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Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique

Universit Ferhat Abbas de Stif

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie

Polycopi du Cours: Techniques dextraction, de purification et de


conservation
Master I: Analyses biochimiques
Prsent par Dr. BENABDALLAH Hassiba

Anne: 2015/2016
Intitul du Master: Analyses Biochimiques

Intitul de la matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation.

Semestre: 02

Contenu de la matire:

1) Solvants organiques.
2) Types dextraction (solvant, aqueuse, vapeur etc.).
3) Moyens de purification: filtration, centrifugation, chromatographie, lectrophorse.
4) Techniques de conservation: froid (cryoconservation), vaporation, lyophilisation.
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation i

Sommaire
Chapitre I: Les solvants organiques
I) Dfinitions...... 1
II) Classification........ 1
1. Solvants hydrocarbures.. 1
1. 1. Hydrocarbures aliphatiques (alcanes, alcne). 1
1. 2. Hydrocarbures aromatiques (benzne, tolune, xylne). 2
1. 3. Mlanges ptroliers complexes... 4
2. Solvants oxygns... 5
3. Solvants halogns.. 6
III) Utilisations...... 7
IV) Proprits physico-chimiques 8
V) Toxicit des solvants.... 9

Chapitre II: Types dextraction


I) Introduction....... 13
II) Dfinitions..... 13
III) Intrt de lextraction.... 14
IV) Types dextraction.......... 14
4. 1. Enfleurage........... 14
4. 2. Extraction par solvant. 15
4. 3. Types dextraction par solvant.... 16
4. 3. 1. Extraction directe 16
4. 3. 2. Extraction liquide-liquide.... 16
4. 3. 2. 1. Principe... 17
4. 3. 2. 2. Types dextraction liquide-liquide 17
A) Extraction liquide-liquide discontinue 17
B) Extraction liquide-liquide continue 18
4. 3. 3. Extraction solide-liquide. 18
4. 4. Extraction par hydro-distillation (ou par entrainement la vapeur deau) 20
4. 5. Extraction des protines.. 21
4. 5. 1. Techniques mcaniques.. 21
4. 5. 1. 1. Le broyage mcanique 21
4. 5. 1. 2. La bombe disruption. 22
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation ii

4. 5. 1. 3. La Presse de French 22
4. 5. 1. 4. La sonication (Ultrasons) 22
4. 5. 1. 5. La conglation-dconglation. 23
4. 5. 2. Les Techniques chimiques et enzymatiques... 23
4. 5. 2. 1. La lyse ou choc osmotique.. 23
4. 5. 2. 2. Modification de la force ionique ou du pH. 23
4. 5. 2. 3. Lyse enzymatique 23
4. 6. Extraction des acides nucliques. 23
Chapitre III: Moyens de purification
1. La filtration
I) Dfinition de la purification 25
II) Moyens de purification.. 25
2. 1. Filtration.. 25
2. 1. 1. Principe de la filtration 25
2. 1. 2. Matriel de filtration... 26
2. 1. 2. 1. Les filtres. 26
a) Les filtres dpaisseur (pais ou en profondeur) .. 26
b) Les filtres membranes (crans ou de surface) 27
2. 1. 2. 2. Les entonnoirs. 27
a) Les entonnoirs ordinaires 27
b) Les entonnoirs spciaux. 27
2. 1. 3. Mthode de filtration... 28
2. 1. 3. 1. Filtration gravimtrique (filtration par gravit) .. 28
2. 1. 3. 2. Filtration sous vide.. 29
2. 1. 3. 3. Filtration sous pression... 29
2. 1. 3. 4. Ultrafiltration .. 30
2. La centrifugation
2. 1. Introduction .... 31
2. 2. Dfinition ... 31
2. 3. Principe . 31
2. 4. Matriel de centrifugation... 31
2. 5. Type de centrifugeuses ... 32
2. 6. Types de centrifugation... 33
2. 6. 1. La centrifugation diffrentielle .. 33
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation iii

