FACULTAD DE CIENCIAS

Especialidad: Qumica, Fsica y Biologa.

Laboratorio de Biologa Celular.
Practica N2
Tema: Tincin y observacin de bacterias
Coloracin Gram.
Profesor:
Ms. Biol. Enzio Foy Valencia.
Promocin y Seccin:
2016 C7
Alumna:
VELASQUEZ PAREJA, Rosa Stefany.
 TINCIN Y OBSERVACIN DE BACTERIAS
COLORACIN GRAM

I. OBJETIVO.
Realizar estudios morfolgicos y demostrar la diferenciacin de las bacterias
en dos grupos: Gram positivas (color violeta) y Gram negativas (color rosado).

II. MARCO TERICO

TINCIN GRAM
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial
empleado en bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo
en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian
Gram (1853-1938), que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder
realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
considerndose bacterias grampositivas a las que se visualizan de color
morado, y bacterias gramnegativos a las que se visualizan de color rosa,
rojo o grosella.

EXPLICACIN
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas
bacterianas (tanto gram positivas como gram negativas) a travs de la
pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en
equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn
presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el
cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula
bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la

decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta.
Los organismos gram positivos no se decoloran, mientras que los gram
negativos s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una

coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo,
como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las
clulas gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen violetas.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para

hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram
negativas. Al trmino del protocolo, las gram positivas se vern azul-
violceas y las gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).

Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de

tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros
pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el
violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la primera
coloracin y retienen la segunda, de gram negativos. Basndonos pues,
en la reaccin gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de
los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores
resultados dan en la coloracin gram. Los representantes ms usados de
este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En
realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-
p-rosanilina.

El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero

de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el
tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms
ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violetas
de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo
contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El
 violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor
colorante primario para teir por el mtodo de Gram.

La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de

toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y
bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no
conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta
irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La
reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo
del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas.

III. MATERIAL.
a. Microscopio compuesto
b. Porta objetos
c. Cubre objetos
d. Asa de siembra
e. Mechero de alcohol
f. Colorantes, reactivos:
- Cristal violeta o violeta de genciana
- Lugol
- Alcohol- acetona
- Safranina
g. Muestra: yogur
IV. PROCEDIMIENTO.
Actividad N1
a. Utilizar yogures comprados y abiertos 1 2 das antes de la prctica.
No mantenerlos en refrigeracin para favorecer el crecimiento
bacteriano.
b. Tomar la muestra de lquido sobrenadante del yogur con el asa de
siembra y extenderla lo mejor posible sobre el porta objetos (frotis).
c. Fijar por calor, teniendo precaucin de que la preparacin no se
queme.
d. Teir
e. Observar la preparacin al microscopio
f. Se vern estreptococos y bacilos sueltos o encadenados. Pertenecen
a las especies Sterptococcus termophilus y Lactobacillus vulgaricus.

Actividad N 2
a. Para la observacin de los microorganismos del sarro dental,
seguir un procedimiento similar. La muestra se obtiene por
frotacin de los dientes con el asa de siembra.
b. Se sigue el procedimiento similar a la actividad N1 en lo referente
a la coloracin.
c. Se observarn los siguientes tipos morfolgicos: cocos,
estreptococos, bacilos y espirilos.

V. MTODO DE COLORACIN GRAM

a. Preparar el frotis
b. Fijar a la llama
c. Colorear: colocando una gota suficiente del colorante cristal violeta o
violeta de genciana sobre la muestra dejndolo actuar por 1 minuto.
d. Lavar con agua corriente.
e. Cubrir el porta objetos con lugol por 30 a 60 segundos.
f. Decolorar: eliminar el lugol y lavar la lmina con alcohol-acetona
hasta observar que ya no sale ms colorante.
 g. Lavar la lmina con agua corriente.
h. Coloracin de contraste: colocar unas gotas de safranina o fucsina
de Ziehl por 30 a 60 segundos.
i. Lavar la lmina, luego observar al microscopio con la lente de
inmersin
j. Resultado: Las bacterias Gram + aparecern color violeta y las Gram
de color rosado a granate.

VI. CUESTIONARIO

a. Explique qu sucede en la clula bacteriana en el tratamiento de

cada uno de los pasos seguidos en la coloracin.

La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante

utilizado en la Tincin de Gram.

La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o

Gram negativas) por esta coloracin es un criterio de clasificacin
importante correlacionable con otras propiedades bacterianas.
Unos pocos organismos son Gram-variables.

Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la

misma cantidad de cristal violeta (CV) e iodo (I). El complejo CV-I
sin embargo es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la
deshidratacin y la reduccin del tamao de los poros de la pared
resultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en las
Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de
peptidoglicano no impide la extraccin por el solvente del complejo.

