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RIAA 1(1) 2010: 7-15 Revista de Investigacin Agraria y Ambiental

Variacin somaclonal y seleccin in vitro con toxinas


como herramienta en la bsqueda de resistencia a
enfermedades en plantas: Revisin
Carlos Patio Torres
cpatinot@yahoo.com
Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente.
Universidad Nacional Abierta y a Distancia CEAD Palmira, Colombia

Resumen.- La diversidad allica es un requisito fundamental para el xito de los programas de


fitomejoramiento. En casos en los que la reserva de genes es escasa existen varios mecanismos para
aumentarla artificialmente, incluyendo la obtencin de variantes somaclonales a travs de tcnicas de
cultivo de tejidos vegetales in vitro. La variacin somaclonal es un fenmeno natural que ocurre en los
procedimientos de cultivo de tejidos, a travs del cual pueden recuperarse mutantes con o sin ventajas
adaptativas. Cuando este fenmeno se utiliza para generar mutantes con caractersticas prediseadas,
a travs del uso de un agente de seleccin artificial, el proceso se denomina seleccin in vitro. Si lo
que se busca es producir material vegetal con resistencia y/o tolerancia a enfermedades, el agente de
seleccin puede ser el microorganismo etiolgico, sus partes, o sus productos metablicos, incluidas
sus toxinas. Consideraciones de costo, sencillez y eficacia, hacen que esta tcnica sea particularmente
apta para los pases en va de desarrollo. En este documento se revisan los fundamentos cientficos
que la sustentan.

Palabras clave: Cultivo de tejidos, Resistencia a enfermedades, Seleccin in vitro, Variacin somaclonal.

Allelic diversity is a fundamental requirement for successful plant breeding programs. When gene
pool is limited, several mechanisms are available for variability enrichment, for example, obtaining
somaclonal variants through in vitro techniques. Somaclonal variation is a natural phenomenon
that occurs in the procedures of plant tissue culture, through is possible to recover mutants with
or without adaptive advantages. When this phenomenon is used to generate mutants with specific
traits, through the use of an agent of artificial selection, the process is called in vitro selection. When
looking for generating plant material that is resistant/tolerant to diseases, the agent of choice may be
the causative organism, its parts, or its metabolic products, including toxins. Considerations of cost,
simplicity and efficiency, make this technique particularly suitable for developing countries. In this
paper, we review the scientific basis underpinning this method.

Key words: In vitro selection, Plant disease resistance, Plant tissue culture, Somaclonal variation.

Introduccin radas por las condiciones propias del cultivo


de tejidos y clulas in vitro, y las variaciones
Un hecho ampliamente reportado en los la- genticas verdaderas, producto de mutacio-
boratorios de cultivo de tejidos y micropropa- nes azarosas. En cualquier caso, el fenmeno
gacin vegetal, es que muchas plantas obteni- se conoce como variacin somaclonal.
das in vitro presentan diferencias fenotpicas,
morfolgicas o bioqumicas en comparacin Las variaciones epigenticas, debido a su na-
con el fenotipo de las plantas donadoras de turaleza, son inestables y se revierten con una
los explantes. Larkin y Scowcroft (1981), dis- alta frecuencia en las lneas celulares, sin que
tinguieron claramente dos tipos de causas: la haya consecuencias fenotpicas en las plan-
variacin epigentica transitoria, debida pro- tas regeneradas (Snchez-Chiang & Jimnez
bablemente a las condiciones de estrs gene- 2009). Por el contrario, la variacin somaclo-

