que a pH superiores a 5 poseen carga
negativa. Los geles se comportan como un
tamiz molecular y permiten separar molculas
cargadas en funcin de su tamao y forma.
As, molculas de DNA de diferente tamao,
van a emigrar de forma distinta en un gel de
electroforesis. La distancia recorrida por cada
fragmento de DNA va a ser inversamente
proporcional al logaritmo de su peso
molecular. Es importante la utilizacin de
marcadores de tamao conocido porque nos
permitirn calcular el peso molecular de las
muestras de DNA Y RNA problema [4].
Material y Mtodos
Extraccin de DNA Sangre perifrica
Por puncin venosa se obtuvieron 5 ml
de sangre y depositaron en tubo con EDTA
para evitar que coagular, se llev a
centrifugar 2500 rpm durante 8 minutos y se
extrajo la capa de leucocitos, colocndola en
un tubo cnico de 15 ml. Se completaron 8 ml
en el tubo cnico al agregar solucin de SLR
fro y se homogeniz por inversin, posterior
se colocaron en hielo por 15 minutos y cada 5

minutos se homogenizaba. Posterior a retirar
del hielo, se llev a centrifugar a 3000 rpm por
10 minutos para la obtencin del botn de
leucocitos, el sobrenadante fue desechado y
los pocos eritrocitos que quedaron junto al
botn fueron lavados con SLR. Al botn de
leucocitos se le agreg 500 l de DNAzol y
para lisarlos se realiz un pequeo pipeteo y
al estar lisado se transfiri a un tubo para
microcentrifuga de 1.5 ml. Al tubo de micro
centrifuga con las clulas ya lisadas, se les
agreg etanol absoluto fro y se invirti el tubo
para poder observar las hebras de ADN,
despus el sobrenadante fue desechado por
medio de una pipeta, cuidando el no traernos
el ADN. Para el lavado se agreg a nuestro
tubo 1 ml de etanol al 75% para el lavado de
las hebras de ADN y se desech el
sobrenadante con una micropipeta, este
procedimiento se realiz dos veces Se Re
suspendieron con 500 l de buffer TE 1x y se
dej as para su posterior anlisis
electrofortico.
Extraccin de RNA de sangre perifrica
Se obtuvo sangre por puncin venosa
y se coloc en un tubo con anticoagulante con
EDTA, se llev a centrifugar a 2500 rpm por 8
minutos, se extrajo la capa de leucocitos y se
transfirieron a un tubo cnico de 15 ml. Para
la lisis de los eritrocitos se agreg SLR fro
hasta completar 8 ml y se homogenizo por
inmersin cada 5 minutos durante los 15
minutos que fue colocado a incubar en hielo.
Se llevo a centrifugar a 3000 rpm durante 10
minutos para obtener el botn de leucocitos,
se desech el sobrenadante y se agreg SLR
para lavar los eritrocitos que hayan podido
haber quedado, esto se realiz dos veces
para u mejor lavado y finalmente se lav el
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botn con PBS estril. Se dej 100 l de
remanente del lavado con SLR para
resuspender los leucocitos, se transfiri a un
tubo para micro centrifuga y se le agrego el
Trizol el cual se lisaron las clulas por medio
de un pipeteo y se dej por 5 minutos a
temperatura amiente. Para evitar las
contaminaciones y perder nuestra muestra se
agreg 200 l de cloroformo, se reposo por 3
minutos a temperatura ambiente y se llev a
centrifugar 11000 rpm por 10 minutos, se
transfiri a un tubo para micro centrifuga en el
cual se formaron tres fases, de las cuales la
superior se encontraba el ARN. Se agregaron
500 l de isopropanol y dej reposar por una
semana, despus transcurrid la semana se
centrifug a 8000 rpm por 10 minutos y se
desech el sobrenadante Como ultimo lavado
se realiz con etanol al 75% y se llev a
centrifugar por 5 minutos a 8000 rpm el cual
se sedimento y el sobrenadante fue
desechado. La re suspensin se realiz con
agua esteril y se guard para su anlisis
electrofortico.
Electroforesis en gel de agarosa
Se prepar un gel de agarosa al 1%,
en el cual primero se derriti en un horno de
microondas hasta disolver completamente y
dejar enfriar un poco. Despus se le aadi 3
l de bromuro de etidio y se homegeniz.
Tambin fue colocado el peine para los
pozos. Finalmente se coloc en el plato de la
cmara evitando la formacin de burbujas.
Una vez solidificado se aadi a la cmara el
buffer de corrimiento TAE 10x y fue retirado el
peine. Se mezclaron las muestras de ADN y
ARN con los buffer de carga y fueron
depositados en los carriles correspondientes y
dejando el primero para colocar el marcador
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de peso molecular. Se aplic un voltaje de 75 Referencias

volts durante 30 minutos
Resultados
El resultado obtenido en el gel de agarosa fue
un poco dudoso, debido a que el corrimiento
de la muestra no fue el suficiente como para
tener un resultado muy representativo, lo que
se muestra en la figura 1 adems de que
algunas muestras de los dems equipos se
degradaron principalmente RNA.
1.-Lodish H, Berk A, Zipursky L, Matsudaira P,
Baltimore D, DarnellJ. Biologa Celular y
Molecular. 4ta Edicin. Buenos Aires: Editorial
Mdica Panamericana; 2002.
2.-Revista Nature Protocolos Aos 2009-2013.
Almonacid, C Pinilla G. Introduccin al anlisis
Bioqumico y a sus Mtodos de separacin.
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca.
2008
3- Chomczynski, P. 1993 A reagent for the single-
step simultaneous Isolation of RNA, DNA and
proteins from celland tissue sam-ples.
4.- Bio-Rad: protocolo que acompaa al
quantum Pre Miniprep Kit Nelson DL,Cox MM
(2001: principios de bioqumica. 3 ed. Editorial
Omega (Barcelona, Espaol).

Figura 1. Corrimiento de Gel de Agarosa con

muestras de DNA y RNA mas el Peso Molecular

Discusin y Conclusin
En cuanto a la extraccin de ADN y rna se
llev acabo en perfectas condiciones respecto
al procedimiento. Pero en cuanto se llev
acabo el corrimiento de la electroforesis,
podemos llegar a la conclusin que el ADN no
corri y ARN coro muy poco en cuanto al
control tambin se qued, referente a esto
podemos decir que en el gel de agarosa pudo
estar contaminado, la pureza del TAE, el poco
tiempo de corrimiento, el voltaje ya que solo
se qued en un solo voltaje.