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UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

Cincias

Marcadores de activao e perfil de citocinas


inflamatrias em doentes com nefropatia
diabtica em hemodilise

Ana Catarina Silva Almeida

Dissertao para obteno do Grau de Mestre em


Bioqumica
(2 ciclo de estudos)

Orientador: Prof Doutora Ana Mafalda Fonseca

Covilh, Junho de 2011


Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Agradecimentos

Em primeiro lugar gostaria de agradecer minha orientadora a Professora Doutora Ana


Mafalda Fonseca pela orientao e disponibilidade dispensada ao longo de todo o trabalho.

Ao director clnico da Nephrocare Covilh, o Dr. Jos Maria Montalbn, o meu muito
obrigado por ter concedido a oportunidade da realizao deste estudo.

A toda a equipa do centro de dilise Nephrocare Covilh, desde enfermeiros a auxiliares,


pela ajuda e disponibilidade demonstrada ao longo de todo o trabalho, com um especial
obrigado Marta Barbas pelo apoio, disponibilidade e ajuda desde o primeiro dia at ao
ltimo da realizao deste trabalho.

Gostaria tambm de agradecer ao CICS por terem permitido a utilizao das instalaes e
reagentes.

E por ltimo minha famlia e amigos pela ajuda, apoio e sobretudo compreenso,
demonstrada ao longo deste ano de trabalho.

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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Resumo

A nefropatia diabtica (ND) uma complicao comum em doentes diabticos, sendo que a
maioria necessita de ser integrado em terapias de substituio renal, como a hemodilise
(HD). Estes doentes apresentam alteraes no seu Sistema Imunolgico, havendo poucos
estudos que focam os efeitos da HD nos marcadores de activao expressos pelas sub-
populaes de clulas T, e na secreo de citocinas inflamatrias. O principal objectivo deste
estudo consiste na anlise da expresso de marcadores de activao em clulas T CD4+ e
CD8+, bem como a sntese de citocinas inflamatrias, antes e aps a HD.

O estudo incluiu 17 doentes com ND em hemodilise do centro Nephrocare Covilh, e foi


aprovado pela comisso de tica da Fresenius Medical Care. Todos os doentes assinaram um
consentimento informado. Foram colhidas amostras de sangue, antes e aps a sesso de HD,
para a anlise da percentagem relativa de clulas T e suas sub-populaes CD4+ e CD8+, e dos
marcadores de activao CD25, CD69 e CD71, nas referidas sub-populaes, por citometria de
fluxo. A sntese de IL-12p70, IL-8, IL-10, IL-1, TNF- e IL-6, foi analisada em amostras de
soro por Cytometric Bead Array.

Aps a sesso de hemodilise, verificou-se um aumento da razo CD4/CD8 devido a alteraes


significativas nas duas subpopulaes. A percentagem relativa de clulas T CD25+ e clulas T
CD8+CD25+ aumentou significativamente aps a sesso de hemodilise, enquanto que a
percentagem relativa de clulas T CD69 diminuiu. A diminuio dos valores da intensidade
mdia de fluorescncia para as clulas T CD4+CD25+ foi estatisticamente significativa, assim
como para o CD71 nas sub-populaes de linfcitos T, aps a sesso de hemodilise. Em
relao anlise da sntese de citocinas, verificou-se um aumento estatisticamente
significativo na concentrao de IL-10 e de IL-6 e uma diminuio da concentrao de IL-8,
aps a sesso de hemodilise, no se tendo verificado alteraes significativas nas restantes
citocinas inflamatrias avaliadas.

Este estudo demonstrou que h um aumento da activao celular em clulas T, assim como
um aumento na sntese de IL-10 e IL-6, e uma diminuio de IL-8, aps sesso de hemodilise
em doentes com ND.

Palavras-chave

Nefropatia diabtica, Hemodilise, Clulas T, Citocinas, Marcadores de activao.

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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Abstract

Diabetic nephropathy (DN) is a common complication disease in diabetic patients, and most of
them need to be integrated into renal replacement therapy such as hemodialysis (HD). These
patients have changes in their immune system, yet few studies focused in the effect of the
HD on the activation markers expressed by T cell subsets and in the secretion of inflammatory
cytokines. The main objective of this study was to access the expression of activation markers
on CD4+ and CD8+ T cells, as well as the synthesis of inflammatory cytokines, before and
after HD.

This study involved 17 patients with DN under HD treatment at NephroCareCovilh, and it


was approved ethics committee of Fresenius Medical Care. All patients signed an informed
consent. Blood samples before and after one HD session were collected, before and after HD
session, in order to analyze the relative percentages of T cells and the sub-populations CD4+
and CD8+, and the activation markers CD25, CD69 and CD71, by flow cytometry. The synthesis
of IL-12p70, IL-8, IL-10, IL-1, TNF- and IL-6 was analyzed in serum samples by Cytometric
Bead Array.

After the HD session, there was an increase in CD4/CD8 ratio due to significant alterations in
both subsets. The relative percentage of CD25+ T cells and CD8+CD25+ increased significantly
after the HD session, while the relative percentage of CD69 T cells decreased. The decrease
of the CD25 Mean Fluorescence Intensity values for CD4+ T was statistically different, as well
as in the case of CD71 in T cell sub-populations, after HD the session. Regarding cytokine
synthesis in serum samples, there was a significant increase in the concentration of IL-10 and
IL-6 and a decrease in the concentration of IL-8 after HD session, and no other significant
changes in the other inflammatory cytokines evaluated.

This study showed an increase in the T cell activation, as well as an increase in the synthesis
of IL-10 and IL-6 and a decrease in IL-8 after HD session in patients with DN.

Keywords

Diabetic nephropathy, Hemodialysis, T cells, Cytokines, Activation markers.

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ndice

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1. Introduo 1

1. Imunidade 1
1.1 Imunidade Inata 1
1.2 Imunidade Adaptativa 1
1.2.1 Linfcitos 2
1.2.2 Activao dos linfcitos T 2
1.2.3 Diferenciao dos linfcitos T 3
2. Rim 5
2.1 Anatomia e fisiologia 5
2.2 Doena Renal Aguda 6
2.3 Doena Renal Crnica 7
2.4 Nefropatia Diabtica 8
2.5 Tratamento da doena renal crnica 10
3. Alteraes no Sistema Imunolgico em doentes diabticos hemodialisados 12

2. Materiais e Mtodos 20

1. Seleco da amostra 20
2. Anlise dos marcadores de activao por citometria de fluxo 21
3. Anlise da apoptose celular por citometria de fluxo 24
4. Anlise de citocinas 24
5. Anlise estatstica 26

3. Resultados 27

1. Anlise de marcadores de activao em clulas T 27


2. Anlise de citocinas 30

4. Discusso 31

5. Concluso 35

6. Perspectivas futuras 36

7. Bibliografia 37

8. Cibergrafia 44

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Lista de Figuras

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Figura 1.1 Corte transversal do rim 5

Figura 1.2 Taxa de incidncia da ESRD por milho de pessoas, por seleco de 8
grupos de doena primrios, de 1980 at 2008

Figura 1.3 Prevalncia da diabetes em Portugal, por idade e sexo, em 2009 9

Figura 1.4 Alteraes da funo imunolgica em doentes com falha renal crnica 14

Figura 2.1 Grfico Dot Plot tamanho (FSC) vs complexidade (SSC) 22

Figura 2.2 Grfico Dot Plot CD3 vs complexidade (SSC) 23

Figura 2.3 Histogramas representativos da seleco da regio positiva, em amostras 23


dos controlos negativos.

Figura 2.4 Grficos representativos da metodologia usada para a determinao da 24


percentagem relativa de clulas T, T CD4, T CD8 e expresso de CD25,
CD69 e CD71 nas subpopulaes de clulas T.

Figura 2.5 Diluies efectuadas para a formao da curva de calibrao. 25

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Lista de Tabelas

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Tabela 1.1 Classificao da doena renal crnica baseada na taxa de filtrao 7
glomerular

Tabela 1.2 Principais estudos das clulas envolvidas na imunidade de doentes com 16
ESRD, DN e falha crnica renal que faam tratamento de dilise

Tabela 2.1 Caractersticas clnicas e laboratoriais da populao em estudo 20

Tabela 2.2 Anticorpos utilizados nas experincias de citometria de fluxo 21

Tabela 2.3 Combinao dos anticorpos e quantidade usada para a anlise da 22


populao de linfcitos por citometria de fluxo

Tabela 2.4 Concentrao e respectivas diluies dos tubos de controlo 26

Tabela 3.1 Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das 27
percentagens relativas das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8)
e razo CD4/CD8, antes e aps hemodilise

Tabela 3.2 Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das 28
percentagens relativas da expresso de CD25, CD69 e CD71 em clulas
T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps hemodilise

Tabela 3.3 Valores da mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da Mean 29
Fluorescence Intensity (MFI) das clulas T e suas sub-populaes (CD4 e
CD8) que expressam os marcadores CD25, CD69 e CD71, antes e aps
hemodilise

Tabela 3.4 Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da 30


concentrao das citocinas IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-12p70,
antes e aps hemodilise

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Lista de Grficos

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Grfico 3.1 Percentagens relativas das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8) 27
e razo CD4/CD8, antes e aps hemodilise, em 17 doentes diabticos
hemodialisados

Grfico 3.2 Percentagens relativas da expresso dos marcadores CD25, CD69 e 28


CD71 em clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps
hemodilise, em 17 doentes diabticos hemodialisados

Grfico 3.3 Valores da Mean Fluorescence Intensity (MFI) das clulas T e suas sub- 29
populaes (CD4 e CD8) que expressam os marcadores de activao
CD25, CD69 e CD71, antes e aps hemodilise, em 17 doentes
diabticos hemodialisados

Grfico 3.4 Valores de concentrao das citocinas inflamatrias IL-8, IL-1, Il-6, IL- 30
10, TNF- e IL-12p70, antes e aps a sesso de hemodilise, expressos
em pg/mL

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Lista de Acrnimos

APC Allophycocyanin

APCs Clulas apresentadoras de antignio

BD Becton Dickinson

BSA Albumina srica bovina

CBA Cytometric Bead Array

CTL Linfcitos T citotxicos

D.M.P. Doentes por milho de populao

DP Dilise Peritoneal

DRC Doena renal crnica

ESRD Doena renal em fase terminal

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FRC Falha renal crnica

HD Hemodilise

IFN- Interfero gama

IL Interleucina

MFI Mean Fluorescence Intensity

MHC Complexo maior de Histocompatibilidade

ND Nefropatia diabtica

PAMPs Padres moleculares associados a patognios

PBS Binding Buffer

PE Phycoerythrin

PerCP Peridinin-chlorophyll-protein complex

TCR T Cell Receptor

TGF Taxa de filtrao glomerular

TGF- Transforming Growth Factor beta

TLR Toll Like Receptor

TNF- Tumor Necrosis Factor alpha


Treg Linfcitos T regulatory

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Captulo 1

Introduo

1- Imunidade
O conjunto de processos fisiolgicos que permite ao organismo reconhecer corpos estanhos ou
anormais, com consequente neutralizao ou eliminao, designa-se por imunidade. Este
processo dividido em dois tipos de respostas inter-relacionadas, a resposta imunolgica
inata e a resposta imunolgica adaptativa [in Arosa et al, 2007].

1.1- Imunidade Inata


A imunidade inata inclui o conjunto de processos atravs dos quais o organismo previne a
entrada de agentes estranhos, atravs do reconhecimento, fagocitose e digesto dos
patognios, induo da inflamao e apresentao dos antignios. O suporte do seu
funcionamento apoia-se em vrios factores tais como, factores mecnicos, qumicos,
fisiolgicos e humorais, e o papel das clulas fagocticas e linfocticas, clulas dendrticas,
mastcitos e basfilos [in Arosa et al, 2007]. Os receptores da imunidade inata so expressos
em muitas clulas efectoras, incluindo macrfagos e clulas apresentadoras de antignios
(APCs). O reconhecimento dos patognios um processo rpido e caracterizada pelos
padres moleculares associados a patognios (PAMPs). Estes padres so reconhecidos pelos
receptores de reconhecimento de padres de sinalizao, activando vias de transduo de
sinal que induzem genes para citocinas inflamatrias [Kato et al, 2008]. Uma das famlias que
pertence a este sistema a famlia dos Toll Like Receptors (TLR). A funo destes receptores
consiste na promoo da fagocitose e activao da via do complemento e de algumas
citocinas, tal como a IL-1 (Interleucina 1), IL-6 (Interleucina 6), e TNF- (Tumor Necrosis
Factor alpha). Alm destas funes, estes receptores esto tambm envolvidos na maturao
de clulas dendrticas apresentadoras de antignios, aumentando a expresso de molculas
co-estimulatrias, envolvidas na activao de linfcitos [Hajishengallis et al, 2010].

1.2- Imunidade adaptativa


A imunidade adaptativa consiste na gerao de anticorpos especficos (resposta humoral)
e/ou a produo de clulas efectoras capazes de reconhecerem e atacarem (aco citotxica)
as clulas portadoras de antignios estranhos (resposta celular). Este processo inclui a
activao de linfcitos, nomeadamente os linfcitos B e os linfcitos T. Ambos tm origem na
medula ssea sendo que a maturao dos linfcitos T ocorre no timo [in Arosa et al, 2007].

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1.2.1- Linfcitos

Os linfcitos B contm um receptor que apresenta a estrutura de uma imunoglobulina, onde


so capazes de se ligar a antignios. Quando activados, os linfcitos B diferenciam-se em
plasmcitos, sendo capazes de produzir anticorpos. Estes quando se ligam aos antignios
sinalizam-nos para destruio por outras clulas do Sistema Imunolgico. Assim, os linfcitos
B fazem parte da imunidade humoral [in Arosa et al, 2007].

Os linfcitos T so caracterizados pela presena do seu receptor especfico, o TCR (T cell


Receptor), um receptor de clula T responsvel pelo reconhecimento do antignio, e
expresso na membrana plasmtica em associao com um complexo de sinalizao
denominado CD3. O TCR responsvel pela traduo do reconhecimento do antignio pelos
linfcitos T, em sinais intracelulares [in Arosa et al, 2007].

1.2.2- Activao dos linfcitos T

A proliferao e diferenciao dos linfcitos T ocorre quando um linfcito T reconhece um


antignio combinado com uma molcula do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) na
superfcie de uma clula apresentadora de antignio (APCs). O TCR apenas reconhece
antignios que sofreram um processamento e que so apresentados superfcie de clulas
associadas a este tipo de molculas [in Abbas et al, 2007]. Existem dois tipos de molculas
MHC, as molculas MHC classe I, que se encontram presentes em quase todas as clulas com
ncleo, e as molculas MHC classe II, que se encontram expressas em linfcitos B,
moncitos/macrfagos e clulas dendrticas [in Arosa et al, 2007].

As molculas CD4 e CD8 actuam como co-receptores de linfcitos T, e so considerados co-


receptores pois participam activamente no reconhecimento do complexo MHC:pptido pelos
linfcitos T atravs da formao de complexos oligomricos com o TCR/CD3, e porque
tambm participam na transduo dos sinais de activao provenientes do TCR/CD3 atravs
da activao de uma protena cinase de tirosina intracelular, o Lck. Assim, os linfcitos T
podem dividir-se em duas populaes, os linfcitos T CD4+ e os linfcitos T CD8+. Os linfcitos
T CD4+ so seleccionados por molculas de MHC classe II e representam cerca de 50% dos
linfcitos em circulao [in Arosa et al, 2007]. Este tipo de clulas quando abandona o timo
podem ser activados por antignios para se diferenciarem em clulas T auxiliares, cuja funo
principal mediada por protenas especficas membranares e pela produo de citocinas [in
Abbas et al, 2007]. Os linfcitos T CD8+ so seleccionados por molculas de MHC classe I e
representam cerca de 25% dos linfcitos em circulao [in Arosa et al, 2007]. Este tipo de
clulas pode diferenciar-se em linfcitos T citotxicos cuja funo principal a morte de
clulas alvo infectadas [in Abbas et al, 2007].

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A proliferao dos linfcitos T naive ocorre com dois sinais. O primeiro sinal vai conferir
especificidade resposta do linfcito T, sendo que ocorre com a ligao do complexo
TCR/CD3 presente nos linfcitos CD4+ e CD8+, pelas molculas de MHC classe II e MHC classe
I, respectivamente. O segundo sinal transmitido pelos co-receptores CD4 e CD8, assim como
pelo receptor CD28. Este receptor interage com dois receptores da famlia B7, o CD80 e o
CD86. Enquanto que este ltimo expresso s por APCs e tem um papel mais relevante
durante os momentos iniciais da activao, o CD80 induzido aps activao e tem um papel
mais tardio, mais concretamente durante a sustentao do processo de activao e
proliferao. Quando os linfcitos T naive so activados proliferam como resposta a um
antignio promovida pela interleucina-2 (IL-2). Esta citocina promove sinais autcrinos s
clulas T activadas, levando expanso dos clones. A IL-2 e outras citocinas produzidas pelas
clulas T e pelas APCs tambm estimulam a diferenciao das clulas T em clulas efectoras
e de memria [Smith-Garvin et al, 2009].

Esta fase inicial de expanso sempre seguida por uma fase de contraco durante a qual
alguns dos linfcitos T naive inicialmente activados sofrem morte celular programada ou
apoptose, enquanto que os outros sobrevivem. Esta fase determinada, em parte, por
alteraes na expresso de receptores superfcie dos linfcitos T aps activao, ou seja, os
linfcitos T naive que no se ligam ao MHC classe I ou classe II, entram em apoptose, sendo
eliminados [in Arosa et al, 2007].

1.2.3- Diferenciao dos linfcitos T

O processo que converte os linfcitos T naive, que sobrevivem no processo de apoptose, em


linfcitos T de memria e/ou efectores, com funes diferentes, conhecido por
diferenciao. Aps activao, os receptores funcionam como marcadores de diferenciao,
incluindo os receptores para citocinas e factores de crescimento, como por exemplo, o CD69
(expresso pelas clulas T aps a ligao do complexo do receptor das clulas T), a cadeia do
receptor para a IL-2 (CD25) (receptor expresso minutos ou horas aps activao) e o receptor
para a transferrina (CD71) (receptor expresso horas-dias aps activao) [in Arosa et al,
2007].

Os linfcitos T CD4+, aps activao, diferenciam-se em duas grandes subpopulaes: os


linfcitos Th1 e os linfcitos Th2. A diferenciao em linfcitos Th1 realizada pela activao
de um linfcito Th CD4+ naive por uma clula dendrtica, resultante da secreo de
interleucina 2 (IL-2) e interfero gama (IFN-) pela APCs e no aumento de expresso do
receptor para a IL-2 e IFN- pelo linfcito T. Este tipo de linfcitos so responsveis por
promover respostas imunolgicas contra bactrias e vrus, mediada por outros tipos de
linfcitos, tais como T CD8+, NKT e NK. Enquanto que os linfcitos Th1 esto envolvidos na
regulao de respostas celulares, os linfcitos Th2 esto envolvidos na regulao de respostas
humorais. Esta realizada atravs da secreo de citocinas como a IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-

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13, onde algumas ajudam os linfcitos B a proliferar e a diferenciarem-se em plasmcitos


produtores de imunoglobulinas. A diferenciao em linfcitos Th2 ocorre quando um linfcito
Th CD4+ naive activado por uma clula dendrtica, levando a secreo de IL-4 e ao aumento
de expresso do receptor para a IL-4 pelo linfcito T. Este tipo de linfcitos promove a
produo de anticorpos por linfcitos B, assim como respostas mediadas por eosinfilos e
mastcitos [in Arosa et al, 2007].

Devido associao entre a interleucina IL-23 e a expresso de IL-17, uma nova linhagem de
clulas Th, as clulas Th17, foi identificada. Estas clulas no produzem as tpicas citocinas
Th1/Th2, onde as citocinas IL-4 e IFN- suprimem a diferenciao das clulas Th17. So
induzidas na presena de IL-6 e TGF- (Transforming growth factor beta) e produzem
citocinas como a IL-21, IL-22 e duas subpopulaes de IL-17, a IL-17a e a IL-17f. Este tipo de
clulas encontra-se envolvido nas respostas imunolgicas contra bactrias extracelulares e
fungos, e so responsveis pela induo de muitas doenas auto-imunes. A IL-6 produzida
por clulas do Sistema Imunitrio inato e um indutor da diferenciao de clulas Th17,
atravs da TGF-, sendo tambm um indutor na produo de IL-21 e expresso de IL-23R
[Kimura et al, 2011].

Os linfcitos T CD8+ naive, aps activao, passam por uma fase de expanso e contraco,
para a formao de linfcitos de memria. Um dos principais indicadores de diferenciao
deste tipo de linfcitos o receptor CD28. Este receptor encontra-se presente na superfcie
de quase todos os linfcitos T CD8+ naive, sendo que diminui progressivamente com o
processo de diferenciao. Assim sendo, em linfcitos T CD8+ de memria efectores deixam
de ter expresso este tipo de receptor. Alm dos linfcitos T CD8+ de memria efectores, os
linfcitos T CD8+ naive tambm podem dar origem aos linfcitos T CD8+ citotxicos (CTL),
dependendo do tipo de clula apresentadora e da presena, ou no, de determinadas
citocinas no local onde o linfcito T CD8+ activado. Este tipo de linfcitos tem a capacidade
de produzir grnulos citotxicos, com a funo de eliminar clulas-alvo [in Arosa et al, 2007].

A expresso da cadeia do receptor para a IL-2 (CD25), alm de ser um marcador de


linfcitos T activados, utilizada para identificar outro tipo de linfcitos, os linfcitos TCR
reguladores ou Treg (T regulatory) [in Arosa et al, 2007]. Este tipo de linfcitos empenha um
papel crucial na manuteno da auto-tolerncia [Zhu et al, 2008], bem como a supresso de
respostas imunolgicas mediadas por outros linfcitos T atravs de contacto celular e
independente de antignio. Estas clulas tanto podem ser CD4+ como CD8+, e so
caracterizadas pela expresso do factor de transcrio Foxp3 e do CD25, onde se podem
dividir em dois grupos, os naturais (CD4+CD25+) e os induzidos ou adaptativos (CD4+CD25+,
CD8+CD25+, CD8+CD28-) [in Arosa et al, 2007]. As clulas Treg CD4+ expressam elevados
nveis de CD25, e juntamente com a ausncia da expresso de IL-7R, distinguem-se das
outras clulas. Tanto o TGF- como o IL-2 so importantes na diferenciao e sobrevivncia
das clulas Treg, sendo que o TGF- tambm uma citocina produzida por este tipo de

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clulas. Para alm desta, a IL-35 e a IL-10 so tambm produzidas por estas clulas, onde so
responsveis pela tolerncia imunolgica, pela regulao das respostas imunolgicas e pela
homeostase dos linfcitos [Zhu et al, 2008]. Os linfcitos Treg CD8+ so caracterizados pela
ausncia do receptor CD28 e tm a capacidade de inibir a proliferao de linfcitos T
especficos para um determinado antignio (linfcitos Th1/Th2) [in Arosa et al, 2007].

2- Rim
2.1- Anatomia e fisiologia
Os rins so dois rgos simtricos situados na parte mais alta e posterior da cavidade
abdominal, em cada lado da coluna vertebral, na regio lombar. Tm uma forma oval
caracterstica, semelhante de um feijo [in Feehally et al, 2007].

O rim quando cortado ao meio divide-se em vrias seces: medula, papila, clice e pelve
renal. A pelve renal encontra-se ligada a ureter, que posteriormente se liga bexiga (figura
1.1) [in Guyton, 2006].

Figura 1.1: Corte transversal do rim [http://www.leechestherapy.com/kidney_disease.php]

Tm como funes: a remoo de resduos, excesso de gua e clulas resultantes da


desagregao do tecido muscular (devido ao uso normal), manuteno em equilbrio dos
fluidos e electrlitos, controlo da presso sangunea, manuteno do equilbrio cido-base, e
produo de hormonas [in Guyton, 2006].

