PRCTICA DE COPROCULTIVO

Qu es un Coprocultivo?

El coprocultivo es un estudio clnico que pertenece al rea de bacteriologa y que consiste

en hacer un cultivo de heces fecales de los pacientes que presenten alguna infeccin en el

tracto gastrointestinal.

Por qu se necesita hacerlo?

Para identificar el agente causal del cuadro entrico y tratarlo con el antibitico adecuado,

en caso de que corresponda hacerlo. No todos los patgenos intestinales se deben tratar

con antibiticos, ya que algunos cuadros se autolimitan.

OBJETIVO

Identificar las posibles especies patgenas de microorganismos presentes en las vas

gastrointestinales (Heces) a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas.

FUNDAMENTO

La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia.

Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (Bacteroides, bcilos

gram positivos, Estreptococos), microorganismos entricos gran negativos

y Enterococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces

implica la separacin de las especies patgenas, usualmente a travs del empleo de

medios selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos. Las principales causas de

trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las toxinas (de:

Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos entricos gran negativos invasores,

los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias.

La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes

del mundo.

Las heces y los raspados rectales son los especimenes de que se dispone con mayor

facilidad. Debe anotarse, en el examen macrocpico la presencia de sangre, moco o

helmintos en la inspeccin inicial. Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo

como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios as como en medios

selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para

permitir la separacin de los bacilos gran negativos que no fermentan la lactosa de otras

bacterias entricas comunes.

Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos

microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse

para diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que

deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en

la muestra como son las pruebas bioqumicas.

3. MATERIAL

Agua destilada Tubos de ensayo Asa de siembra

Gradilla desechable y normales

 Hisopo Alcohol Cubreobjetos

Papel de filtro Algodn graso Microscopio

Pipetas de vidrio Vaso de precipitado Cubeta de tincin

Medios de cultivo Mechero Bunsen Pinzas de madera

Pinzas metlicas Portaobjetos Frasco lavador

3.2 Reactivos:

Medios de cultivo para aislamiento:

Agar sangre

Agar Mc Conkey

Agar entrico Hektoen (HK)

Medios para pruebas bioqumicas:

- Agar Christensen

- KIA

-Kligler

-Citrato de Simmons

Colorantes para tincion de Gram: lugol, cristal violeta, fucsina bsica, alcohol

Lugol o Negro sudn

3.3 Muestras:

Muestra: heces de adulto.

4. PROCEDIMIENTO

El procedimiento fue el siguiente:

1. Recogida de la muestra

Preparacin o indicaciones del paciente:

Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas.

a. Para nios/as

Para bebs y nios pequeos que usan paales:

Se puede cubrir el paal con un envoltorio plstico. Si se coloca correctamente el

envoltorio plstico, separando las heces de la orina, se puede evitar que stas se mezclen

con el fin de obtener una muestra mejor.

b. Para adultos

Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la ayuda

de un envoltorio plstico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar

con el asiento. Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para

recoleccin de la muestra trae una gasa especial que se usa para recogerla y luego se

coloca la muestra en un recipiente limpio (Zetune, Prez, & Gonzlez)

B. Condiciones para la toma de muestras

Heces que no tengan ms de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente

del recto con un hisopo de algodn. Cuando las siembras no se pueden efectuar de

inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar

aproximadamente 1g de heces en 1 ml de un lquido conservador, o bien, depositar en

ste el hisopo rectal

 Muestra de heces de 12 o 24 hrs.

Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la

esterilidad. El anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la

muestra en el frigorfico a 4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir

un volumen igual al de las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial.

C. Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio.

- Evitar contaminacin por material no estril.

- Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.

- Etiquetar muestra adecuadamente.

- Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana.

2. Examen macroscpico de la muestra

Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin

digerir.

3. Examen y en fresco.

Observacin en el microscopio: lugol- fresco:

En fresco: Colocamos una gota diluida en agua destila de la muestra en un portaobjetos y

colocamos un cubre encima.

Se realiza una dilucin en un tubo de ensayo con una pequea cantidad de heces recogida

con la ayuda de un asa de siembra desechable y se le aade un poco de agua destilada, se

agita un poco y se obtiene una gota de esta dilucin. Dicha gota la colocamos en un
portaobjetos y aadimos una gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima

para su posterior observacin al microscopio (Magallanes, 2013)

Otro mtodo de observacin es realizando el mismo procedimiento pero sustituyendo el

lugol por el negro sudan. Esta tincin est indicada para la observacin de grasa.