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nal de origen gentico s se transmite y expresa costosos, y dependen de las fluctuaciones na-
en la descendencia de las plantas regeneradas. turales en la abundancia del inculo; por otro
Cuando esta capacidad intrnseca de variacin lado, estos mtodos estn condicionados a los
de los cultivos crecidos in vitro es potenciali- factores que influyen en la dispersin del pat-
zada a travs de la adicin de un agente de se- geno, la infeccin, el desarrollo y expresin de
leccin al medio de cultivo, es posible obtener la enfermedad (Borras et al. 2001). En compa-
variantes somaclonales con tolerancia a ese racin, la seleccin in vitro requiere menos es-
agente de seleccin; esta tcnica se denomina fuerzo y una menor implementacin logstica,
seleccin in vitro (Lestari 2006). adems de que, no se ve influenciada por las
complicaciones relacionadas con los factores
Aunque la variabilidad gentica es esencial epidemiolgicos que usualmente afectan los
para la creacin de plantas con caractersticas procedimientos de seleccin en campo.
agronmicas superiores, las mutaciones es-
pontneas ocurren con una frecuencia extre- Variacin somaclonal como
madamente baja; por esta razn las tcnicas fundamento de la seleccin in vitro
de induccin de variacin somaclonal consti-
tuyen una potente herramienta para lograr un El cultivo de clulas, tejidos y rganos vegeta-
rpido incremento en la variabilidad gentica les in vitro est generalmente asociado a varios
de las especies cultivadas (Okole et al. 2000). problemas de calidad fisiolgica, epigentica
En este procedimiento la presin de seleccin y gentica, como la recalcitrancia, la hiperhi-
puede ser aplicada a un nmero de clulas dricidad y la variacin somaclonal (Cassells &
considerablemente, evitando la seleccin de Curry 2001). Aunque esta ltima puede ser
plantas individuales en pruebas de campo indeseable en algunos casos, como cuando se
convencionales. El agente de seleccin puede requiere mantener la identidad clonal del ma-
ser de origen bitico o abitico (v.gr. metales terial propagado, tambin tiene implicaciones
pesados, sales, herbicidas, fitotoxinas, virus, importantes para los programas y estrategias
etc.), de acuerdo con los fines que se persigan de fitomejoramiento (Karp 1995, Jain 2001).
(Lestari 2006).
Existen varios factores que inciden en la ob-
En general, el tejido ms ampliamente usado tencin de variacin somaclonal (Karp 1995).
para la seleccin es el callo, aunque pueden Como regla general, entre mayor sea el nivel
utilizarse tambin otros explantes que con- de desorganizacin del tejido del explante y
ducen a una organognesis directa. El callo mayor el tiempo que ste pasa en la fase de
tiene la ventaja de ser producido fcilmente y cultivo in vitro, mayores sern las probabilida-
de que puede regenerarse potencialmente en des de generar variacin somaclonal. Esta va-
plntulas. Adems, la carencia de cutcula faci- riacin se ve influenciada por la constitucin
lita la toma de molculas pequeas tales como genotpica y los niveles de ploida del explan-
las fitotoxinas (Okole et al. 2000). te, por lo que si se considera un mismo grado
de ploida, algunos genomas pueden ser ms
La seleccin in vitro ha sido aplicada a varios estables que otros. El tipo y la concentracin
tipos de cultivos, en los cuales se han utilizado de reguladores de crecimiento en el medio
varios agentes de seleccin. En tomate ((Lyco- de cultivo influyen tambin en la generacin
persicon esculentum Mill.), por ejemplo, la se- de variacin somtica ya que stos pueden
leccin in vitro ha sido explotada con xito en actuar como mutgenos (especialmente los
la bsqueda de lneas tolerantes a varios tipos sintticos), o influir sobre la divisin celular,
de estrs biticos y abiticos como la presen- el grado de crecimiento desorganizado y la
cia de sales, drogas y fitotoxinas (Bhatia et al. proliferacin selectiva de tipos celulares espe-
2004). cficos. Por ltimo, generalmente se observa
que, entre ms viejo y ms especializado es el
Aunque las ventajas del mtodo de seleccin in explante, mayor es la posibilidad de recuperar
vitro pueden ser las mismas para todo fin, en el variacin en las plantas regeneradas. Jelenic
caso de la bsqueda de lneas resistentes a en- y colaboradores (2001) plantearon la impor-
fermedades sus beneficios son evidentes. Por tancia de las condiciones ambientales durante
un lado, los mtodos convencionales de mejo- el cultivo y la presencia o ausencia de agentes
ramiento que buscan la resistencia a enferme- selectivos in vitro, como generadores de varia-
dades son altamente demandantes de tiempo, cin.