Si despus de su tincin se tratan con lisozima bacterias Gram

positivas, se ve que los protoplastos siguen teidos, pero pierden
el colorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante
es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las
bacterias Gram positivas es la que impide la extraccin del
colorante. Corroborando esta suposicin se observa que cuando
 Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta
"inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared
celular adquiere su estructura final pasa a ser Gram positiva.

b. Mencione 10 especies bacterianas Gram + y 10 Gram

BACTERIAS GRAM +

1. Staphylococcus aureus. Responsable de abscesos, dermatitis,

infecciones localizadas y posibles gastroenteritis.
2. Streptococcus pyrogenes. Causante de infecciones supurativas
en el trayecto respiratorio, as como de fiebre reumtica.
3. Streptococcus aglactiae. Frecuente en casos de meningitis
neonatal, endometritis y neumona.
4. Streptococcus faecalis. Usual en infecciones en vas biliares y
urinarias, habita en el colon humano.
5. Streptococcus pneumoniae. Responsable de neumonas e
infecciones en las vas respiratorias, as como otitis, meningitis y
peritonitis.
6. Streptococcus sanguis. Causante de endocarditis, cuando
ingresa al torrente sanguneo a travs de lesiones en su hbitat, la
boca y la mucosa dental.
7. Clostridium tetani. Bacterias responsables de los ttanos, entran
al cuerpo desde el suelo por traumatismos en las extremidades.
8. Bacillus antracis. Se trata de la conocida bacteria del ntrax,
tanto en su versin cutnea como en la pulmonar.
9. Clostridium botullinum. Causante del botulismo clsico y el
infantil, habita en el suelo y en los alimentos mal conservados.
10. Clostridium perfringes. Esta bacteria segrega toxinas que
destruyen la pared celular, y es responsable de las gangrenas
gaseosas, la enteritis necrosante y la endometritis.
BACTERIAS GRAM -

1. Neisseria meningitidis. Peligrosa bacteria causante de

meningitis y meningocococemias, coloniza las vas respiratorias
humanas y asciende a las meninges por va sangunea.
2. Neisseria gonorrhoeae. Conocidsima por ser la causante de la
gonorrea, comn enfermedad de transmisin sexual.
3. Escherichia coli. Habitante usual del colon humano, est
involucrada en las llamadas diarreas del viajero, as como en
meningitis neonatal, sepsis e infecciones urinarias.
4. Salmonella typhi. Bacteria responsable de la enfermedad
conocida como fiebre tifoidea, suele transmitirse por va fecal-oral:
contaminacin de aguas, mala disposicin de excretas o higiene
defectuosa.
5. Salmonella enteritidis. Suele ocasionar enterocoitis y septicemia
con abscesos si llega a pasar del intestino a la sangre.
6. Haemophilus influenzae. Bacilo usualmente aerobio, es
responsable de numerosas meningitis, otitis, sinusitis,
bronconeumonas, celulitis y artritis sptica.
7. Bordetella pertussis. Causante de la enfermedad conocida como
Tos ferina, de alta mortalidad infantil.
8. Brucella abortus. Ocasiona la brucelosis, una enfermedad del
ganado que se transmite al hombre por contacto con los animales
o por ingesta de lcteos sin pasteurizar.
9. Francisella tularensis. Responsable de la llamada fiebre del
conejo o tularemia, se transmite al hombre mediante vectores
(caros u otro tipo de exoparsitos) de los conejos, ciervos y
animales semejantes.
10. Pasteurella multocida. Bacilo anaerbico, transmitido por la
mordedura de animales domsticos infectados, tales como perros
y gatos. Se disemina a travs de la piel e infecta el sistema
respiratorio, causando tambin celulitis.
 c. Qu importancia tiene la reaccin de Gram en el diagnstico
bacteriolgico?

Permite observar bacterias que son causante de producir el

cuadro clnico como son cocos Gram positivo entre ellos se
destaca Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp y
Estafilococos; o bacilos Gram negativo coo Haemophylus
influenzae y Klebsiella pneumoniae.

Permite diferencia la poblacin de leucocitos, si son polimorfo

nucleares indicara un proceso supurativo; si son
mononucleares implicara un posible proceso no bacteriano.

Evaluar la calidad de la muestra, es decir si es una muestra apta

para el cultivo bacteriano.

VII. CONCLUSIONES

En esta experiencia pudimos observar que con la de tincin de

Gram ( diferencial) facilita la diferencia de una bacteria gran
positiva y Gram negativa realizando cada uno de los pasos
fundamentales que nos facilitan tener un buen resultad teniendo
en cuenta que para que se de este tipo de tincin la pared
bacteriana de peptidoglucano de las bacterias juega un papel
importante ya que esta nos permite diferenciar el tipo de
bacteria al momento de teir la clula utilizadas en el laboratorio
ya que en el momento de teir su estructura gruesa o delgada
de la pared permite que la clula quede incolora o con color.

Para observar las preparaciones en el microscopio ptico

siempre tenemos que realizar de forma correcta todos los pasos
para tener un buen enfoque de nuestra muestra
 REFERENCIAS

http://www.ejemplos.co/20-ejemplos-de-bacterias-gram-
positivas-y-gram-negativas/

http://diplomadojm.blogspot.pe/

https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram