UNPRG

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA DE MICROBIOLOGA & PARSITOLOGA

df

Almna. Ravines Arriaga Carla Alejandra | Microbiologa de Alimentos I | 2 de octubre del 2017
 PRCTICA N 04
MTODO DIRECTO DE DETERMINACIN DE
MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS VIABLES

I. INTRODUCCIN
El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y nmero de
microorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno
de los mtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero exacto de
microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los mtodos
bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorganismos:

a) Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas viables (entre
las que se encuentran el metodo de la placa vertida, el de superficie y el de goteo).
b) Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como clculo estadstico
del nmero de clulas viables.
c) Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables
con capacidad reductora.
d) Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para las no
viables.

El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero

de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los
recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes factores:

Mtodo de muestreo utilizado.

Distribucin de los microorganismos en la muestra.
Naturaleza de la microflora del alimento.
Naturaleza del alimento.
Antecedentes del alimento.
Adecuacin nutricional del medio de cultivo.
Temperatura y medio de incubacin.
pH, aw, potencial de xido reduccin del medio.
Tipo de diluyente utilizado.
Nmero relativo de microorganismos en la muestra.

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se

desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento
e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no
pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje
aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se

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 puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la
atmsfera, la composicin del medio y el tiempo de incubacin.

El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio:

de -34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres
grupos:
1. Psicrtrofos. Los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya
temperatura.
2. Mesfilos. Los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de
crecimiento est entre 30 40 C.
3. Termfilos. Los que crecen por encima de los 45 C.

En el grupo de los mesfilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y

levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este
recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las
condiciones higinicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos
no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera
un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Ahora bien, salvo en
alimentos obtenidos por fermentacin, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:
Excesiva contaminacin de la materia prima.
Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin.
La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos.
La inmediata alteracin del producto.

II. OBJETIVOS
Conocer los mtodos para determinar el nmero de microorganismos viables
Realizar un recuento de bacterias mesfilas viables en los alimentos como un
indicador microbiano de la calidad del alimento

III. MATERIALES
Medio de cultivo Plate Count
Diluyente: agua peptonada al 0.1%
Placas
Tubos de dilucin
Frasco o matraz
Anza calibrada
Pipetas
Mechero Bunsen
Licuadora
Balanza
Contador de colonias
Esptula de Drigalsky

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IV. PROCEDIMIENTO
1. Mtodo de profundidad:

Preparar la muestra de alimento traida segn su tipo, si es lquido hay que homogenizar,
si es slido hay que licuar o triturar la mezcal por trituracin en un vaso esterilizado de
licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90
segundos.

Luego preparamos las diluciones correspondientes, generalmente hacemos 6 diluciones

(de 10-1 a 10-6).

Pasamos

9 mL. 9 mL. 9 mL. 9 mL. 9 mL.

DAP DAP DAP DAP DAP

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10 g de
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
muestra + 90
mL de
1mL diluyente AP

Luego de hacer las diluciones, y de haber agregado los inculos, pasamos a agregar a cada
placa el agar Plate Cound, este debe estar a 45 46 C (10 a 15 mL por placa).

Luego hacemos la mezcla (agar + inculo).

La mezcla se realiza de la sgte. Manera: hacer rotaciones 5 veces sentido horario, 5 veces
de abajo arriba, 5 veces anti horario y 5 veces derecha e izquierda.

Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 29 31 C por 24h

(dejamos una placa control).

Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.

Se puede realizar un cmputo de recuento estndar en placa o computo estimado de

recuento estndar en placa.

Hay que elegir placas que tengan de 30 a 300 colonias.

Para contar usamos el contador de colonia

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PROCEDIMIENTO |

2. 3.

1.

Figura. 1. Muestra de liquida de soya. 2. Medios

de cultivo para el desarrollo del mtodo en
profundidad. 3. Mtodo de siembra en goteo.

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2. Mtodo de Superficie:

Se usa el mismo nmero de placas pero con agar (Plate Count) servido y controlado.
Tambin se usa dos placas por dilucin.
El inculo de la solucin va a ser 0.1 mL en la superficie de la placa y luego se la expande
usando la esptula de Drigalsky.

Pasamos

9 mL. 9 mL. 9 mL. 9 mL. 9 mL.

DAP DAP DAP DAP DAP

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10 g de
muestra + 90 Primero agregamos a las placas el agar PC y esperar a que solidifique
mL de
diluyente AP

0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL

Luego agregamos el inculo y lo esparcimos

3. Mtodo por Goteo

Se puede emplear una placa por dilucin y se lo divide entre dos.

En cada lado se colocan gotas de la dilucin correspondiente a unos 5 cm uno de otro (0.02
mL de gota).

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10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

V. RESULTADOS
Se realiz el conteo de las diferentes placas a las 24 y 48 horas:

CONTEO x TIEMPO

MTODO 24 H 48 H

Promedio Promedio
En Profundidad

10-1 Incontables Incontables

10-2 A 460 776

420 736
10-2 B 380 696

10-3 A 400 416

401 490
10-3 B 402 564

Por Goteo

10-2 A Incontables Incontables

--- ---
10-2 B Incontables Incontables

10-3 A Incontables Incontables

--- ---
10-3 B Incontables Incontables

Por superficie

10-1 Incontables --- Incontables ---

10-2 Incontables --- Incontables ---

10-3 72 --- Incontables ---

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 De los resultados obtenidos se interpret de la sgte. manera:
Para el mtodo de conteo por profundidad:

Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en las diluciones 10-
2
y 10-3, de las diluciones se sac el promedio por horas.
En la dilucin 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 420 colonias y a las 48h. 736
colonias.
En la dilucin 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 401 colonias y a las 48 h. 490
colonias.
Para que los resultados de las diluciones estn bien la dilucin menor debe contener a la
mayor en 2 veces, as que dividimos:

A las 24 h. A las 48 h.

10-2 420 10-2 736

= 1.1 = 1.5
10
-3
401 10
-3
490

En la divisin de los resultados a las 48 h. el resultado es igual a 1.5, o sea, redondeando,

2 (es decir que lo contiene exactamente), por lo tanto tomamos el valor de la menor
dilucin (10-3): 490 y con este resultado realizamos los clculos.

Ufc/gr de N de Factor de
= x
muestra colonias dilucin

Ufc/gr de
= 490 x 103 = 49 x 104 ufc/gr
muestra

Entonces el recuento de bacterias aerobias mesfilas viables es igual a 49 x 104 ufc/gr en

la muestra de ceviche procedente del Restaurante El Muelle.

Para el mtodo de conteo por Goteo.

En las dos diluciones no se pudo llegar a contar el nmero de colonias que crecieron en
el medio, por lo tanto no se pudo realizar los clculos

Para el mtodo de Superficie:

Igual que en el mtodo anterior, no se obtuvo ningn resultado, ya que no pudo llegar al
nmero de colonias que crecieron en el medio.

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Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h)

Superficie 10 -1 (48 h) 10 -2 (48 h) 10 -3 (48 h)

Goteo 10 -2 (48 h) Goteo 10 -3 (48 h)

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VI. CUESTIONARIO

Qu otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los anlisis microbiolgicos
en alimentos?

Adems del Agua de Peptona Tamponada (BPW), es muy comn el uso del Diluyente Agua de
Triptona (Tryptone Water: TW) y la Solucin Tinger , cuyas composiciones son las siguientes:

Tryptone Water Solucin Tnger BPW

Triptona 10 g Cloruro sdico 9g Peptona 10 g

Cloruro de Cloruro clcico

5g 0.42 g Cloruro sdico 5g
sodio anhidro

Hidrgeno
1 000
Agua destilada carbonato 0.20 g Fosfato sdico 9g
mL
sdico

1 000 Fosfato
Agua destilada 1.5 g
mL potsico

Agua destilada 1 000 mL

Tambin se podra usar el Solucin Salina Fisiolgica (SSF) como diluyente, esta solo contiene 0.900
g de cloruro de sodio para 100 mL de agua destilada.

Cules son las ventajas y desventajas de los tres mtodos usados?

Entre las ventajas que tenemos por estos mtodos es que se hace un recuento total que incluye
todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas,
adems refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin y las condiciones
higinicas de la materia prima.

Entre las desventajas tenemos que estos recuentos no pueden considerarse como totales ya que
solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones
establecidas, adems se estima la microflora total sin especificar los tipos de microorganismos y por
ltimo, si tener un recuento bajo de aerobios mesfilos eso no nos asegura la ausencia de patgenos o
sus toxinas; de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patgena.

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Cul es la composicin del medio de cultivo usado?

El Agar Plate Count (PCA) tiene la siguiente composicin:

Plate Count Agar (PCA)

Triptona 5g

Extracto de levadura 2.50 g

Dextrosa 1g

Agar 2g

Agua destilada 1 000 mL

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Anlisis de microorganismos mesfilos aerobios (2003) obtendido el 01 de febrero de 2008 en
http://www.analizacalidad.com/arm2004-4.pdf
JEFE DE LABORATORIO (1998) Instructivo de anlisis: Recuento Aerobios Mesfilos. Obtenido
el 01 de febrero de 2008 en http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf
L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos: Recuento de
microorganismos aerobios mesfilos. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.h
tm
THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.

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