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SECUENCIACIÓN

Ing. Isaac Armendáriz
2017

Qué es secuenciación?
• Los genomas son secuenciados, por
ejemplo en 2003 después de varios
esfuerzos, el genoma humanos fue
secuenciado. Pero que significa
secuenciar un genoma?
• Es el proceso por el cual se
determina la secuencia de
nucleótidos (A,G,T y C) en un
fragmento de ADN. En estos días con
los materiales adecuados es un
proceso sencillo.

utilizando una técnica que se conoce como terminadores de cadena. ahora hay nuevas técnicas para secuenciar genomas. pero Sanger es un muy utilizada en investigación. • Está técnica fue utilizada para secuenciar el genoma humano en 2003. • Se usa aun en la actualidad para secuenciar piezas de ADN de hasta 900 pb. . Secuenciación Sanger • Está técnica fue desarrollada por el bioquímico Británico Fred Sanger en 1977.

• MAS OTRO INGREDIENTE IMPORTANTE: Dideoxi- nucleótidos (ddNTPs). un solo primer. • Se necesita polimerasa. tiene el mismo principio de una PCR. . Como se realiza la secuenciación Sanger? • Se basa en hacer varias copias del ADN objetivo. cada uno marcado con un fluoróforo de diferente color. 4 nucleótidos dNTPs (deoxinucleótidos) y el ADN a ser secuenciado.

ddNTPs o Terminadores • Tienen la misma estructura que un dNTP con la diferencia de que no tienen grupo hidróxilo en la posición 3´. el cual funciona como enganche para los demás nucleótidos. .

Se divide en dos partes: • SECUENCIACIÓN CÍCLICA • SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA .

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CROMATOGRAMA .

conocidas como: Secuenciación de siguiente generación. • Por tal motivo se han diseñado nuevas técnicas de secuenciación. USOS Y LIMITACIONES • La secuenciación Sanger ofrece secuencias de alta calidad. • Es cara e ineficiente para secuenciar a larga escala. es decir genomas. de una longitud aproximada de 900 pares de bases. . Es usada paa secuenciar fragmentos individuales de ADN obtenidos por PCR.

SECUENCIACIÓN DE SIGUIENTE GENERACIÓN (NEXT GENERATION SEQ) • Hay diferentes variaciones de este tipo de secuenciación. pero se distingue y mejor a la secuenciación tipo Sanger en los siguientes aspectos: • Paralela: Varias reacciones al mismo tiempo • Micro Escala: Reacciones del tamaño de un chip de computadora • Rápida: Reacciones en paralelo • Bajo Costo • Menor rango de lectura: Puede leer secuencias inferiores a 100 bp .

Hoy costaría 1245 dólares y se puede hacer en menos de una semana. • Por ejemplo secuenciar el genoma humanos en 2001 costó 100 millones de dólares y tomo varios años. . • De esa manera grandes cantidades de ADN pueden ser secuenciadas en una sola reacción.SECUENCIACIÓN DE SIGUIENTE GENERACIÓN (NGS) • Es como hacer varios ciclos de secuenciación Sanger en una sola reacción o en paralelo.

TÉCNICAS MAS USADAS DE NGS • Illumina Solexa • Roche 454 • Ion Torrent: Proton Sequencing • SOLiD Sequencing • Pacific BioScience Technology Estas técnicas permiten secuenciar ADN y ARN mas rápido y económico que la técnica de Sanger y han revolucionado la investigación molecular. .

• En una placa se diseñan adaptadores parecidos a primers donde los ADN objetivo van a unirse. • Se realiza reacciones de PCR con nucleótidos fluorescentes. ILLUMINA SOLEXA • El ADN objetivo es fragmentado en tamaños de 100 a 150 pb. .

ILLUMINA SOLEXA • Mientras los nucleótidos se incorporan y producen una señal fluorescente un detector va tomando fotografías. • En cada ciclo se remueve los nucleótidos y se elimina la fluorescencia para evitar que la primera señal contamine la siguiente fotografía. .

ILLUMINA SOLEXA .

• Solo un nucleótido fluorescente se agrega por cada reacción. Se añaden adaptadores en camas. • El ADN es fragmentado en tamaños de 1 kb. es decir que cada pocillo tiene varias copias de PCR de un mismo fragmento. SECUENCIACIÓN 454 DE ROCHE • Puede secuenciar mas muestras a mas longitud que Illumina. . • Cada cama ocupa un pocillo en una placa. un fragmento por cama y se amplifican como PCR.

cada uno al incorporarse emitirá una señal fluorescente. Generando una gráfica de computadora con el orden de la secuencia. SECUENCIACIÓN 454 DE ROCHE • Después de la incorporación. se lava la reacción y se añade el siguiente nucleótido y se repite así el ciclo con los 4 nucleótidos. .

• Al igual que 454 cada nucleótido es lavado y cambiado. . se añaden los adaptadores en las camas y se amplifica por PCR de emulsión. el equipo detecta el cambio de pH causado por la liberación de cada ion de H y se determina que nucleótido fue agregado. SECUENCIACIÓN ION TORRENT • El principio de esta técnica se basa en que la adición de un dNTP al ADN libera un ion de hidrógeno H+. • El ADN se fragmenta en 200 pb.

SECUENCIACIÓN ION TORRENT .

. • Debido a que son ligadas las bases son detectadas en pares. • Fragmentos de ADN son ligados con adaptadores y amplificados por PCR de emulsión. • Altamente específica. SOLiD (Applied Biosystems) • SOLID: Small Oligonucleotide Ligation and Detection • Aprovecha la actividad de la enzima ligasa para detectar e incorporar dNTPs. No usa polimerasa. puede secuenciar de 2 a 4 Gb.

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Equipos de NGS .