Os componentes principais internos so os nefrnios e o ducto colector. O rim humano contm


aproximadamente um milho de nefrnios, contudo este nmero varivel. Os nefrnios so
um glomrulo conectado por um tbulo at ao ducto colector [in Feehally et al, 2007]. O
glomrulo uma rede de cerca de 50 capilares paralelos, ramificados, cobertos por clulas
epiteliais e envolvidos pela cpsula de Bowman. A presso do sangue no glomrulo leva a
filtrao do lquido para o interior da cpsula de Bowman e, a partir da, o lquido flui para o

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tbulo proximal, localizado no crtex renal. Do tbulo proximal, o liquido passa pela ansa de
Henle, at ao tbulo distal, que tal como o tbulo proximal fica no crtex renal. A seguir,
ainda no crtex, oito dos tbulos distais juntam-se para formar o tbulo colector, cuja
extremidade se afasta novamente do crtex e se dirige inferiormente para a medula, onde
passa a constituir o canal colector. Os canais maiores lanam-se na pelve renal pelas pontas
da papila renal [in Guyton, 2006].

medida que o filtrado glomerular flui atravs dos tbulos, mais de 99% da sua gua e
quantidades variveis dos seus solutos so reabsorvidos normalmente para o sistema vascular,
e pequenas quantidades de algumas substncias so tambm secretadas para os tbulos. O
restante da gua tubular e das substncias dissolvidas passa a constituir a urina [in Guyton,
2006].

A funo bsica do nefrnio consiste em limpar ou depurar o plasma sanguneo de


substncias indesejadas ao passar atravs do rim. As substncias que precisam ser retiradas
incluem particularmente os produtos terminais do metabolismo, como a ureia, creatinina,
cido rico e uratos. Alm disso, muitas outras substncias, como ies sdio, potssio, cloro e
hidrognio, tendem a acumular-se no corpo em quantidades excessivas. O nefrnio tem
tambm como funo depurar o plasma desses excessos [in Guyton, 2006].

A formao da urina devida a 3 principais mecanismos: filtrao glomerular, reabsoro


tubular e secreo tubular. O nefrnio depura o plasma das substncias desnecessrias por
filtrao, atravs da membrana glomerular, para dentro dos tbulos do nefrnio.
Posteriormente, medida que esse filtrado flui atravs dos tbulos, as substncias
desnecessrias no so reabsorvidas, enquanto que as substncias necessrias, especialmente
a gua e alguns electrlitos, so reabsorvidas de volta para o plasma dos capilares
peritubulares. Ou seja, as funes necessrias do lquido tubular retornam ao sangue,
enquanto que as pores indesejadas passam para a urina. As substncias desnecessrias so
tambm secretadas a partir do plasma directamente atravs das clulas epiteliais que
revestem os tbulos, sendo lanadas no lquido tubular. Assim sendo, a urina que acaba por
ser formada no s composta por substncias filtradas, como tambm por pequenas
quantidades de substncias secretadas [in Guyton, 2006].

2.2- Doena renal aguda


A doena renal aguda um sndroma, assintomtico, que consiste numa diminuio da taxa
de filtrao glomerular abrupta, suficiente para diminuir a eliminao de produtos azotados
(ureia e creatinina) [in Fauci et al, 2009]. Alm desta manifestao clnica, tambm a oligria
(dbito urinrio menor que 400 mL/dia, que contribui para a sobrecarga dos lquidos
extracelulares) e os distrbios electrolticos e cido-base contribuem para a manifestao
clnica da doena. As causas desta doena so geralmente classificadas em trs grupos:

6
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Doenas que causam hipoperfuso renal e comprometem a funo renal sem leso
parenquimatosa bem definida (insuficincia renal aguda ou azotemia pr-renal);
Doenas que afectam directamente o parnquima renal (insuficincia renal aguda
intrnseca);
Doenas associadas obstruo do trato urinrio (insuficincia renal aguda ps-
renal).

Esta doena normalmente reversvel, embora a recuperao das concentraes sricas


basais de creatinina depois da leso renal possam no apresentar valores sensveis para
detectar danos irreversveis clinicamente significativos, que levam ao desenvolvimento de
doena renal crnica [in Fauci et al, 2009].

2.3- Doena renal crnica


A doena renal crnica resulta na destruio irreversvel e progressiva dos nefrnios [in Fauci
et al, 2009]. Independentemente da causa, define-se como um dano no rim ou uma taxa de
filtrao glomerular <60 ml/min/1,73 m2 durante 3 meses ou mais. Com base na gravidade da
doena, esta apresenta uma classificao dividida em 5 estdios [in Feehally et al, 2007]
(Tabela 1.1), onde os doentes com insuficincia renal crnica do estdio 3 ao 5 tm uma
maior probabilidade de vir a desenvolver doena renal em fase terminal [Blickl et al, 2007].

Tabela 1.1: Classificao da doena renal crnica baseada na taxa de filtrao glomerular

Taxa de filtrao glomerular (TGF)


Estdio Descrio
(ml/min/1,73 m2)
1 Leso renal com TGF normal ou elevada 90
2 Leso renal com reduo discreta da TGF 60 a 89
3 Reduo moderada da TGF 30 a 59
4 Reduo grave da TGF 15 a 29
5 Insuficincia renal <15 (ou dilise)
Fonte: National Kidney Foundation: American Journal of kidney disease, 39(2 Suppl.1): S1: 2002

Devido aos tratamentos agressivos para a glomerulonefrite, diabetes mellitus e hipertenso,


estas doenas so as maiores causas da doena renal crnica (figura 1.2) [in Fauci et al,
2009].

7
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Figura 1.2: Taxa de incidncia da ESRD por milho de pessoas, por seleco de grupos de doena
primrios, de 1980 at 2008 [Adaptado de Gorriz, 2011].

Independentemente das causas da doena, a consequncia da reduo do nmero de


nefrnios a alterao da funo de todos os rgos do corpo. Urmia o termo usado no
sndroma, que resulta da perda da funo renal [in Fauci et al, 2009].

2.4- Nefropatia diabtica


A diabetes mellitus uma desordem metablica caracterizada por uma hiperglicmia crnica
com distrbios no metabolismo dos carbohidratos, cidos gordos e protenas. Estes distrbios
metablicos resultam dos defeitos na secreo de insulina, da aco da insulina, ou de
ambos. A diabetes tambm associada a taxas elevadas de doena cardaca coronria,
acidente vascular cerebral, doena e falha renal, retinopatia e cegueira, assim como doena
vascular perifrica, neuropatia, e amputao [in Boner et al, 2003].

A nvel mundial, a prevalncia da diabetes foi estimada em 2,8 % em 2000 e 4,4% em 2030.
Este nmero tem vindo a aumentar devido principalmente ao crescimento da populao,
idade, urbanizao, e ao aumento da prevalncia da obesidade e sedentarismo [Wild et al,
2004]. O nmero total de pessoas com diabetes est projectado para aumentar de 171
milhes em 2000 para 366 milhes em 2030 [Broumand, 2007]. A nvel global, a prevalncia
da diabetes semelhante nos homens e nas mulheres mas ligeiramente superior em homens
com menos de 60 anos e em mulheres com idades mais avanadas, no entanto existem mais
mulheres com a doena do que homens [Wild et al, 2004].

8
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Estudos recentes, datados de 2009, estimam que a prevalncia da Diabetes mellitus em


Portugal, em 2008, era de 11,7 %, correspondendo a aproximadamente 905 mil indivduos,
tendo sido mais frequente em homens (14,2%) e na faixa etria dos 60 aos 79 anos (figura 1.3)
[www.portaldasaude.pt/NR/rdonlyres/4747F2BE-D534-4983-9A94-
C5B7066C9731/0/i012326.pdf].

Figura 1.3: Prevalncia da diabetes em Portugal, por idade e sexo, em 2009


[www.portaldasaude.pt/NR/rdonlyres/4747F2BE-D534-4983-9A94-C5B7066C9731/0/i012326.pdf].

Existem dois tipos de diabetes, a diabetes tipo 1 e a diabetes tipo 2. Ambas encontram-se
associadas ao aumento do risco de vrias condies, incluindo arteriosclerose com doena
coronria e falha cardaca, hipertenso, doena vascular perifrica, retinopatia e/ou doena
cerebrovascular. A diabetes mellitus apresenta tambm um envolvimento renal, numa
percentagem elevada de doentes. Uma percentagem de 25-45% de diabticos com diabetes
tipo 1 e tipo 2 tem tendncia para desenvolver doena renal [in Boner et al, 2003].

A diabetes tipo 1, ou diabetes mellitus insulino-dependente, uma doena autoimune


crnica. Isto devido elevada destruio mediada pela autoimunidade das clulas , nos
ilhus pancreticas de Langerhans, com consequente deficincia de insulina e hiperglicmia,
requerendo terapia de insulina durante o resto da vida. Nem toda a perda de clulas
devido autoimunidade, um facto que leva subclassificao da diabetes tipo 1 em tipo 1a,
relacionada com a doena auto-imune, e tipo 1b, que constitui uma doena no mediada por
imunidade. Este tipo de diabetes engloba cerca de 10% de todo o tipo de diabetes primria,
sendo uma das doenas crnicas mais comuns em crianas, com uma taxa de prevalncia de
0,2-0,5% em muitas populaes caucasianas. Anualmente, a incidncia da diabetes tipo 1 est
a aumentar [in Boner et al, 2003].

A diabetes tipo 2, formalmente conhecida como diabetes no insulino-dependente, a forma


mais comum de diabetes, e caracterizada pela desordem da aco e secreo de insulina. A
sua frequncia encontra-se a aumentar em todo o mundo. Enquanto que a sua
susceptibilidade gentica normalmente um pr-requisito no desenvolvimento de diabetes, a

9
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exposio aos factores ambientais responsvel pela expresso clnica da doena. Este tipo
de diabetes caracterizado pela resistncia insulina nos msculos, fgado e tecido adiposo.
tambm relativa ou absoluta a deficincia na secreo de insulina, apesar das
concentraes absolutas de insulina se encontrarem normalmente elevadas ou normais no
incio da doena. Uma deteriorao progressiva da funo das clulas ocorre com o
aumento da durao da doena, logo eventualmente as concentraes de insulina sub-normais
prevalecem [in Boner et al, 2003].

A nefropatia diabtica (ND), ou seja, a existncia de danos nos rins em diabticos, ocorre
como o resultado de ambas as aces directas e indirectas da glucose, que activa vrias vias
envolvidas na patognese da DN. Isto inclui stress oxidativo, glicao avanada e activao de
certas citocinas. Outros factores que so precisos ter em conta incluem a hipertenso,
arteriosclerose e os efeitos txicos da exposio das clulas tubulares s protenas [in Boner
et al, 2003]. A nefropatia diabtica tem uma prevalncia de 60% em doentes com diabetes
tipo 1, sendo que em doentes com diabetes mellitus tipo 2 se verifique uma prevalncia mais
baixa, a rondar os 10% [Belchetz et al, 2003].

A nefropatia diabtica eventualmente resulta em doena renal em fase terminal (ESRD) [in
Boner et al, 2003], tendo uma incidncia de 4,3% em doentes com diabetes mellitus tipo 1 e
40,5% com diabetes mellitus tipo 2 [The United States Renal Data System, Annual Data Report
2010]. Nos ltimos anos tm sido aceites mais doentes com nefropatia diabtica em
programas teraputicos de substituio renal. Doentes diabticos nestes programas so
susceptveis de desenvolver complicaes adicionais e requerem tratamento intensivo, no s
no manuseamento destas condies especficas mas tambm no melhoramento da sua
qualidade de vida [in Boner et al, 2003].

2.5- Tratamento da doena renal crnica


Nos ltimos anos, a dilise e o transplante tm vindo a prolongar a vida de muitas pessoas
com insuficincia renal. O tratamento na doena renal aguda diferente do da doena renal
crnica devido caracterstica irreversvel desta ltima [in Fauci et al, 2009]. Em Portugal, a
percentagem de doentes diabticos com Insuficincia Renal Crnica a efectuar hemodilise
ronda os 25% [Correia, 2009].

Os doentes que apresentem uma doena renal crnica nos ltimos estdios, muitas agncias
passam a design-la como doena renal de fase terminal (ESRD). Inicialmente, doentes com
ESRD comeam com terapia de conservao, mas eventualmente podem precisar de
hemodilise (HD), dilise peritoneal (DP) e/ou transplantao [in Fauci et al, 2009]. Estudos
relativos a 2004, demonstram que mais de 1.7 milhes de pessoas, a nvel mundial, se
encontravam sob tratamento para a ESRD [Grassmann et al, 2005], sendo que a incidncia

10
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tende a aumentar aproximadamente 8% anualmente [Schieppati et al, 2005]. Desses 1.7


milhes, 412 000 efectuaram transplante, 1 222 000 foram submetidos a HD e 149 000 a PD.
Assim sendo, o resultado da mdia de prevalncia global dos doentes em tratamento para
ESRD e dos doentes em dilise foi de 280 e 215 doentes por milho de populao (d.m.p),
respectivamente. At ao final de 2004, o tratamento de dilise mais frequente foi a
hemodilise, representando 89% de todos os doentes em dilise, sendo que, a DP s abrangeu
11% dos doentes em dilise. A nvel mundial, a prevalncia mais alta desta doena encontra-
se no Japo, seguida dos Estados Unidos da Amrica. Na Europa, Portugal, Alemanha, Chipre,
Espanha e Itlia so dos pases com maiores taxas de prevalncia (entre os 1000 e 1160
d.m.p) [Grassmann et al, 2005]. Nos pases desenvolvidos, a idade mdia dos doentes com
ESRD que necessitam de dilise de 60 a 63 anos, valor este, muito mais elevado quando
comparado com a idade mdia dos pases em desenvolvimento, de 32 a 42 anos [Kher, 2002].

As terapias para as doenas renais no devem ser realizadas quando o doente se encontra
totalmente assintomtico contudo, a dilise e/ou o transplante convm ser iniciada o mais
precoce possvel para prevenir complicaes srias. A mudana do tratamento convencional
para a dilise ou transplante determinado pela qualidade de vida do doente e os riscos que
os tratamentos possam ter [in Fauci et al, 2009].

O transplante tido em considerao s quando o tratamento conservador falha, quando no


h outros tratamentos reversveis para a falha renal, e quando o indivduo se encontra muito
doente, incapaz de realizar outros mtodos de tratamento [in Fauci et al, 2009].

A dilise peritoneal um tratamento para a ESRD, que representa aproximadamente 8% a 9%


do total de pessoas que fazem dilise. Nesta tcnica, a cavidade peritoneal, ou seja, o maior
espao seroso no corpo, usado para conter 2 a 2,5 litros de fludo de dilise, que trocado
4 a 5 vezes por dia atravs de um cateter interior permanente. A membrana peritoneal via
capilares peritoneais actua como uma membrana de dilise endgena. Atravs desta
membrana, os resduos difundem para o dialisado, enquanto que o fludo em excesso
removido por osmose induzida pela glucose ou outro agente osmtico do fludo de dilise,
denominado de ultrafiltrao [in Feehally et al, 2007]. Este tipo de dilise aplica-se
principalmente em doentes que apresentem uma funo renal residual. A maioria dos doentes
que comea com este tipo de dilise eventualmente, passado alguns anos, necessita de mudar
para outros tipos de tratamento, como por exemplo a hemodilise. No entanto, so raros os
doentes que mudam de tratamento de hemodilise para dilise peritoneal. Este tipo de
dilise apresenta como vantagens um lento, contnuo modo fisiolgico de remoo de
pequenos solutos e do excesso de gua corporal, associado com uma aparente qumica
sangunea e estado de hidratao corporal estvel. A dilise peritoneal no necessita de
acesso vascular nem de uma membrana de contacto com o sangue, fazendo com que o
estmulo catablico seja menos proeminente que na hemodilise, e um tipo de dilise que
pode ser realizada em casa, permitindo uma qualidade de vida melhor [in Feehally et al,

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2007]. A principal desvantagem o facto do tempo de tratamento ser elevado, envolvendo


continuamente o doente [in Fauci et al, 2009].

A hemodilise um processo de difuso atravs de uma membrana semipermevel que


remove substncias indesejveis do sangue enquanto adiciona componentes desejveis. Um
fluxo constante num lado da membrana e uma soluo de limpeza (dialisado) no outro lado
permite a remoo dos resduos por transporte difuso. Por alterao da composio do
dialisado, o mtodo de exposio do sangue e o dialisado (geometria do dialisador), o tipo e a
superfcie da rea da membrana da dilise, e a frequncia e a durao de exposio,
permitem que doentes sem funo renal se mantenham com um estado de sade relativo [in
Fauci et al, 2009]. A maior vantagem deste tipo de dilise o facto do tratamento se realizar
num curto espao de tempo e com pouca interrupo no estilo de vida entre os tratamentos.
mais eficiente que a dilise peritoneal, permitindo mudanas rpidas nos valores sricos
anormais. A hemodilise pode ser realizada em casa, mas os pacientes necessitam de
assistncia durante o tratamento [in Fauci et al, 2009].

3- Alteraes no Sistema Imunolgico em doentes diabticos


hemodialisados
Uma das caractersticas da funo renal a concentrao elevada de ureia no sangue,
denominada urmia. A elevada concentrao deste composto leva a que os doentes
apresentem tambm hipercitocinmia, provavelmente devido a acumulao de citocinas pr-
inflamatrias, consequncia da diminuio da eliminao renal [kimmel et al, 1998;
Stenvinkel et al, 2005]. Por outro lado, a urmia encontra-se tambm associada
imunossupresso devido ao impacto do milieu urmico e variedade das desordens associadas
s clulas imunocompetentes [Kato et al, 2008].

Doentes que se encontram em hemodilise crnica, tm uma tendncia elevada para


desenvolver infeces e tm uma elevada incidncia em contrair doenas, relacionada com as
respostas imunolgicas [Descamps-Latscha et al, 1996]. Os defeitos no Sistema Imunitrio
ocorrem tanto nas respostas humorais como nas respostas celulares, mas apresentam uma
maior evidncia na imunidade celular [Descamps-Latscha et al, 1996; Descamps-Latscha et al,
1993].

Na ausncia de infeces, os doentes com falha renal crnica apresentam, normalmente,


nveis normais de leuccitos [Girndt et al, 2001]. Apesar disso encontram-se casos de
linfopnia de clulas B e T, estando associada terapia renal [Fernandez-Fresnedo et al,
2000; Kurz et al, 1986], sendo que a linfopnia de clulas B uma das caractersticas do
estdio 5 da doena renal crnica [Litjens et al, 2006]. Outra das caractersticas desta doena

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a diminuio da activao de clulas T, podendo ser estudada atravs das molculas CD69
[Dietzmann et al, 2002; Meier et al, 2007] e CD25 (receptor da IL-2) [Girndt et al, 2001;
Sester et al, 2000; Girndt et al, 1999], bem como a relao CD4/CD8 [Girndt et al, 1993].
Outro meio para verificar a activao das clulas T atravs da quantificao das citocinas
pr-inflamatrias IL-1, IL-6 e TNF-. Assim sendo, o tratamento por hemodilise e a urmia
tm influncia sobre os moncitos, ocorrendo uma sucessiva activao do complemento. Estas
clulas so activadas para a produo de elevados nveis destas citocinas, em que quanto
mais elevados os nveis, mais baixa a activao das clulas T [Girndt et al, 2001; Girndt et
al, 1998; Herbelin et al, 1990].

Um dos sinais que actua directamente na induo da IL-2 transmitido atravs das molculas
da famlia B7. Estas molculas constituem um dos mais importantes sinais co-estimulatrios
das APCs para as clulas T, atravs da interaco com o CD28, localizado na superfcie destes
linfcitos [Greenfield et al, 1998]. Alguns estudos direccionados avaliao da expresso
deste tipo de molculas, nomeadamente da B7-1 (CD80) e da B7-2 (CD86), sugerem que a
reduo da activao de clulas T no devido s prprias clulas mas sim s APCs [Girndt et
al, 2001], encontrando-se valores reduzidos da expresso da B7-2 [Girndt et al, 2001; Girndt
et al, 1999], levando posteriormente a uma reduo na relao entre o segundo sinal (B7-2) e
o primeiro sinal (HLA classe II) [Girndt et al, 1999].

Como referido anteriormente, existem dois tipos de clulas auxiliares: Th1, que secreta a
citocina IFN-, (inibe a diferenciao das clulas Th2) e a Th2, que produz interleucinas IL-4 e
IL-10 (inibe a secreo de IFN- e a imunidade celular) [Libetta et al, 2001]. Os valores de IL-
4 e IL-10 encontram-se elevados em doentes com falha renal crnica [Alvarez-Lara et al,
2004], sendo que estes valores elevados de IL-10 tambm ocorrem em doentes com
nefropatia diabtica e ESRD. O aumento da produo de IL-10 pode representar uma resposta
auto-regulatria para aumentar a produo de citocinas pr-inflamatrias pelos moncitos
[Kamel et al, 2009]. Em doentes em hemodilise, o aumento da sntese e secreo desta
citocina devido ao contacto com a membrana do dialisado [Brunet et al, 1998].

Em doentes em dilise, a reduo da IL-2 tem como consequncia uma reduo da activao
das clulas Th1 e Th2, pois esta citocina encontra-se envolvida na expanso de ambas as
linhas celulares. Contudo, estudos revelam que em casos de falha renal crnica, h uma
induo para a tendncia da diferenciao de clulas Th1 [Sester et al, 2000],
consequentemente levando ao aumento da razo Th1/Th2 [Ando et al, 2005; Sester et al,
2000; Nitta et al, 2002; Daichou et al, 1999]. Dois dos grandes promotores da diferenciao
das Th1 so a IL-12 (secretada por APCs) e o IFN-. A IL-12 encontra-se sobre-expressa nos
moncitos de doentes hemodialisados, enquanto que relativamente ao valores de IFN-
existem opinies diferentes. Estudos mais antigos relatam nveis de IFN- baixos [Sester et al,
2000], mas outros autores demonstraram que doentes com falha renal crnica e nefropatia
diabtica, apresentam nveis elevados desta citocina [Kamel et al, 2009; Alvarez-Lara et al,

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2004; Fodor et al, 2002]. Ao contrrio do IFN-, a IL-12 no afecta o desenvolvimento das
Th2. Assim, a alta frequncia de clulas Th1 em doentes hemodialisados pode ser explicada
pelos altos nveis de IL-12, que facilita e aumenta a diferenciao das Th1 sem afectar o
desenvolvimento das Th2. Tal indicativo que a funo auxiliar da activao das clulas B
(Th2) encontra-se mais comprometida que a funo efectora T (Th1) pela reduo de
activao de clulas T [Sester et al, 2000] (figura 1.4).

Figura 1.4: Alteraes da funo imunolgica em doentes com falha renal crnica [Adaptado de Girndt
et al, 2001]

As clulas T de doentes com doena renal crnica tm um imunofentipo compatvel com


estimulao crnica de clulas T, demonstrado pelo aumento de percentagem das clulas T
CD28-, CD57+, HLA-DR+, CD28-HLA-DR+, e CD57+HLA-DR+ [Costa et al, 2008]. Um aumento

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nos marcadores de activao, HLA-DR e CD57 em ambas as clulas T CD4+ e CD8+ so


compatveis com um estado de activao contnuo em doentes com doena renal crnica
[dAngeac et al, 1997].