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A nivel molecular, la ocurrencia de variacin tica. En primer lugar est el desbalance en la


somaclonal est asociada a mutaciones pun- reserva de nucletidos intracelulares que se
tuales, rearreglos y recombinaciones cromo- presenta durante el ciclo del cultivo in vitro.
smicas, metilacin del ADN, alteracin en En segundo lugar, hay diferentes formas de
el nmero de copias de segmentos de ADN, y recombinacin mittica que incluyen el en-
ocurrencia de elementos transponibles ( Jain, trecruzamiento somtico y el intercambio de
2001), estos aspectos se detallan a continua- cromtides hermanas y tambin no homlo-
cin. gas, los cuales podran producir varios de los
tipos de rearreglos cromosmicos observados
Citogentica de la variacin en cultivo de tejidos.
somaclonal
Elementos transponibles y
Se ha demostrado que la variacin somaclo- variacin somaclonal
nal est asociada a cambios cromosmicos de
diferente tipo y en diferentes niveles, y que es El hallazgo de elementos transponibles en
virtualmente ubicua para todas las especies cultivo de tejidos de maz, sugiri una posible
con protocolos de regeneracin en cultivo in relacin entre la variacin somaclonal y estos
vitro (Lee & Phillips 1988, Jain 2001). En un elementos mviles (Lee & Phillips 1988). Los
contexto general, los cambios incluyen aneu- elementos transponibles, en particular los re-
ploidias y euploidias de las clulas cultivadas trotransposones, son ubicuos dentro de los
y los regenerantes. A nivel estructural, se han genomas vegetales y pueden representar el
observado deleciones, adiciones, translo- 50% de la secuencia de stos (Kumar & Ben-
caciones, inversiones e incluso fusiones de netzen 1999), o hasta el 90% en especies con
cromtidas no homlogas. Los cambios ms un muy alto contenido de ADN, pero con un
frecuentes en la mayora de las especies son nmero similar de genes (Heslop-Harrison et
los de tipo estructural, y dentro de estos, los al. 1997).
que involucran prdida de cromatina (Lee &
Phillips 1988). Cualquiera que sea el tipo de Datos de hibridacin in situ sobre cromosomas
modificacin estructural, siempre requiere la metafsicos y sobre el ncleo profsico han re-
ruptura de la cromatina y en algunos casos el velado que secuencias de retrotransposones
intercambio y unin de las molculas. tales como el Ty1-copia 19 estn dispersos a
todo lo largo de la eucromatina, algunas veces
Se ha demostrado que estos eventos de rea- aleatoriamente y otras no aleatoriamente de-
rreglos y deleciones cromosmicos pueden pendiendo de la especie vegetal y del tipo de
involucrar cromosomas especficos o regiones elemento mvil estudiado (Heslop-Harrison
especficas dentro de los mismos, las cuales et al. 1997). Sin embargo, muchos elementos
habitualmente incluyen segmentos de hetero- estn presentes en muy poca cantidad o au-
cromatina (Lee & Phillips 1988). El hecho de sentes en ciertas regiones (v.gr., centrmeros,
que la variacin somaclonal est asociada con regiones heterocromticas intersticiales y ter-
las regiones heterocromticas, puede deberse minales y sitios de ADN ribosomal) (Kumar
a que stas presentan una replicacin tarda & Bennetzen 1999).
en la fase S (Turner 2001), que puede pro-
piciar fallas en los mecanismos de regulacin Los retrotransposones, al igual que los elemen-
de la transicin entre las fases S y M del ciclo tos transponibles, pueden generar mutaciones
celular (Lee & Phillips 1988). Sin embargo, insertndose dentro o prximos a los genes.
aunque varias investigaciones sugieren que Ms an, los retrotransposones inducen mu-
genomas con mayor contenido de heterocro- taciones que son relativamente estables dado
matina generan ms variantes somaclonales que ellos se transponen va replicacin, rete-
que aquellos con un contenido menor; otras niendo la secuencia en el sitio de insercin.
han demostrado una relacin inversa entre el Estas mutaciones pueden ser causa de inacti-
contenido de heterocromatina y la variacin vacin gnica o alteraciones en los patrones de
somaclonal (Karp 1995). expresin de los genes, o de la estructura de las
protenas que codifican (Kumar & Bennetzen
Lee y Phillips (1988) propusieron otros me- 1999). De hecho, se debe esperar que geno-
canismos citolgicos que podran causar o mas que portan elementos transponibles sean
hacer parte del proceso de variacin som- ms inestables en cultivo in vitro que aquellos

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que no los poseen, o los tienen en menor can- los niveles de ROS se incrementan bajo con-
tidad (Karp 1995). diciones de estrs. Las prcticas de corte del
En este sentido, existe evidencia suficiente de explante al inicio del cultivo in vitro y en los
que un porcentaje significativo de las muta- subcultivos posteriores pueden por s mismas
ciones en las plantas manipuladas in vitro son generar estrs oxidativo, de la misma forma
debidas a la activacin inducida de retrotrans- en que lo hacen el hipoclorito y/o las sales de
posones durante el proceso de cultivo de clu- mercurio que se utilizan en la esterilizacin de
las y tejidos (Kumar & Bennetzen 1999). Sin los tejidos (Cassells & Curry 2001).
embargo, Kubis y colaboradores (2003) clo-
naron por PCR fragmentos de retroelemen- El dao oxidativo en el cultivo de tejidos pue-
tos del grupo gipsy y del grupo LINE y de los de expresarse como hipermetilacin o hipo-
transposones En/Spm, a partir del genoma de metilacin del ADN, cambios en el comple-
palma de aceite, sin encontrar diferencia en la mento cromosmico incluyendo poliploidas
organizacin genmica de las diferentes clases y aneuploidas, rompimiento de las hebras
de elementos transponibles entre palmas pro- cromosmicas, rearreglos cromosmicos y
venientes de semillas (parentales) y aquellas deleciones y substitucin de bases nucleotdi-
regeneradas mediante cultivo de tejidos que cas (Cassells & Curry 2001).
presentaban una morfologa anormal y aborto
floral. Metilacin epigentica del ADN
Papel de las especies reactivas de y variacin somaclonal
oxgeno (ROS) en la variacin Varios reportes en los ltimos aos han mos-
somaclonal trado una correlacin entre la hipermetilacin
de residuos de citosina en el ADN, prximo o
Las ROS son otra causa de variacin somaclo- dentro de los genes o los promotores gnicos,
nal, ya que su influencia sobre el ciclo celular y los niveles reducidos de expresin gnica
puede resultar en la generacin de mutacio- (Kubis et al. 2003). La acetilacin de histonas
nes por el dao oxidativo que ejercen sobre el y la metilacin del ADN trabajan en combina-
ADN nuclear y organelar, a travs de un poten- cin para regular la transcripcin epigentica-
cial redox celular alterado (Cassells & Curry mente ( Joyce et al. 2003).
2001). Son sustancias que se originan como
subproductos de las rutas metablicas norma- Kubisy colaboradores (2003) encontraron
les de la planta, especialmente en las reaccio- que en la palma de aceite la variacin somaclo-
nes fotosintticas y de respiracin. El sistema nal estuvo asociada a un nivel y patrn diferen-
de transporte de electrones de la fotosntesis te de metilacin de las secuencias del ADN.
tiene el potencial para producir especies acti- Durante el cultivo de tejidos, la digestin con
vas como el singlete de oxgeno y el radical su- la endonucleasa de restriccin McrBC revel
perxido. Esta ltima molcula puede a su vez una reduccin a lo largo de todo el genoma
generar perxido de hidrgeno (Arora et al. en la metilacin del ADN, la cual se restaur
2002). Aunque el radical superxido y el pe- prcticamente a los niveles normales en los
rxido de hidrgeno son relativamente poco rboles regenerados. Los anlisis con HPLC
peligrosos, en presencia de iones de hierro o mostraron que los niveles de metilacin eran
iones de cobre producen el radical hidroxilo, levemente ms bajos en los rboles regenera-
muy reactivo sobre los sustratos orgnicos dos comparados con la planta parental. Los
(Arora et al. 2002). En presencia de estos mis- autores concluyen as, que la alteracin en la
mos iones, las ROS tambin pueden generar metilacin del ADN es una posible causa de
molculas altamente mutagnicas, tales como una expresin gnica anormal (Kubis et al.
los radicales peroxil y alcoxil (Cassells & Cu- 2003).
rry 2001).
Bajo condiciones fisiolgicas normales, los Utilizacin de fitotoxinas en
efectos y potenciales daos de estas especies programas de seleccin in vitro
qumicas son controlados por sistemas en- para resistencia a enfermedades
dgenos que involucran enzimas y diferentes
sustancias antioxidantes que mantienen la Cuando se pretende llevar a cabo un progra-
homeostasis de la clula vegetal. Sin embargo, ma de seleccin in vitro para resistencia a en-

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fermedades en plantas, los explantes deben Sin embargo, el examen de los sntomas de
someterse a la accin de uno o ms agentes una enfermedad puede hacer presumir que
que hagan presin de seleccin sobre las clu- una toxina est implicada en la patognesis.
las en la etapa de cultivo. Estos agentes pueden El amarillamiento, la marchitez, las lesiones
incluir las clulas mismas del patgeno, filtra- de colores brillantes y la necrosis, son causa-
dos de cultivo, o sustancias purificadas que das generalmente por toxinas. Adems, si los
tengan papeles esenciales en el proceso pato- sntomas se producen en sitios alejados del
gnico. Entre estas ltimas, las fitotoxinas han sitio de infeccin (penetracin) del patgeno,
sido ampliamente utilizadas, particularmente puede sospecharse muy fuertemente que una
cuando se trata de enfermedades fungosas ya fitotoxina est involucrada en el desarrollo de
que muchos hongos producen toxinas que la enfermedad (Strobel 1982).
pueden desactivar las funciones celulares del
hospedero o matar a las clulas husped antes Cuando se tienen en cuenta las actividades y
de la infeccin o durante una etapa necrotr- efectos biolgicos, antes que sus cualidades
fica. Por esta razn, los ensayos de seleccin estructurales, se reconocen dos grandes gru-
normalmente implican la evaluacin previa de pos de toxinas: Las toxinas especficas o selec-
la fitotoxicidad (Patio 2010). tivas de hospedero y las toxinas no especficas
o no selectivas de hospedero (Yoder 1980, Lu-
Yoder (1980) defini las fitotoxinas como me- cas 1998). Las primeras fueron descritas por
tabolitos producidos por el patgeno, que son Pringle y Scheffer (1964) como productos
requeridos para que ocurra la enfermedad o metablicos de un microorganismo patgeno
que, aunque no estn implicados en el inicio que son txicos nicamente para un hospede-
de la enfermedad, son requeridos como com- ro determinado y son determinantes del rango
ponente parcial para su desarrollo. En conse- de hospederos y/o de la especificidad del pa-
cuencia, segn existen fitotoxinas requeridas tgeno (Walton 1996, Osbourn 2001, Thom-
para la patogenicidad y fitotoxinas requeridas ma 2003). Por su parte, las toxinas no selec-
para la virulencia. Cuando actan como factor tivas de hospedero son producidas tanto por
de patogenicidad (entendida sta como un hongos como por bacterias fitopatgenas y su
criterio cualitativo), la toxina es esencial para principal cualidad es que afectan un amplio
que el patgeno cause la enfermedad, en tanto rango de especies vegetales, incluso aquellas
que cuando actan como factor de virulencia que el organismo productor de la toxina nor-
(entendido como un trmino cuantitativo) la malmente no infecta. Estas toxinas contribu-
toxina incrementa la extensin de la enferme- yen a la virulencia o al desarrollo de sntomas
dad (Mitchell 1984). Segn Lucas (1998) las en la enfermedad, pero por definicin las toxi-
fitotoxinas tienen dos propiedades importan- nas no selectivas no son determinantes prima-
tes, tienen actividad a muy bajas concentracio- rios del rango de hospedero (Walton 1996).
nes y son mviles dentro de la planta por lo
que pueden actuar a distancia desde el sitio de Ensayos de fitotoxicidad
infeccin.
A pesar de ser semicuantitativa, la prueba cr-
Como grupo, estas toxinas no tienen caracte- tica de la fitotoxicidad de una sustancia es la
rsticas estructurales comunes. Pertenecen a induccin de sntomas completos o parcia-
clases tan diversas como pptidos u otros de- les de la enfermedad, los cuales se presentan
rivados de aminocidos, terpenoides, glicsi- despus de la aplicacin de tal sustancia a los
dos, fenoles, derivados de poliacetato -pirona tejidos intactos o lacerados del hospedero, un
y polisacridos, o una combinacin de estas ejemplo de esto es la aparicin de necrosis y
y otras clases de molculas (Strobel 1982). clorosis cuando la toxina se inocula en las ho-
Cmo y en qu nivel influyen estas toxinas jas (Strobel 1982). Otros bioensayos tiles
en el proceso de patognesis para un patosis- para probar la toxicidad son la inhibicin de
tema particular es materia de debate perma- la germinacin de semillas y la inhibicin del
nente dado su alto grado de heterogeneidad crecimiento radical ( Jayasankar et al. 1999,
estructural y funcional, debido tambin a que Walton 1996).
el estado de enfermedad es un proceso suma-
mente complejo del que no se conocen todos Los ensayos cuantitativos son aquellos en los
los detalles a nivel bioqumico, fisiolgico y cuales la lesin causada por la toxina es medi-
molecular. da directamente y usualmente son preferidos

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para la evaluacin del efecto de la toxicidad. acuerdo con su tamao molecular, ya sea por
Por ejemplo, la alteracin del plasmalema pue- precipitacin con solvente o cromatografa so-
de medirse por la liberacin de electrolitos o bre filtros moleculares. Para las toxinas de me-
la depolarizacin de la membrana (Strobel nor tamao, puede usarse la extraccin directa
1982). Estas aproximaciones cuantitativas y con solventes y la subsiguiente purificacin
semicuantitativas son vlidas tanto para toxi- con HPLC u otras tcnicas cromatogrficas
nas selectivas como no selectivas de hospede- (Strobel 1982).
ro ( Jayasankar et al. 1999, Walton 1996).
Una vez hecho esto, el paso siguiente es com-
Uso de toxinas para la generacin de probar la actividad biolgica de la toxina en el
materiales vegetales con resistencia tejido de la planta para la cual se busca resis-
a enfermedades tencia. Borras y colaboradores (2001) encon-
traron una correlacin directa entre la con-
En 1973, Carlson demostr por primera vez centracin de filtrado de cultivo de Fusarium
que las clulas y protoplastos vegetales po- subglutinans y el rea necrosada de segmentos
dran ser seleccionados en cultivo para resis- foliares de variedades susceptibles de pia,
tencia a toxinas de patgenos y que podan inoculados con los filtrados. Demostraron
regenerarse plantas con una respuesta alterada adems que el filtrado necrosaba el tejido fo-
a la infeccin por el patgeno a partir de estas liar de variedades resistentes, pero en una pro-
clulas cultivadas in vitro (Daub 1986, Jaya- porcin menor que el de las variedades sus-
sankar & Gray 2003). ceptibles. Segn los autores, este ltimo punto
demostrara que el cido fusrico, principal
La seleccin in vitro usando fitotoxinas puede componente del filtrado, tiene un compor-
ofrecer una alternativa a la seleccin en campo tamiento no especfico sobre variedades sus-
como se ha demostrado para varias interaccio- ceptibles y resistentes. Una vez comprobada
nes planta-patgeno y puede permitir la selec- la actividad fitotxica, el filtrado que contiene
cin de caractersticas importantes en la resis- la toxina o la toxina purificada, es usado como
tencia a enfermedades a travs de la seleccin agente de seleccin e incluido en el medio de
de somaclones (Dugdale et al. 2000, Borras et siembra para el cultivo in vitro del explante de
al. 2001). Se han desarrollado varios protoco- la planta a seleccionar. Bajo estas condiciones
los eficientes de seleccin para resistencia a va- puede esperarse que slo las clulas que han
rios patgenos de plantas usando filtrados de adquirido resistencia a la toxina crezcan y se
cultivo y toxinas purificadas en experimentos dividan y sin stas las que se seleccionan para
de seleccin (Patio et al. 2007), en los que la los protocolos de regeneracin. El mecanismo
sensibilidad de la planta a la toxina y una evi- que subyace a la aparicin de este nuevo esta-
dencia de la susceptibilidad de la planta intac- do de resistencia en el material previamente
ta al patgeno, son requisitos para el xito. susceptible, es la variacin somaclonal.

Un mtodo de seleccin para resistencia es la Existen varios ejemplos de la aplicacin de


seleccin en un solo paso, en la cual se agrega toxinas y otros factores de estrs como agen-
una concentracin letal del agente selectivo al tes de seleccin en los cuales se han obtenido
medio de cultivo; otro mtodo es la seleccin evidencias de resistencia originada por varia-
paso a paso, en la cual la concentracin del cin somaclonal. En la berenjena, una especie
agente selectivo se incrementa gradualmente, de solancea, se han obtenido variantes so-
hasta que se llega a una concentracin letal maclonales con resistencia a enfermedades y
(Borras et al. 2001). con tolerancia a la salinidad (Collonnier et al.
2001). Nyange et al. (1995) generaron proto-
Dando por supuesta la existencia de un proto- plastos y clulas con resistencia a Colletotri-
colo de regeneracin de la especie vegetal, la chum kahawae en plantas de caf; Jayasankar
primera etapa en el procedimiento es el aisla- y colaboradores (1999) encontraron que cul-
miento y purificacin de las toxinas involucra- tivos embriognicos de mango seleccionados
das. Las fitotoxinas pueden aislarse de los pa- contra el filtrado de cultivo o fitotoxinas de
tgenos cuando stos crecen bajo condiciones C. gloeosporioides, presentaron una resistencia
de cultivo y una vez que el parsito se remueve aumentada contra el patgeno y expresaron
del medio de cultivo por filtracin o centrifu- nuevas protenas relacionadas con la patog-
gacin, las substancias pueden separarse de nesis in vitro. Ejemplos adicionales se dan en

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Jayasankar y Gray (2003), Jayasankar (2005) rpida y eficaz de variantes genticos vs. va-
y Lestari y colaboradores (2006). riantes epigenticos; e) no requiere de insu-
mos o infraestructura especializada y f) es una
Perspectivas tcnica bien sustentada cientficamente.

La seleccin in vitro ha sido ampliamente uti- En cuanto a los fines, la tcnica se adapta f-
lizada a nivel mundial para la produccin de cilmente a las siguientes necesidades: a) gene-
germoplasma vegetal resistente o tolerante a racin de germoplasma resistente/tolerante a
enfermedades ( Jayasankar & Gray 2003) y factores de estrs abitico (v.gr. estrs hdrico,
limitantes abiticos ( Jayasankar 2005, Les- salinidad, metales pesados), condicin que ge-
tari 2006). Sin embargo, ha sido subutilizada neralmente tiene una base gentica compleja;
en Colombia y Latinoamrica, segn puede b) seleccin directa de mutantes con toleran-
verse al hacer una bsqueda de literatura so- cia y/o resistencia a factores biticos con base
bre el tema en la base de datos latinoameri- gentica monognica; c) generacin de orna-
cana Scielo (www.scielo.org). Los reportes mentales con caractersticas novedosas (v.gr.
encontrados evidencian el uso de la tcnica en tamao, color, textura) y d) estudio y anlisis
Brasil y Colombia, con esfuerzos dirigidos a de los mecanismos de interaccin molecular
entre las clulas de las plantas y los fitopat-
la obtencin de material vegetal con toleran- genos, as como las respuestas de las clulas
cia a la salinidad (Ulisses et al. 2000, Ulisses vegetales a los estrs abiticos.
et al. 2002, Barroso et al. 2003), a altos niveles
de aluminio (Dantas et al. 2001) o a fitopat-
genos (Patio et al. 2007, Gomes-Oliveira & Discusin y Conclusiones
Matsumura 2001).
La variacin somaclonal es el resultado de
En la regin, y particularmente en Colombia, eventos aleatorios, genticos o epigenticos,
existen laboratorios y un recurso humano alta- que ocurren durante el proceso de cultivo de
mente calificado en las diferentes tcnicas de tejidos y que modifican el fenotipo de las plan-
cultivo de tejidos y resulta sorprendente que tas y/o tejidos regenerados. Aunque tal varia-
esta tcnica no haya sido adoptada con mayor cin en el fenotipo puede tener consecuencias
frecuencia pese a sus ventajas. Las considera- indeseadas en algunos casos, en otros consti-
ciones sobre los aspectos financieros, logsticos tuye un mtodo prctico para generar variabi-
y ambientales asociados, permiten considerar lidad en el reservorio gentico de la mayora
a la seleccin in vitro como una herramienta de las especies vegetales.
oportuna y particularmente apta para las con- Los mecanismos responsables de la variacin
diciones socioculturales y econmicas de los somaclonal varan desde la prdida de seg-
pases en va de desarrollo; en tal sentido, los mentos cromosmicos hasta cambios nucleo-
grupos de investigacin en biotecnologa agr- tdicos puntuales y cambios en los patrones de
cola del pas, adscritos a entidades de carcter metilacin del ADN. Sin embargo, en la mayo-
pblico y privado, deberan evaluar sus poten- ra de los casos las causas son multifactoriales.
cialidades y considerar su implementacin. Aunque el fenmeno es inherente al pro-
cedimiento de cultivo de tejidos, la tasa de
Como punto de partida en este sentido, la tc- aparicin de variantes somaclonales puede
nica de seleccin in vitro tiene algunas venta- incrementarse a travs del uso de sustancias
jas que hacen que su uso sea recomendable: a) que ejercen una presin de seleccin sobre el
no implica tcnicas de manipulacin gentica explante y de esta forma, obtener clulas con
molecular; b) permite la manipulacin simul- adaptacin al agente de seleccin. Si ste es
tnea de un nmero prcticamente ilimitado una fitotoxina, pueden obtenerse, en teora,
de clulas en un solo ciclo de seleccin, lo que plantas con algn grado de resistencia o tole-
aumenta la probabilidad de obtener algn mu- rancia al patgeno productor de la toxina. Esta
tante con una respuesta fenotpica adecuada a prctica se denomina seleccin in vitro.
los fines del mejoramiento; c) existen proto-
colos de regeneracin in vitro efectivos para Debido a su bajo costo, sencillez y eficacia,
muchas especies de importancia econmica, ste es un proceso biotecnolgico de amplio
lo que garantiza una aplicabilidad amplia de potencial para los pases del trpico, en espe-
la tcnica; d) hay disponibilidad de muchas cial para su aplicacin en germoplasmas con
tcnicas moleculares para una discriminacin reservas genticas estrechas.

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Recibido: 4 de junio de 2010


Aceptado: 12 de julio de 2010

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