Prueba de parasitologa:

Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parsitos.

En nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una

sintomatologa como diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores clicos,

elevacin de eosinfilos en sangre u otros sntomas.

En el examen de parasitologa se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se agrega

una gota de lugol.

Con un bote de muestra colocar una gasa y aadir 50 ml de suero fisiolgico para poder

filtrar dicha muestra. Al liquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de

centrifuga y se centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos

el sedimento que observaremos con una gota de lugol aadida para poder observar mejor

(Flores & Ramrez, 2012)

4. Realizacin de medios de cultivo y siembra

1. Medios de cultivo utilizados y su utilidad.

Medios de aislamiento

-Agar Mac Conkey

Aislamiento de bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos. diferencia

bacterias que utilizan o no, lactosa.

-Agar entrico Hektoen

Medio diferencial para aislamiento y diferenciacin de gram-negativos entricos

(Salmonella y Shigella spp)

Pruebas bioqumicas

-Agar Christensen

Diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. Identificar bacterias que

hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o cido

sulfhdrico.

Para la realizacin del medio Christensen, le aadimos 50ml al medio con la tcnica de

barry, para realizar la prueba de la ureasa.

-Agar de hierro y triple azucar (agar TSI)

Para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa y

sacarosa, as como a su capacidad de producir cido sulfhdrico, lo cual permite el

reconocimiento y exclusin del gnero Proteus.

-Agar citrato de Simmons

Para identificacin biqumica de Enterobacterias en base a la utilizacin del citrato como

nica fuente de carbono

6. Siembra e inoculacin de placas

Se procede a realizar la siembra, en estra mltiple, con la ayuda de un asa de siembra,

tomando una pequea cantidad de incculo de las heces, previamente diluido en suero,
teniendo en cuenta de trabajar en condiciones lo ms aspticas posibles. Se tapa la placa

y se mete en la estufa en un periodo de 24-48 horas.

Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscpicamente

y al microscopio.

Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada

microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma,

tamao, textura, olor, brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes

enteros, estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubacin necesario para

que aparezcan las colonias tambin puede tener valor en la identificacin. Las

caractersticas de las colonias tampoco ofrecen un diagnstico por si solas, pero dirigen

los esfuerzos hacia un grupo ms o menos amplio de microorganismos.

Hay colonias muy caractersticas, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso

de las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo

muy caracterstico.

Examen microscpico

Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa

de Petri y se obtiene una pequea muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca en

un porta previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la

muestra lo podremos realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y

cuidando de no quemarnos lo haremos con la ayuda de una pinza de madera.

A continuacin se procede a teir la muestra (Arambula, 2012)

Tincin azul de metileno:

El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el porta

por el mechero varias veces. Luego se tie con el azul de metileno cubrindola entera.

Pasado 5 min. Se lava con agua destilada se deja secar y se proceder a observar en el

microscopio con aceite de inmersin y en el objetivo de 100x.

Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. As:

Presencia de leucocitos: La infeccin ha cursado con inflamacin intestinal. Se trata por

tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella.

ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamacin por lo que la infeccin

puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas (Vibrio

cholerae).

Para realizar la tincin de Gram:

Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con

tres colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca despus en la cubeta

para proceder a teirla.

Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de lugol, 30 seg y 1 min de

fucsina bsica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante adems del alcohol

y se deja secar.

Esta tincin nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram segn sea la

composicin de su pared y apreciar visualmente su forma y organizacin (Lpez,

Hernndez, Coln, & Pea, 2014)

Realizacin de pruebas bioqumicas

Prueba KIA

Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C durante 18-

24 horas. Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la capacidad que

tienen las enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, produccin de

gas y de cido sulfhdrico.

B-GALACTOSIDASA

Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la

realizaremos preparando una suspensin densa del microorganismo en un tubo donde

aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para despus aadir el disco de ONPG.

Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el resultado.

OXIDASA

Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa

descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o

anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la

colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reaccin que produce cambiando

de color (Fernndez, Garca, & Sez, 2016)

CATALASA

Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un

portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno observando si produce

o no burbujas.

UREASA

Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo

inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una incubacin

a 37C con un cambio de color del indicador (Len, Chanqueo, & Garca, 2015)
5.RESULTADOS

EXAMEN MACROSCOPICO DIRECTO DE LA MUESTRA

Cantidad: 13.20

Color: marrn oscuro

Olor: fecaloideo

Consistencia: dura y consistente

Forma: cilndrica

Presencia de:

- moco: no

- sangre: no

- pus: no

- fragmento de carne: no

- fragmento de fcula: si

- trozos de mucosa epitelial: no

- falsas membranas: no

OBSERVACIN MICROSCOPIO EN FRESCO Y CON LUGOL

- En fresco: Morfolgicamente se observan microorganismos Bacilos.

- Lugol: Se observa almidn tiido de un suave color lilceo. No se observan parsitos.

EXAMEN MORFOLGICO DEL CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS

CULTIVADAS MACROSCPICAMENTE Y AL MICROSCOPIO

- Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscpicamente y

al microscopio:
1. Agar sangre: Colonias redondas, borde entero, circular, color blanquecino.

2. Christensen: Colonias redondas, circular, convexa.

3. Kia: Se observa produccin de cido en todo el tubo, burbujas, agrietamiento e incluso

desplazamiento del medio.

4. McConkey: Colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y en

caso de que fueran colonias sin color sera el caso contario.

5. Hecktoen: No creci nada en este medio en 24 horas puede ser debido a un periodo de

incubacin insuficiente o a la siembra con inoculo muy diluido.

6. Kigler: La fermentacin de lactosa y sacarosa se observa en la superficie y la de

glucosa en el fondo del medio con formacin de cido, se manifiesta por cambio de color

del Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo. La combinacin de citrato

frrico de amonio y tiosulfato de amonio permite la deteccin de sulfuro de hidrgeno

por la formacin de un precipitado negro.

7. Citrato de Simmons: El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico del medio.

Cuando las bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia el color inicial

verde.

TINCIONES

Con la tincin de Gram detectamos el tipo de bacteria que es, gracias a la diferenciacin

de su morfologa.

Observacin morfolgica

AZUL DE METILENO

AGAR SANGRE
- Se observan diferentes agrupaciones de cocos: cocos, diplococos, ttrada, estreptococos,

estafilococos.

McCONKEY

- Se observa agrupaciones de bacilos teidos de azul por el azul de metileno.

CHRISTENSEIN

- Se observan agrupaciones de cocobacilos teidos de azul por el azul de metileno.

TINCION DE GRAM

CHRISTENSEIN

- Se observan agrupaciones de cocobacilos Gram +.

McCONKEY

- Se observan agrupaciones de bacilos Gram , algunos presentan puntos de color azul

en la zona terminal del bacilo. Esto puede ser debido a que se estuvieran dividiendo por

lo que al romperse la capa externa de peptidoglicano se pudo teir con el colorante de

violeta de genciana. Tambin pueden ser restos de este mismo colorante al realizar la

tincin.

AGAR SANGRE

- Se observan cocos gram negativos (rosados) en su mayora, pero tambin se pueden

observan algunos color azul del colorante violeta de genciana.

 BIBLIOGRAFA

Arambula, A. (2012). La Coloracin de Gram. Revista de la universidad industrial de

Santander, 27-30.

Fernndez, A., Garca, C., & Sez, J. (2016). Metodos de identificacin bacteriana en el

laboratorio. Procedimientos de microbiologa, 37-41.

Flores, G., & Ramrez, B. (2012). Bacteriologa. Obtenido de

http://fgyrbmesa3.blogspot.com/2010/05/coprocultivo.html

Len, E., Chanqueo, L., & Garca, P. (2015). Evaluacin del rendimiento del coprocultivo

en pacientes hospitalizados. Revista chilena de infectologa, 58-62.

Lpez, L., Hernndez, M., Coln, A., & Pea, S. (2014). Las tinciones bsicas en el

laboratorio. Investigacin en Discapacidad, 10-18.

Magallanes. (2013). PROCEDIMIENTOS MICROBIOLGICOS. Obtenido de

https://procedimientosmicrobiologicos.wikispaces.com/COPROCULTIVO

Zetune, S., Prez, E., & Gonzlez, A. (s.f.). Coprocultivo. Universidad del Valle de

Mxico, 2-9.