Na diabetes tipo 2, sem doena renal, a resistncia insulina leva a um aumento da secreo
de insulina, mas em doentes com ESRD tal no acontece, devido acidose metablica,
deficincia da 1,25 dihidroxivitamina D e hipertiroidismo secundrio [Mak, 1992]. Em doentes
que tenham ESRD e estejam em tratamento por hemodilise, ocorre uma alterao da
farmacocintica da medicao da diabetes, levando a um aumento dos nveis de glucose e um
aumento do risco de episdios hipoglicmicos [Shrishrimal et al, 2009]. Os doentes diabticos,
quando comparados com indivduos saudveis, apresentam uma excessiva produo de
citocinas Th1 acompanhado por uma deficincia de Th2 [Rapoport et al, 1998]. Este
fenmeno est envolvido na patognese da diabetes mellitus tipo 1 [Rabinovitch, 1994]. As
clulas Th1 auxiliares e as suas citocinas so mais prevalentes em relao com s clulas de
Th2, resultando numa cascata de processos imunolgicos nos ilhus pancreticos, levando
posteriormente destruio das clulas [Dietzmann et al, 2002].

Em doentes em hemodilise, uma elevada percentagem de clulas T CD4+ activadas no


proliferam e tornam-se apoptticas [Meier et al, 2002; Ankersmit et al, 2001], sendo que a
induo deste fenmeno dependente da expresso de Fas/FasL (CD95) [Meier et al, 2003].
Doentes em hemodilise, apresentam valores elevados nas clulas T CD4+ com um marcador
de activao inicial (CD69+), mas apresentam valores baixos na resposta a proliferao, logo
tm menos capacidade para proliferar. Neste tipo de doentes, os nveis de IL-2 encontram-se
mais elevados quando comparados com os indivduos saudveis [Meier et al, 2007].

Antes do incio de hemodilise, o distrbio urmico atinge o seu mximo. O tratamento de


hemodilise melhora muitos dos sinais e sintomas da urmia e esperado que melhore a
funo imunolgica celular, tal como a libertao de citocinas pr-inflamatrias. Alguns
estudos conseguiram demonstrar isso mesmo, verificando-se um aumento significativo de
APCs, com consequente aumento de proliferao de clulas T, aps algumas semanas de
tratamento [Kaul et al, 2000]. O nmero de moncitos diminui dramaticamente durante os
primeiros 20 minutos de uma sesso de tratamento e s as clulas com baixo grau de
activao e baixa produo de IL-6 que permanecem em circulao [Girndt et al, 1997].
Outra caracterstica que se verifica com a hemodilise o aumento das citocinas IFN- e IL-
10, quando comparado com valores antes da hemodilise. Isto devido, possivelmente,
activao dos moncitos e dos linfcitos pelo contacto com a membrana do dialisador [Kamel
et al, 2009].

Na tabela seguinte encontram-se alguns dos principais estudos feitos nesta rea e as suas
principais concluses.

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Tabela 1.2: Principais estudos das clulas envolvidas na imunidade de doentes com ESRD, DN e falha crnica renal que faam tratamento de dilise.

Clulas em Citocinas/molculas
Referncia Doena N doentes Idade mdia Principais resultados
estudo em estudo
Zamauskaite 25 HD 52,1 Clulas Th1 IL-2, IFN-, TNF-, Diminuio da percentagem relativa de clulas CD3+ que
ESRD
et al, 1999 20 DP 57,9 Clulas Th2 IL-4 e IL-10 expressam IL-2, IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10
Falha 14 Antes e
Kaul et al, renal depois algumas Baixa percentagem relativa de clulas T antes de HD; aumento
5914,2 Clulas T CD28, IL-6, IL-10
2000 crnica e semanas de HD, da percentagem relativa de clulas T aps 6 semanas de HD
ESRD onde 7 tm ND
Sester et al, Clulas Th1 Diminuio d expresso de IL-2, IFN-; aumento da expresso
ESRD 20 HD 56,512,8 IL-2, IFN- e IL-12
2000 Clulas Th2 de IL-12 e Th1
20 HD onde 5
63,311
Falha tm ND Diminuio da percentagem relativa de B7-2 em HD; valores
Girndt et al, CD14, HLA-DR, B7-1
renal 10 FRC sem Moncitos normais de expresso de B7-1 e HLA-DR em HD; B7-1 expresso
2001 (CD80), B7-2 (CD86)
crnica dilise, onde 3 71,110,3 s em moncitos activados
tm ND
Dietzmann
ESRD/ND 2 30 HD 7012 Clulas T CD69, CD3 Diminuio da expresso CD69 em linfcitos T
et al, 2002
Diminuio da percentagem relativa de clulas T em HD
Meier et al, 18 HD CD3, CD69, CD95, (comparando com grupo de ESRD e controlos); expresso
ESRD 516 Clulas T
2002 8 ESRD anexina V elevada de CD69 em HD (em comparao com os outros
grupos); aumento da apoptose das clulas T
20 HD 55,52,3 A HD potencia a sntese de TNF pelos moncitos mas aps HD
Falha Celulas T
Ando et al, TNF, IL-1, IFN, IL- no se altera; aps HD tambm no se altera nem o IFN, IL-4
renal auxiliares
2005 20 DP 53,811 4, CD14, CD4 e IL-1; aumento de Th1/Th2 e Th1 em HD; diminuio da
crnica Moncitos
sntese de IL-1 e TNF em PD e valores normais em HD

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Continuao da tabela 1.2

Clulas em Citocinas/molculas
Referncia Doena N doentes Idade mdia Principais resultados
estudo em estudo
25 HD no
Bradran et
ESRD diabticos 47,17 Clulas B - Diminuio da percentagem relativa de clulas B
al, 2006
11 HD diabticos
CD4, CD8, CD3,
Diminuio da percentagem relativa de clulas B em doentes
CD45, CD14, CD19,
Litjens et Clulas T com DRC estdio 5, em relao ao grupo controlo;
DRC 38 DRC 5415 CD45RO, CCR7,
al, 2006 Clulas B predominncia da produo de citocinas tipo 1 em doentes em
CXCR3, CCR5, CCR4,
HD; aumento da expresso de CD25 em clulas CD4+
CD25 e CD27
Percentagem relativa de clulas T CD4+ e CD4/CD8 reduzida no
Yoon et al, 21 HD (antes e CD4, CD8, CD45RA,
ESRD 493,4 Clulas T grupo de ESRD; Diminuio da percentagem relativa de clulas
2006 depois HD) CCR7
T CD8+ aps a HD
15 HD 515 Diminuio da expresso de CD69 em clulas TCD4 em HD
Meier et al, 15 DP 527 CD3, CD4, CD69, (comparando com os outros grupos); diminuio da expresso
ESRD Clulas T
2007 CD95, IL-2 de IL-2 em clulas CD69+CD4+ na presena de ox-LDL e de Bcl-
15 DRC 504
2; aumento de Bax
Clulas T
CD3, CD4, CD8, Diminuio da percentagem relativa de linfcitos T e linfcitos
Clulas B
Costa et al, 50 HD em que 16 CD57, HLA-DR, CD28, T CD4+; aumento da expresso de IL-2, TNF, IFN, IL-6, sIL2R
ESRD - Moncitos
2008 tm ND sIL2R, IL-2, IL-4, IL-6, nas subpopulaes das clulas T, e na percentagem relativa de
Neutrfilos
IL-10, TNF e IFN clulas T CD28-, CD57+, HLA-DR+, CD28-HLA-DR+ e CD57+HLA-DR+
Eosinfilos
40 HD 2713 CD3, CD4, CD19, Percentagem relativa de CD19, CD3-CD16+CD56+, CD4, CD3 e
Hendrikx et
ESRD Clulas T CD4+ CD8, CD45, CD14, CD4+CD25bright+ mais baixa em doentes ESRD, em comparao
al, 2009 26 PD 199
CD25, CD16CD56 com os controlos

17
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Continuao da tabela 1.2

Citocinas/molculas
Referncia Doena N doentes Idade mdia Clulas em estudo Principais resultados
em estudo
17 Diabticos
sem alteraes 47,98,9
nos rins
22 ND (diabticos
tipo 2 com Aumento da sntese de IFN- e IL-10 em DN e ESRD, e sICAM-
Kamel et DN tipo 2 e 55,99,3 sICAM-1, IFN-, IL-10
alteraes nos Clulas CD4+ 1 e sE-selectin em diabticos, DN e ESRD; aps HD a sntese
al, 2009 ESRD e sE-selectin
rins) de sICAM-1, IFN- e IL-10 aumentam
19 ESRD
(diabticos tipo 2
52,88,8
com ESRD em
HD)
Clulas T
CD3, CD19, Diminuio da percentagem relativa de clulas B e CD8+
Clulas B
Vrabie et Falha renal 15 HD (antes e CD16/CD56, CD45, aps HD; aumento da percentagem relativa de clulas T
31-50 Clulas NK
al, 2009 crnica aps HD) CD4, CD8, CD25, HLA- CD4+ e NK e linfcitos T com receptor para a IL-2 aps HD;
Moncitos
DR no houve alterao na razo CD4/CD8 aps HD
Granulcitos
Diminuio da percentagem relativa de clulas T CD4+ em
Borges et 47 HD (12 antes CD3, CD4, Annexina V doentes HD, comparando com os controlos; aumento da
ESRD 65,5816,99 Clulas T CD4+
al, 2011 HD e depois HD) e 7-AAD percentagem relativa de clulas T apoptticas CD4+,
comparando antes e depois da HD
Abreviaturas: ESRD: Doena renal em fase terminal; ND: Nefropatia diabtica; HD: Hemodilise; DP: Dilise peritonial; IFN-: Interfero gama; TNF-: Factor de necrose
tumoral alfa; DRC: Doena renal crnica; FRC: Falha renal crnica

18
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Atravs de uma anlise feita aos estudos realizados nesta rea verificou-se que existe uma
escassa informao acerca do comportamento da expresso de marcadores de activao em
clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), aps uma nica sesso de hemodilise, bem
como estudos focados no perfil citocnico inflamatrio em amostras de sangue, colhidas antes
e aps a hemodilise. Assim sendo, este estudo tem como principais objectivos:

Comparar as percentagens relativas de clulas T, clulas T CD4 e clulas T CD8,


antes e aps a sesso de hemodilise;
Estudar por citometria de fluxo a expresso dos marcadores de activao CD25, CD69
e CD71, em clulas T, clulas T CD4 e clulas TCD8, bem como comparar estes
valores antes e aps a hemodilise;
Estudar a apoptose celular, atravs da conjugao anexina V/iodeto de propdeo,
antes e aps a hemodilise;
Avaliar a secreo das citocinas, IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-12p70, no soro, e
comparar os valores antes e aps a hemodilise.

19
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Captulo 2

Materiais e Mtodos

1- Seleco da amostra
A amostra do estudo foi seleccionada de entre doentes que fazem hemodilise no centro de
dilise Nephrocare - Covilh, sendo que as caractersticas comuns foram: ter diabetes
mellitus tipo II, o tipo de acesso vascular ser por fstula arteriovenosa e no terem efectuado
nenhum transplante. Os critrios de excluso basearam-se em factores que podem afectar o
Sistema Imunolgico: serem fumadores e tomarem medicamentos anti-asmticos e
antibiticos. Assim sendo, a nossa amostra consistiu num grupo de 17 doentes (7 Homens e 10
Mulheres) com uma mdia de idades de 72.410,2, sendo que 88.2% so insulino-dependentes,
Todos os doentes realizam hemodilise h mais de um ano. As caractersticas laboratoriais
referentes s anlises feitas mais prximas do dia de colheita esto resumidas na tabela 2.1.
Todos os participantes foram informados dos objectivos do estudo e assinaram um
consentimento informado, submetido e aprovado pela comisso de tica da Fresenius Medical
Care.

Tabela 2.1: Caractersticas clnicas e laboratoriais da populao em estudo


Dosagem de
Creatinina Protena C PTH Transferrina HbA1c Glicmia
ID Eritropoietina eKt/V
(mg/dL) reactiva (mg/L) (pg/mL) (mg/dL) (%) (mg/dL)
(g/ms)
Voluntrio 1 8,96 6 55,39 156 7,6 155,8 40 1,67
Voluntrio 2 8,45 4,2 133,3 216 7,4 95,8 80 1,79
Voluntrio 3 5,17 4,6 88,44 163 7,6 129,5 80 1,80
Voluntrio 4 7,41 3,8 175,9 167 9,1 164,4 40 1,84
Voluntrio 5 5,71 3,4 40,11 312 8,5 263,9 Sem dados 2,14
Voluntrio 6 7,42 11,2 329 178 7 67,8 40 1,71
Voluntrio 7 7,52 1 176,9 136 5,8 47,9 80 1,68
Voluntrio 8 8,15 8,1 336,1 139 5,7 183,7 120 1,69
Voluntrio 9 7,34 5,5 224,6 154 8,9 109,1 80 1,75
Voluntrio 10 7,07 4,8 424,1 153 7,4 202,5 80 2,17
Voluntrio 11 8,03 17,3 414,5 182 9 220,6 40 2,46
Voluntrio 12 5,14 2,6 228 224 9 163,8 40 1,57
Voluntrio 13 4,14 64 220,6 118 7 265,2 160 1,10
Voluntrio 14 7,01 3,6 264,7 123 6,5 192,1 40 2,20
Voluntrio 15 5,55 2,9 42,29 180 6,5 171,9 80 1,94
Voluntrio 16 7,61 10,4 276 165 8 182,1 Sem dados 1,33
Voluntrio 17 5,56 5,8 265,6 159 8,4 255,2 80 1,83

20
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

2- Anlise dos marcadores de activao por citometria de


fluxo
A citometria de fluxo uma tcnica de contagem e anlise celular, que tem a capacidade de
determinar parmetros celulares, sejam eles morfolgicos ou fenotpicos. Esta tcnica
realizada aps a incubao das amostras com anticorpos monoclonais conjugados com
fluorocromos, que se ligam a componentes celulares especficos, e que posteriormente
emitem fluorescncia. O citmetro de fluxo um instrumento especializado que capaz de
detectar esta fluorescncia em clulas individuais numa suspenso, e posteriormente
determinar o nmero de clulas que expressam as molculas. uma tcnica que
normalmente usada para a anlise de linhagens celulares, estgios de maturao e estado de
activao, com o uso de fluorocromos ligados a anticorpos, bem como do tamanho e
complexidade celular, sem o uso de fluorocromos. Esta tcnica tambm permite a anlise de
diferentes parmetros, com a marcao com diferentes anticorpos (o nmero de parmetros
depende do citmetro), permitindo a anlise da heterogeneidade numa amostra.

A colheita de sangue foi efectuada no centro de dilise, em simultneo com as colheitas de


rotina, antes e aps a sesso de hemodilise, em tubos com anticoagulante EDTA. Do sangue
colhido, 100L foram usados em cada ensaio, para a anlise de linfcitos por citometria de
fluxo, num citmetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson), equipado com dois lasers,
um de rgon e granulosidade e quatro fluorescncias de cores diferentes).

O sangue foi incubado com os anticorpos durante 15 minutos, em gelo e no escuro. Para cada
amostra prepararam-se quatro tubos diferentes: o controlo negativo (tubo 0), que em vez do
anticorpo continha 50 L de staining buffer (PBS 1x contendo 0,2% de albumina srica bovina
(BSA) e 0,1% de azida de sdio (NaN3)); e trs tubos (tubo 1 a 3) com combinaes diferentes
de marcadores de activao como descrito na tabela 2.3.

Tabela 2.2: Anticorpos utilizados nas experincias de citometria de fluxo


Anticorpo Clone Isotipo Fluorescncia Referncia Fabricante
Anti-CD3 UCHT1 Mouse IgG1, k APC #555335 BD Pharmingen
Anti-CD4 RPA-T4 IgG1, k FITC #555346 BD Pharmingen
Anti-CD8 BW135/80 Mouse IgG2a PerCP #130-094-972 Miltenyl Biotec
Anti-CD25 M-A251 IgG1, k PE #555432 BD Pharmingen
Anti-CD69 FN50 IgG1, k PE #555531 BD Pharmingen
Anti-CD71 M-A712 IgG2a, k PE #555537 BD Pharmingen
Abreviaturas: APC, allophycocyanin; FITC, Fluorescein Isothiocyanate; PerCP, Peridinin-chlorophyll-
protein complex; PE, Phycoerythrin

21
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Tabela 2.3: Combinao dos anticorpos e quantidade usada para a anlise da populao de linfcitos por
citometria de fluxo
Tubo CD3 (L) CD4 (L) CD8 (L) CD25 (L) CD69 (L) CD71 (L)
1 17 17 8 17 - -
2 17 17 8 - 17 -
3 17 17 8 - - 17

Aps incubao, procedeu-se lise das clulas com 1mL de soluo BD FACS Lysing (1x
concentrado), durante 15 minutos no escuro. Para a separao dos leuccitos totais do sangue
dos restantes constituintes celulares, centrifugou-se as amostras a 1200rpm durante 4
minutos. Aps desprezar o sobrenadante, procedeu-se lavagem (1 a 2 vezes) do pellet, para
retirar o maior nmero de eritrcitos lisados, com 500 L de Binding buffer (PBS: 1,37 M
NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4 - pH7,4), seguido de nova centrifugao a
1200rpm durante 4 minutos. Uma vez isolados os leuccitos foram ressuspendidos em 400 L
de PBS e colocados no escuro e no gelo, at aquisio.

A anlise dos resultados foi feita com recurso ao software CELLquest, onde o sistema foi
definido para a avaliao de 15000 clulas, numa regio delimitada regio com as
caractersticas morfolgicas dos linfcitos (figura 2.1).

Linfcitos

Figura 2.1: Grfico Dot Plot tamanho (FSC) vs complexidade (SSC)

Aps a definio desta regio e atravs da amostra do controlo negativo (sem anticorpo),
definiu-se uma regio para as clulas T, presentes na regio dos linfcitos, com a construo
de um grfico Dot blot complexidade (SSC) versus CD3, como exemplificado na figura 2.2.

22
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Clulas CD3+

Figura 2.2: Grfico Dot Plot CD3 vs complexidade (SSC)

Atravs da amostra do controlo negativo foram tambm construdos histogramas relativos ao


nmero de clulas que expressavam cada uma das quatro fluorescncias, na regio dos
linfcitos, servindo para delimitar as regies positivas (M1) para cada uma das quatro
fluorescncias (Figura 2.3).

Figura 2.3: Histogramas representativos da seleco da regio positiva, em amostras dos controlos
negativos.

Para cada amostra foram tambm construdos: a) histogramas representativos da


percentagem relativa de clulas CD3+ na regio dos linfcitos, b) grficos dot blot CD8
versus CD4, resultante do cruzamento entre a regio dos linfcitos e a regio das clulas T,
para determinar a percentagem relativa de clulas CD4+ e CD8+, c) histogramas relativos
percentagem de clulas que expressavam CD25, CD69 e CD71, em trs diferentes regies,
resultante do cruzamento entre: regio dos linfcitos com as clulas CD3 +; a regio dos
linfcitos, a regio das clulas CD3+ e a regio das clulas CD4+; e a regio dos linfcitos, a
regio das clulas CD3+ e a regio das clulas CD8+ (Figura 2.4).

23
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

b)
a)

c) CD25-PE

Figura 2.4: Grficos representativos da metodologia usada para a determinao da percentagem relativa
de clulas T (a), T CD4 (b), T CD8 (b) e expresso de CD25 (c), CD69 (c) e CD71 (c) nas subpopulaes de
clulas T. Nota: No histograma c) s est representado uma das 3 regies resultantes de cruzamento.

3- Anlise da apoptose celular por citometria de fluxo


A apoptose celular pode ser avaliada pela marcao com anexina V, pois esta uma protena
de ligao a fosfolpidos, nomeadamente a fosfatidilserina, expressa na superfcie das clulas
durante uma fase inicial de apoptose.

Aps obteno do pellet este foi ressuspenso em 500 L de annexin binding buffer (0,1 M
Hepes/NaOH, 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2 - pH7,4) e posteriormente centrifugado a 1200rpm
durante 4 minutos. Aps desprezo do sobrenadante adicionou-se 100 L de annexin binding
buffer com 5 L de anexina V (FITC, Ref. #556420, BD Pharmingen). Aps 15 minutos de
incubao no escuro adicionou-se mais 300 L de annexin binding buffer. Para uma melhor
diferenciao da apoptose em fase inicial adicionou-se 5 L de iodeto de propdio (stock com
concentrao de 50 g/mL), pois intercala-se com a dupla hlice da cadeia de DNA, minutos
antes da anlise por citometria de fluxo.

Para a anlise de percentagem relativa de clulas apoptticas, construram-se histogramas


das amostras antes e aps a hemodilise, na regio correspondente aos linfcitos.

4- Anlise de citocinas
Para a avaliao das citocinas utilizou-se o kit Cytometric Bead Array (CBA) Human
Inflammatory Cytokines (BD Pharmingen, 551811). As amostras de sangue foram colhidas
antes e aps a hemodilise, para tubos sem anticoagulante, tendo sido, posteriormente
isolado o soro por centrifugao, a 4000rpm durante 10 minutos, a uma temperatura de 20C.

24
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Estas amostras de soro foram congeladas em tubos de criopreservao antes de se proceder


sua avaliao por citometria de fluxo.

O kit BD CBA Human Inflammatory Cytokines foi usado para medir quantitativamente os
nveis de protena das citocinas inflamatrias IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-12p70, numa
nica amostra de soro. Este kit consiste num mtodo de captura de analito solvel ou de um
conjunto de analitos com esferas de tamanho e fluorescncia conhecidos, fazendo com que
seja possvel detectar os analitos usando a citometria de fluxo. Para tal, temos de proceder
primeiro preparao dos padres para a formao da curva de calibrao. Preparou-se um
tubo com as esferas padro e assay diluent do kit, num volume total de 2mL, para um tubo
denominado top Standard. A partir deste tubo procedeu-se a 8 diluies como
exemplificado na figura 2.5. Preparou-se tambm um tubo para controlo negativo que
continha s assay diluent.

Figura 2.5: Diluies efectuadas para a formao da curva de calibrao.

De seguida preparou-se uma soluo com 10L de cada capture beads num volume total de
440 L, correspondente ao nmero de tubos a analisar (padres, controlo negativo e
amostras). Centrifugou-se a mistura das beads a 200g durante 5min, descartando o
sobrenadante com uma pipeta, e ressuspendendo, de seguida, o pellet em serum
enhancement buffer, num volume igual ao retirado de sobrenadante. Esta mistura das
capture beads, aps ser agitada em vortex, foi incubada durante 30 minutos temperatura
ambiente e no escuro.

Aps a incubao da mistura das capture beads adicionou-se 50 L a todos os tubos das
amostras, adicionando aos tubos de controlo, resumidos na tabela 2.4, 50 L de human
inflammatory cytokine standard dilutions.

25
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Tabela 2.4: Concentrao e respectivas diluies dos tubos de controlo


Tubo Concentrao (pg/mL) Diluio dos padres
1 0 (controlo negativo) Sem diluio (s com assay diluent)
2 20 1:256
3 40 1:128
4 80 1:64
5 156 1:32
6 312,5 1:16
7 625 1:8
8 1250 1:4
9 2500 1:2
10 5000 Top standard

Adicionou-se 50 L de cada amostra desconhecida aos seus respectivos tubos, previamente


rotulados, e incubou-se todos os tubos durante 1hora e meia temperatura ambiente e
ausente de luz.

Aps incubao adicionou-se 1mL de wash buffer a cada tubo a analisar e centrifugou-se a
200g durante 5 minutos. Retirou-se o sobrenadante, cuidadosamente, deixando
aproximadamente 100 L, tendo-se adicionado de seguida 50 L de human inflammatory
cytokine PE detection reagent a todos os tubos, ressuspendendo o pellet devagarinho. Aps
uma incubao de 1hora e meia, s escuras, adicionou-se aos tubos 1mL de wash buffer,
centrifugando-se de seguida a 200g durante 5 minutos. Descartou-se o sobrenadante, com
cuidado, e ressuspendeu-se o pellet em 300 L de wash buffer. As amostras permaneceram
no escuro at sua anlise por citometria de fluxo.

A anlise dos resultados foi efectuada atravs do software CELLquest e a realizao dos
clculos, num ficheiro Excell disponibilizado pela Becton Dickinson (BD).

5- Anlise estatstica
Para a comparao da percentagem relativa de clulas CD3, CD4, CD8, dos marcadores de
activao CD25, CD69 e CD71, nas subpopulaes de clulas T e das citocinas IL-8, IL-1, Il-6,
IL-10, TNF- e IL-12p70, antes e aps a hemodilise utilizou-se o Wilcoxon Signed-Rank test,
usando o software SPSS (verso 19), tendo sido considerados significativos valores com p
<0,05. Este teste permite detectar diferenas significativas entre os valores centrais de duas
situaes, quando se consideram os mesmos sujeitos. Representa a alternativa no
paramtrica ao teste t-student para amostras emparelhadas, quando no se encontram
reunidas as condies de aplicao de um teste paramtrico.

26
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Captulo 3

Resultados

1 Anlise dos marcadores de activao em clulas T


Aps o isolamento dos leuccitos em amostras de sangue total, foi avaliada por citometria de
fluxo a percentagem relativa de clulas T, clulas TCD4 e TCD8 e da razo CD4/CD8.
Observou-se um aumento de 10% relativamente percentagem de clulas CD3CD4 antes e
aps a hemodilise, 61,512 vs 68,111 (p <0,05). No entanto, a percentagem relativa de
clulas CD3CD8 depois da sesso de hemodilise diminuiu 17% (32,610,6 vs 27,29,4, p
<0,05). Como consequncia observou-se um aumento significativo de 40% da razo CD4/CD8
depois da sesso da hemodilise (2,21,2 vs 3,12,1, p <0,05). Relativamente comparao
da percentagem relativa de clulas positivas CD3, antes e aps a hemodilise observou-se um
aumento de 3 % mas este resultado no se verificou ser estatisticamente significativo (Tabela
3.1 e Grfico 3.1).

Tabela 3.1: Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das percentagens relativas
das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8) e razo CD4/CD8, antes e aps hemodilise
Pr dilise Ps dilise
p
MDP Med (min-mx) MDP Med (min-mx)

CD3+ 61,812,4 59,4 (30,6-81,8) 63,610,8 64,5 (35-78,5) 0,122

CD4+ 61,512 62,3 (43,8-81,2) 68,111 68,1 (53-89) <0,0001


Clulas T
CD8+ 32,610,6 33,5 (15,5-49,7) 27,29,4 28,7 (9,2-40,8) <0,0001

CD4/CD8 2,21,2 1,9 (0,9-5,2) 3,12,1 2,4 (1,3-9,6) <0,0001


Abreviaturas: MDP, mdiadesvio-padro; Med (min-mx), mediana (mnimo-mximo)
Valor de p calculado pelo Wilcoxon Signed-Rank test

80 % relativa de clulas positivas


* Pr dilise
60 Ps dilise

40 *

20
*
0
Clulas T CD4/CD8 CD3CD4 CD3CD8

Grfico 3.1: Percentagens relativas das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8) e razo CD4/CD8,
antes e aps hemodilise, em 17 doentes diabticos hemodialisados (* p <0,05)

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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Por citometria de fluxo foi tambm analisado o efeito da HD na expresso de trs marcadores
de activao, CD25, CD69 e CD71, nos linfcitos T globalmente e nas duas principais sub-
populaes, T CD4 e T CD8. Verificaram-se diferenas significativas na percentagem relativa
de clulas T CD25 (31,614,9 vs 36,212,7, p <0,05), nas clulas T CD8 CD25 (6,94,5 vs
9,16, p <0,05), em que se verifica um aumento de 15% e 32%, respectivamente, aps sesso
de hemodilise, e em clulas T CD69 (10,67,1 vs 7,84,2, p <0,05), onde se verifica uma
diminuio da percentagem relativa de 26%, aps sesso de hemodilise. Para os restantes
marcadores de activao expressos nas clulas T, T CD4 e T CD8 no se verificaram diferenas
significativas (Tabela 3.2 e Grfico 3.2).

Tabela 3.2: Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das percentagens relativas
da expresso de CD25, CD69 e CD71 em clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps
hemodilise
Pr dilise Ps dilise
p
MDP Med (min-mx) MDP Med (min-mx)
CD3+ 31,614,9 33,7 (4,3-58,2) 36,212,7 34,3 (11,5-64,1) 0,013
CD25 CD4+ 45,117,1 47,2 (6,4-69,9) 47,913,5 45,6 (15,3-71,3) 0,176
CD8+ 6,94,4 6,7 (1-15,4) 9,16 6,9 (1,1-25,4) 0,002

CD3+ 10,67,1 9 (0,4-30,2) 7,84,2 6,4 (1,1-14,7) 0,022

CD69 CD4+ 11,312,4 7,1 (0,1-49,3) 7,95,2 6,8 (1,7-17) 0,112

CD8+ 8,73,9 8,9 (0,7-14,4) 83,9 7,8 (2,2-15,7) 0,115

CD3+ 4,66,3 2,2 (0,1-24,7) 4,14 3 (0,4-14,6) 0,455

CD71 CD4+ 7,210,6 2,8 (0,1-41,3) 5,35 3,5 (0,5-15,3) 0,416

CD8+ 0,80,6 0,7 (0-2,4) 1,53,3 0,5 (0,1-13,6) 0,337


Abreviaturas: MDP, mdiadesvio-padro; Med (min-mx), mediana (mnimo-mximo)
Valor de p calculado pelo Wilcoxon Signed-Rank test

60 % de clulas positivas em clulas T


50
Pr dilise
40 * Ps dilise
30
20
* *
10
0

Grfico 3.2: Percentagens relativas da expresso dos marcadores CD25, CD69 e CD71 em clulas T e suas
sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps hemodilise, em 17 doentes diabticos hemodialisados (* p
<0,05)

28
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Posteriormente, foi feita uma anlise semelhante aos marcadores de activao expressos nas
sub-populaes de clulas analisadas para os valores de intensidade de fluorescncia, tendo-
se verificado as seguintes diferenas significativas, aps sesso de hemodilise: diminuio de
11% da percentagem relativa de clulas T CD4 que expressavam CD25 (56,420 vs 50,417,2,
p <0,05), de 39% nas clulas T CD71 (34,321,1 vs 219,7, p <0,05), de 32% de clulas T CD4
CD71 (3016 vs 20,410,6, p <0,05), e 42% de clulas T CD8 CD71 (39,430,9 vs 2312,6, p
<0,05). Para as outras clulas que expressaram os marcadores de activao CD25, CD69 e
CD71 no se encontraram diferenas significativas (Tabela 3.3 e Grfico 3.3).

Tabela 3.3: Valores da mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da Mean Fluorescence
Intensity (MFI) das clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8) que expressam os marcadores CD25,
CD69 e CD71, antes e aps hemodilise
Pr dilise Ps dilise
p
MDP Med (min-mx) MDP Med (min-mx)

CD3+ 55,719,4 59 (22,7-86,6) 49,916,9 52,2 (23,5-71,4) 0,054

CD25 CD4+ 56,420 62,5 (23,8-88,1) 50,417,2 55,3 (23-71,6) 0,037

CD8+ 34,511,2 36,6 (16,3-58,4) 329,9 31,3 (16,4-44,7) 0,119

CD3+ 45,723,9 42,6 (15,7-99) 41,125 36,6 (12-100,9) 0,259

CD69 CD4+ 28,814,6 27,5 (12,9-61,4) 26,613,6 23,4 (9-54,3) 0,085

CD8+ 61,325,5 57,7 (25,1-110,6) 59,627,2 54,5 (27,1-98,2) 0,259

CD3+ 34,321,1 25,5 (10,9-84) 219,7 18,6 (6,6-49) 0,022

CD71 CD4+ 3016 25,4 (10,9-59,3) 20,410,6 18,2 (6,5-54,9) 0,012

CD8+ 39,430,9 27,8 (0-120,8) 2312,6 21,4 (5,8-59,8) 0,03


Abreviaturas: MDP, mdiadesvio-padro; Med (min-mx), mediana (mnimo-mximo)
Valor de p calculado pelo Wilcoxon Signed-Rank test

70
MFI
60 * Pr dilise
Ps dilise
50 *
40 * *
30
20
10
0

Grfico 3.3: Valores da Mean Fluorescence Intensity (MFI) das clulas T e suas sub-populaes (CD4 e
CD8) que expressam os marcadores de activao CD25, CD69 e CD71, antes e aps hemodilise, em 17
doentes diabticos hemodialisados (* p <0,05)

29
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Para a anlise da apoptose celular em linfcitos, tambm se usou a citometria de fluxo, mas
estes resultados foram inconclusivos, sendo necessria a realizao de mais estudos
posteriormente.

2 Anlise de citocinas
Para a anlise da concentrao serolgica de citocinas inflamatrias, usou-se o Cytometric
Bead Array, que tem por base a citometria de fluxo e obtiveram-se diferenas significativas
em trs das citocinas estudadas: na IL-10 (2,10,7 pg/mL vs 2,50,7 pg/mL, p <0,05), e na IL-
6 (8,95,6 pg/mL vs 11,67,8 pg/mL, p <0,05), onde se verificou um aumento da
concentrao de 5% e 19%, respectivamente, aps a sesso de hemodilise, e na IL-8 (17,46
pg/mL vs 11,13,7 pg/mL, p <0,05), com uma diminuio da concentrao de 22%, aps
hemodilise. Nas outras citocinas avaliadas, para alm de no se ter verificado diferenas
significativas, verificou-se que em algumas amostras, o clculo da concentrao das citocinas
se encontrava abaixo do limite de deteco, tendo em conta a curva de calibrao realizada
no incio do procedimento (Tabela 3.4 e Grfico 3.4).

Tabela 3.4: Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da concentrao das
citocinas IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-12p70, antes e aps hemodilise (n=15)
Pr dilise Ps dilise
Med (min- p
MDP Med (min-mx) MDP
mx)
IL12p70 5,50,4 1,8 (1,7-2,8) 5,50,5 2 (1,6-2,7) -

TNF- 5,60,5 1,8 (1,1-2,2) 5,50,5 1,6 (1,1-1,9) -

IL-10 6,60,6 2,1 (1,4-3,8) 6,90,8 2,4 (1,6-4,2) 0,001

IL-6 14,65,8 6,7 (2,4-24,9) 17,47,9 7,9 (3,3-31,4) 0,005

IL-1 7,40,4 1,3 (1,2-1,8) 7,30,5 1,5 (1,4-1,5) -

IL-8 22,84,8 18 (9,1-26,9) 17,83 10,3 (5,8-20,2) <0,0001


Abreviaturas: MDP, mdiadesvio-padro; Med (min-mx), mediana (mnimo-mximo)
Valores de p calculado pelo Wilcoxon Signed-Rank test

20 Concentrao de citocinas
15 IL12p70
(pg/mL)

TNFa
10
IL10
5 IL6
IL1b
0
IL8
Pr dilise Ps dilise

Grfico 3.4: Valores de concentrao das citocinas inflamatrias IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-
12p70, antes e aps a sesso de hemodilise, expressos em pg/mL

30
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Captulo 4

Discusso

A dilise leva a algumas alteraes no Sistema Imunolgico, como por exemplo na activao
do complemento, na funo dos macrfagos [Vrabie et al, 2009], na activao de clulas T
[Meier et al, 2002] e na libertao de vrias citocinas pr-inflamatrias [Zamouskaite et al,
1999]. No presente estudo propusemo-nos a analisar mais profundamente alguns aspectos
associados activao de linfcitos T, incluindo a sntese de citocinas inflamatrias. Inmeros
estudos incidiram sobre a comparao entre voluntrios saudveis e hemodialisados nestes
parmetros mas, poucos existem com foco nas alteraes que ocorrem aps uma sesso de
hemodilise.

Associada terapia renal, alguns autores [Fernandez-Fresnedo et al, 2000; Kurz et al, 1986]
reportaram uma linfopnia nas clulas T, no entanto, no nosso estudo, ao analisarmos os
valores de percentagem relativa de clulas T aps uma sesso de hemodilise, no se
verificam diferenas significativas, verificando-se assim que a HD no provoca alteraes na
percentagem destas clulas. Contudo, na anlise das subpopulaes destas clulas
verificaram-se alteraes. Relativamente percentagem relativa de clulas T CD4 verificou-
se um aumento de 10%, aps sesso de hemodilise, da percentagem de clulas positivas CD4,
no sendo estes resultados concordantes com outros autores, como Yoon e seus colegas, em
que no verificaram alteraes nesta percentagem celular. No entanto o estudo destes
investigadores continha uma populao de 21 doentes em hemodilise, enquanto no nosso
estudo analismos 17 amostras. Contudo, este aumento de percentagem de clulas T CD4
pode ser devido prpria durao do procedimento de HD (durao mdia de 4h), em que se
promove um estado contnuo de activao nas clulas T, como sugerido por Borges e colegas.
Quanto percentagem relativa de clulas T CD8, verificmos uma diminuio da percentagem
relativa de 17%, aps sesso de hemodilise, estando os nossos resultados de acordo com
estudos prvios, [Yoon et al, 2006]. Uma das possveis explicaes est relacionada com as
possveis consequncias do contacto do sangue com a membrana do dialisador, e se este
contacto pode levar apoptose celular destas clulas. No entanto, esta diminuio da
percentagem relativa de clulas T CD8 necessita da realizao de mais estudos para uma
melhor compreenso do porqu da diminuio destas clulas, aps a sesso de HD. Os nossos
estudos foram tambm concordantes com outros autores em relao ao valor da razo
CD4/CD8, verificando-se uma diminuio deste valor aps sesso de HD.

31
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Devido importncia das clulas T na resposta imunolgica, investigou-se o estado de


activao destas clulas atravs da anlise da expresso de diferentes marcadores de
superfcie. Os resultados mostraram um aumento da activao das clulas T e T CD8 medido
pela expresso do CD25 de 15% e 32%, respectivamente, aps a sesso de HD. Tal facto pode
ser justificado pelo contnuo estado de activao, devido ao contacto com a membrana do
dialisador, durante a sesso de HD. Uma das possveis consequncias do aumento da
expresso desta molcula nas clulas T um aumento da proliferao celular, pois a CD25 a
cadeia do receptor para a IL-2. Aps estimulao do linfcito, a IL-2 actua como factor de
crescimento celular nos linfcitos, promovendo posteriormente a proliferao linfcitria.
Verifica-se tambm, pelo valor da percentagem do aumento, que as clulas T CD8 se
encontram mais susceptveis a activao, em relao s clulas T CD4. No entanto
relativamente expresso do marcador de activao CD69, verifica-se uma diminuio da
expresso de 26% nas clulas T, aps sesso de HD. Este marcador est associado diviso
celular [Meier et al, 2002], o que parece sugerir que a HD no promove a proliferao celular
dos linfcitos T. A activao de clulas T induzida por antignio conhecida por resultar na
expresso de marcadores de activao numa sequncia ordenada: CD69, CD25, CD71 e HLA-
DR [Caruso et al, 1997]. Como as nossas amostras foram analisadas num intervalo de 1 hora a
12 horas, aps a colheita, e o CD69 expresso minutos aps activao, este pode ser um
motivo desta diminuio de percentagem, relativamente expresso de CD25, que expresso
de minutos a horas aps activao. De facto, consideramos que esta diferena de tempo
entre a colheita das amostras de sangue e a anlise foi uma limitao do estudo, e que
futuras experincias tm que ser feitas no sentido de perceber se esta limitao pode ter ou
no influncia nos resultados de imunofenotipagem. As consequncias da diminuio da
expresso deste marcador esto relacionadas com a diminuio da sntese de citocinas, a
diminuio do influxo de clcio e a diminuio da citotoxicidade mediada por clulas NK.

Alm dos valores de percentagem de clulas positivas, foram tambm comparados, antes e
aps HD, os valores de MFI (Mean Fluorescence Intensity). Este parmetro avalia a
intensidade de fluorescncia das clulas, que proporcional densidade celular das
molculas analisadas, e verificou-se uma reduo de 11% na percentagem relativa da
expresso de CD25 em clulas T e uma diminuio na expresso de CD71 em clulas T, T CD4
e T CD8 de 39%, 32% e 42%, respectivamente, aps sesso de HD. Assim, apesar de no
ocorrer diferenas na percentagem de clulas T que expressem estes dois marcadores,
verifica-se uma diminuio do nmero destes marcadores por clula com a sesso de HD. O
marcador de activao CD71 o receptor da transferrina e liga o complexo Fe(APO)
transferrina por endocitose, entregando o ferro, um importante co-factor de enzimas
necessrias ao crescimento celular e metabolismo. Consistentes com esta anlise esto os
resultados das ltimas anlises feitas antes da colheita de sangue dos doentes, onde se
verifica que aproximadamente 82% dos doentes apresentam valores de transferrina abaixo dos
valores de referncia (200-360 mg/mL). Apesar do valor de MFI, depois da sesso de HD, no

32
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

se ter alterado significativamente relativamente s clulas T CD25, obteve-se um valor de p


prximo de 0,05 (p=0,054), podendo ser indicador de que h uma tendncia para este valor
diminuir, e para confirmar esta hiptese seria necessrio um valor superior de voluntrios,
para uma mais correcta verificao da diferena de valores aps a HD.

Os doentes com nefropatia diabtica apresentam um elevado nmero de processos


inflamatrios, tendo sido j demonstrado que ocorre um aumento destes processos com a
sesso de HD [Kamel et al, 2009]. As citocinas que esto envolvidas neste processo so
libertadas durante a sesso de hemodilise, principalmente por moncitos e factores
responsveis pela activao de moncitos, como endotoxinas que possam estar no fludo
dialisado; complemento activado; e a prpria membrana do dialisador [Pertosa et al, 1995].
Tarakioflu e seus colegas reportaram que a concentrao serolgica de IL-6, no soro, no
sofre alteraes significativas aps a sesso de HD, resultado este que no se encontra
concordante com os resultados do presente estudo. No entanto, o estudo destes
investigadores, de uma amostra total de 29 doentes, somente 6 tinha como etiologia a
diabetes mellitus. De facto, autores como Geerlings e seus colegas reportaram que um
aumento dos nveis de IL-6 caracterstico de doentes com diabetes mellitus e encontra-se
associada resistncia insulina. Outros investigadores analisaram tambm que
hiperglicmia com simultnea inibio da secreo de insulina endgena resulta num aumento
dos nveis desta citocina [Esposito et al, 2002], levando posteriormente activao de
protenas de fase aguda, supresso da sntese de albumina e aumento da proliferao de
clulas B e T, contribuindo posteriormente, para a sntese de IL-2 [Schaefer et al, 1991]. Para
alm destas alteraes, outros autores, como Petersen e seus colegas e Ropelle e seus
colegas, reportaram que a IL-6 induz um ambiente anti-inflamatrio pela induo da
produo da citocina IL-10 e pela inibio da produo de TNF-. Esta situao verifica-se
tambm no nosso estudo, onde aps hemodilise temos um aumento da concentrao de 19%
para a IL-6 e 5% para a IL-10, onde no se verificam tambm diferenas na concentrao de
TNF-. O aumento da citocina IL-10 uma evidncia do estado de activao dos moncitos e
linfcitos em doentes em HD, muito provavelmente devido tambm ao contacto do sangue
com a membrana do dialisador durante a sesso de hemodilise, como referido
anteriormente. A IL-10 um dos mais importantes mediadores para diminuir a resposta
inflamatria, em que um aumento destes nveis parece funcionar como mecanismo regulador
para o controlo de urmia e activao induzida pela dilise [Girndt et al, 2003], assim a IL-10
actua como citocina anti-inflamatria, onde inibe as tambm citocinas IL-1, TNF- e IL-8,
envolvidos na activao de granulcitos, moncitos/macrfagos e clulas NK, T e B
[Steensberg et al, 2003]. Este facto tambm consistente com os nossos resultados, onde no
ocorrem diferenas significativas na concentrao de IL-1 e TNF-, aps a hemodilise, e
onde ocorre uma diminuio de 22% da concentrao de IL-8, aps a hemodilise. A
diminuio da concentrao desta citocina concordante tambm com os resultados
reportados por Tarakioflu e seus colegas. Outros dos possveis motivos, tambm sugeridos

33
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

por estes investigadores so: o facto de que esta protena tem um peso molecular baixo,
sendo por isso fcil a sua difuso atravs da membrana de dilise; ou devido a uma
diminuio da estabilidade ou alterao na sua absoro pela membrana, durante a sesso de
hemodilise.

Relativamente ao facto das concentraes das citocinas IL-1, TNF- e IL-12p70 no


apresentarem diferenas significativas, pode ser devido a limitaes de metodologia, pois a
maioria dos valores pr e ps dilise apresentaram valores sricos mais baixos que o limite de
deteco da tcnica utilizada. No entanto, o intervalo de valores detectveis, pelo CBA,
bastante amplo, 20 a 5000 pg/mL, tornando-se importante determinar se valores inferiores a
20 pg/mL podem ser ou no fisiologicamente relevantes. Uma limitao do presente estudo
relativa anlise de citocinas inflamatrias o nmero de amostras (n=15 para IL-6 e IL-8 e
n=13 para a IL-10). Para a verificao da consistncia destes resultados, torna-se necessrio
incluir um maior nmero de amostras e incluir mais sesses de hemodilise.

34
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Captulo 5

Concluso

Atravs da realizao deste estudo concluiu-se que durante uma sesso de hemodilise
ocorrem algumas alteraes no Sistema Imunolgico, nomeadamente na expresso de alguns
marcadores de activao em clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8). Verificou-se assim
que a hemodilise interferiu na expresso do marcador CD25 em clulas T e T CD8, e na
expresso de CD69 em clulas T. Verificou-se tambm que aps uma sesso de hemodilise a
densidade das molculas de CD71 diminuiu por clula, em clulas T, bem como as molculas
de CD25 em clulas T CD4. Alm disso tambm se verifica que a sesso de hemodilise altera
a secreo de algumas citocinas, ocorrendo o aumento de IL-10 e IL-6 e uma diminuio da
concentrao de IL-8, aps uma sesso de hemodilise, sugerindo que possivelmente estas
alteraes se devam ao contacto com a membrana do dialisador. Apesar disso, o facto de se
verificar um aumento de IL-10, durante a sesso de hemodilise, este tem um efeito anti-
inflamatrio, pode ser indicativo de que este tipo de tratamento melhora alguns sinais
caractersticos deste tipo de doentes. Um dos outros objectivos seria a anlise da apoptose
celular em linfcitos, aps a sesso de hemodilise, mas os resultados foram inconclusivos,
no tendo por isso sido possvel atingir este objectivo.

35
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Captulo 6

Perspectivas futuras

Apesar dos poucos estudos publicados nesta rea, resultados contraditrios tm vindo a ser
reportados, no que respeita aos efeitos da hemodilise no Sistema Imunolgico dos doentes
com nefropatia diabtica. Deste modo, mais estudos necessitam de ser feitos para uma
melhor compreenso dos mecanismos induzidos pela hemodilise que originam alteraes na
imunologia celular. Uma vez que verificmos no nosso estudo uma aco da hemodilise no
fentipo das clulas T citotxicas, CD8+, diferente relativamente s clulas T auxiliares,
CD4+, mais estudos necessitam de ser realizados de modo a analisar tambm a funo
citotxica destas clulas. tambm importante realizar estudos sobre o efeito da hemodilise
na proliferao celular das clulas T e suas sub-populaes, para melhor avaliarmos as
consequncias da HD na capacidade de resposta a antignios. Uma vez que os nossos
resultados referentes apoptose celular foram inconclusivos, futuras experincias tero
tambm de focar este aspecto nas sub-populaes de linfcitos T. Para verificao da
consistncia dos nossos resultados ser necessrio tambm aumentar o nmero de amostras,
bem como efectuar o estudo num maior nmero sesses de dilise.

36
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise

Captulo 7

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