2. 6. 2. La centrifugation en gradient de densit 34


3. La chromatographie
3. 1. Historique 37
3. 2. Dfinition 37
3. 3. Principe... 37
3. 4. Types de chromatographie.. 38
3. 4. 1. Chromatographie sur colonne. 38
3.4.1. 1. Chromatographie dexclusion strique (filtration sur gel ou tamisage molculaire) 42
3. 4. 1. 2. Chromatographie changeuse dions.. 44
3. 4. 1. 3. Chromatographie daffinit. 47
3. 4. 1. 4. Autres types de chromatographie sur colonne 50
A. Chromatographie dinteraction hydrophobe.. 50
B. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) . 51
4. Llectrophorse
4. 1. Historique 53
4. 2. Dfinition 53
4. 3. Principe... 54
4. 4. Facteurs influenant la mobilit lectrophortique. 54
4. 4. 1. Nature de la molcule.. 54
4. 4. 2. Composition ionique du tampon dlectrophorse. 54
4. 4. 3. Support 54
4. 4. 4. Champ lectrique ... 55
4. 5. Types dlectrophorse... 55
4. 5. 1. Electrophorse en des conditions non dnaturantes 55
4. 5. 2. Electrophorse en des conditions dnaturantes. 55
4. 5. 3. Electrophorse en veine liquide (lectrophorse libre) 56
4. 5. 4. Electrophorse de zone sur support 56
4. 6. Autres types dlectrophorse. 61
4. 6. 1. Electrophorse bidimensionnelle 61
4. 6. 2. Isolectrofocalisation.. 61
4. 6. 3. Electrophorse en champ puls.. 63
4. 6. 4. Immunolectrophorse 63

Chapitre IV: Techniques de conservation


I) Dfinition de la conservation... 65
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation iv

II) Les techniques de conservation.. 65


2. 1. La conservation par schage... 65
2. 1. 1. La dshydratation 66
2. 1. 2. La lyophilisation.. 66
2. 1. 3. Le fumage et le salage. 68
2. 2. La conservation par chaleur 69
2. 2. 1. La pasteurisation. 69
A) La pasteurisation basse.. 69
B) La pasteurisation rapide haute temprature. 70
2. 2. 2. Lappertisation 70
2. 3. La conservation par froid 71
2. 3. 1. La cryoconservation .. 71
2. 3. 2. La rfrigration 72
2. 3. 3. La conglation. 72
2. 3. 4. La surglation.. 73
2. 4. La conservation par agents chimiques 73
Rfrences bibliographiques.... 75
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CHAPITRE I: LES SOLVANTS ORGANIQUES

I) Dfinitions
Un solvant est une substance qui a le pouvoir de former avec dautres substances une
solution homogne. Les solvants sont ainsi utiliss pour extraire (industrie chimique,
ptrochimique, pharmaceutique et alimentaire), dissoudre (dgraissage) et suspendre (peintures)
des substances gnralement insolubles dans leau ou pour modifier les proprits physiques
dun matriau (exp. Diluant).

Un solvant est un liquide qui a la proprit de dissoudre et de diluer dautres substances


sans les modifier chimiquement et sans lui-mme se modifier. Cest un liquide qui permet, aprs
ajouts des ractifs, dobtenir une phase liquide homogne.
Le terme solvant organique se rfre aux solvants qui sont des composs organiques qui
contiennent des atomes de carbone. Daprs Cohr, un solvant organique est un compos
chimique ou un mlange qui est liquide entre 0C et 200C approximativement, qui est volatil et
relativement inerte chimiquement. Les solvants peuvent aussi tre utiliss pour extraire les
composs solubles dun mlange, lexemple le plus commun tant linfusion de th dans de leau
chaude (Leau est le solvant le plus courant).
Pour les solutions liquides (phase uniforme liquide contenant plusieurs espces
chimiques), si lune des espces est trs largement majoritaire (au moins un facteur 100), on
lappelle le solvant. Cest le cas de leau pour les solutions aqueuses (par exemple une
solution aqueuse de sulfate de cuivre: leau est le solvant et les ions sulfate et cuivre les soluts).
Donc, le solvant est le liquide le plus abondant, le solut le moins abondant.

II) Classification

Les solvants organiques sont classs en trois familles:

1. Solvants hydrocarbures
Les hydrocarbures constituent la classe des solvants organiques la plus rpondue. Les
solvants de cette catgorie ne contiennent que du carbone et de lhydrogne dans leur structure
molculaire. On distingue les hydrocarbures aliphatiques, les hydrocarbures aromatiques ainsi
que les mlanges ptroliers complexes.

1. 1. Hydrocarbures aliphatiques (alcanes, alcne)


On distingue les hydrocarbures aliphatiques saturs (alcanes) qui ne contiennent que des
liaisons simples des hydrocarbures insaturs qui contiennent au moins une double liaison. Les

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composs saturs ont la formule CnH2n+2 mais seules les molcules avec cinq carbone ou plus
sont des solvants liquides la temprature normale. Les chanes carbones peuvent tre linaires
(n-hexane) ou ramifies (iso-pentane). Les composs insaturs (les alcnes) sont moins rpondus
comme solvants sauf pour certains produits naturels comme les terpnes. Les solvants
aliphatiques sont utiliss notamment dans les adhsifs (exp. Lhexane).

1. 2. Hydrocarbures aromatiques (benzne, tolune, xylne)


Ils possdent un cycle insatur six atomes de carbone comme le benzne (Fig. 1). La
srie aromatique comprend tous les liquides volatils dont la structure molculaire comporte le
noyau benznique:

Figure 1. Structure et reprsentation du benzne.


Les solvants aromatiques comportent un seul cycle benznique avec une ou plusieurs
chanes latrales (le tolune, le xylne, etc.). Ces composs sont largement utiliss dans la
formulation de peintures industrielles. Le terme dhydrocarbure aromatique lourd est utilis
lorsquil ya trois carbones ou plus au total sur une ou plusieurs chanes latrales.
Les drivs du benzne
On parle de driv benznique ou de driv du benzne pour les composs comportant un
noyau central de benzne substitu par un six groupes (Tab. 1). Par exemple, le phnol et le
tolune sont des drivs benzniques monosubstitus, le premier possdant un groupe hydroxyle,
le second un groupe mthyle attach au noyau benznique. Lorsque le noyau benznique possde
plus dun substituant leur rpartition spatiale est la cible dune nomenclature spciale, et on
rpartit les composs dans les diffrents groupes, ortho, mta et para en fonction de la position
respective de chaque groupe. Par exemple, il existe trois isomres du crsol, en fonction de la
disposition des groupes hydroxyle et mthyle sur le cycle; si les deux groupes sont voisins, il
sagit de lisomre ortho (1,2-mthylphnol), sils sont spars par un atome de carbone non
substitu, il sagit de lisomre mta (1,3-mthylphnol) et sils sont opposs sur le cycle, il
sagit de lisomre para (1,4-mthylphnol). De mme, le xylnol possde deux groupes
mthyles et un groupe hydroxyle, ce qui lui donne six isomres.

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Tableau 1: Reprsentation de quelques drivs benzniques.

Tolune thylbenzne paraxylne mtaxylne

Msitylne Durne Biphnyle Phnol

Les composs comportant un cycle benznique partagent un certain nombre de


proprits, notamment:
Ils sont en gnral aromatiques ( quelques exceptions);
Leur ratio carbone-hydrogne est lev; de ce fait, ils brlent avec une flamme jaune
dgageant beaucoup de fume;
La forte concentration en charge ngative sur le cycle le rend nuclophile, et favorise les
ractions de type substitution lectrophile aromatique.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques
Ce sont des composs comportant plusieurs cycles benzniques fusionns (Tab. 2). Parmi
lesquels les plus courants le naphtalne, constitu de deux cycles benzniques fusionns,
lanthracne qui en compte trois, aligns, le ttracne (quatre, aligns) et le pentacne (cinq,
aligns). Le phnanthrne et le triphnylne sont des exemples dhydrocarbures aromatiques
polycycliques avec connexions non linaires. Les hlicnes et le corannulne sont
particulirement prsents dans les drivs lourds du ptrole et du charbon (goudron de houille:
combustible minral provenant de la dcomposition et de la transformation des vgtaux au
cours du temps). Ils font partie des polluants organiques persistants les plus rpandus, restant
dans lenvironnement marin sur les plages trs longtemps aprs une mare noire. Ils sont
toxiques, et la plupart du temps cancrignes.

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Tableau 2: Quelques hydrocarbures aromatiques polycycliques.

Anthracne Benzo[a]pyrne Chrysne Coronne

Corannulne Ttracne Naphtalne Pentacne

Phnanthrne Pyrne Triphnylne Ovalne

1. 3. Mlanges ptroliers complexes


Les raffineries de ptrole, en plus de produire les hydrocarbures simples, fabriquent des
mlanges complexes dhydrocarbures aliphatiques, aromatiques ou comportant les deux sries
la fois. La plupart des solvants ptroliers commercialiss sont donc des mlanges obtenus par
sparations physiques du ptrole brut. Ces coupes ptrolires se distinguent par leur gamme de
point dbullition et leur composition chimique, selon les fractions dont ils sont drivs et les
divers traitements auxquelles elles sont soumises: hydrodsulfration (pour enlever lhydrogne
sulfur), hydrotraitement (hydrognation catalytique qui convertit les aromatiques en
alicycliques, aussi appels naphtniques), extraction par solvant (pour extraire les aromatiques)
ou reformage catalytique (pour augmenter notamment la teneur en aromatiques).
On peut les grouper en trois grandes catgories, comportant chacune plusieurs sous-
catgories.
Les mlanges plus faible point dbullition sont utiliss principalement dans les
adhsifs, les peintures et lindustrie du caoutchouc. Les pluparts sont dsormais
hydrotraits et comportent peu de n-hexane.
Les mlanges un point dbullition plus lev: Les essences minrales sont utilises
dans les peintures et pour le dgraissage. Ce sont des mlanges composs principalement
dhydrocarbures aliphatiques (et alicycliques) avec, selon les catgories, une fraction
dhydrocarbures aromatiques lourds, ne dpassant gnralement pas 25%.
Les mlanges haut point dbullition: comprenant principalement des hydrocarbures
aromatiques lourds, qui ont un pouvoir de dissolution sensiblement plus lev que les
catgories prcdentes.
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2. Solvants oxygns
Ils regroupent plusieurs classes:
Les alcools: Sont des composs organiques dont lun des carbones est li un groupe
hydroxyle. Ce sont des solvants oxygns de synthse (exp. mthanol, thanol, etc.). Ils
rsultent de la substitution de lhydrogne sur un hydrocarbure R-H par la fonction OH
pour donner R-OH. Un alcool monohydrique est un alcool qui contient une seule fonction
hydroxyle par molcule.
Les alcools de faible masse molculaire se prsentent temprature ambiante comme des
liquides incolores; les alcools plus lourds comme des solides blanchtres. Ils sont solubles
dans leau. La solubilit diminue cependant en fonction de la masse molculaire de lalcool.
Les alcools ont des densits et des tensions superficielles semblables plusieurs ctones
aliphatiques. Ils possdent une large gamme de taux dvaporation et un excellent pouvoir
solvant pour divers polymres et rsines. Les alcools sont utiliss dans la formulation de
dtergent, de produits de soins personnels, de revtements, adhsifs et encres.
Les glycols: Sont appels aussi polyols ou polyalcools. Ce sont des composs organiques
caractriss par un certain nombre de groupes hydroxyle (au moins deux groupes). Par
rapport aux alcools simples, laugmentation du nombre de groupes hydroxyle entraine une
augmentation trs importante de leur point dbullition et de leur viscosit ainsi quune
solubilit accrue dans leau. Ils sont peu volatils. Lthylne glycol est le plus simple des
diols. Cest un liquide incolore, inodore et peu volatil avec une faible viscosit. Il est utilis
notamment comme antigel dans les radiateurs dautomobile et dans les peintures en phase
aqueuse. Un autre diol cest le propylne glycol, il est moins toxique, et employ dans
lindustrie alimentaire et pharmaceutique.
Les ctones: Sont caractrises par le groupement fonctionnel carbonyle -C=O, o un atome
de carbone est reli un atome doxygne par une double liaison. Les ctones de faibles
poids molculaires sont solubles dans leau. A partir de C5, cette solubilit est presque nulle.
Ce sont des solvants de haut pouvoir de dissolution, de faibles viscosits et sont miscibles
avec les hydrocarbures. Elles ont gnralement des densits plus faibles que celles des autres
solvants oxygns. Elles ont aussi de faibles tensions superficielles et offrent une large
gamme du taux dvaporation. Ces solvants sont trs volatils et inflammables. Ils sont
employs dans les nettoyants et les dgraissants industriels. Les principaux sont lactone
(CH3-C(=O)-CH3), la mthylthylctone. Il existe galement des ctones aromatiques
comme la cyclohexanone ou les quinones qui comportent deux fonctions ctone.

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Les esters organiques: Sont une famille de solvants oxygns caractriss par la prsence
dun groupement carboxyle au sein dune chane de carbone et dhydrogne plus au moins
longue. Ils sont obtenus par raction dun acide organique avec un alcool. Les esters ont de
faibles tensions superficielles et se prsentent dans une large gamme de taux dvaporation.
Ce sont des liquides incolores. Ceux de faibles poids molculaires sont partiellement
solubles dans leau. Les actates sont les esters les plus utiliss comme solvant. Ils sont
volatils temprature ambiante. Il existe galement des actates complexes ou mlange
produits partir de fractions ptrolires. Ils sont utiliss notamment dans la formulation des
peintures, de laques, dadhsifs et dencres.
Les thers: Sont une famille de substances oxygnes. Ils sont caractrise par la liaison
ther, forme dun atome doxygne -O- situ entre deux groupements R et R. Ils rsultant
de la dshydratation de deux alcools pour former la liaison R-O-R o R et R sont des
chanes plus au moins complexes et ramifies qui peuvent se rejoindre pour former un cycle.
Les thers aliphatiques sont peu solubles dans leau alors que les thers alicycliques le sont
plus. Les thers utiliss comme solvants sont des liquides volatils temprature ambiante.
Ils sont incolores et dodeur caractristique. Ils sont utiliss comme solvants ractionnels.
Les thers sont plus au moins solubles dans leau et dans les hydrocarbures. Ils sont tous
inflammables. Les thers ont tendance former des peroxydes et des hydroperoxydes qui
posent des problmes de scurit en raison de leur potentiel explosif.
Les thers de glycol: Constituent un groupe de solvants oxygns drivs de lthylne
glycol ou du propylne glycol. Aux conditions normales dutilisation, sont des liquides
incolores odeur lgrement thre, modrment volatils et de viscosit moyenne. Leur
large utilisation tient leur caractre amphiphile qui leur confre une affinit la fois pour
les composs polaires (eau, alcool, ctone) et les composs apolaires (hydrocarbures). Les
thers de glycol sont donc de bons solvants pour de nombreuses substances et peuvent tre
utiliss pour rendre miscibles des solvants autrement non-miscibles. On les trouve aussi
comme principaux composants dans les colles, les encres, les peintures, les vernis, les
diluants, les cosmtiques notamment les teintures pour cheveux, les produits dentretien
comme les lave vitres, les produits pour la mcanique et la mtallurgie (dgraissants).

3. Solvants halogns
Les solvants halogns sont des hydrocarbures o lon a remplac un ou plusieurs atomes
dhydrogne par des atomes dhalognes (brome, chlore, fluor, iode).
Les solvants chlors sont les plus rpondus suivis des fluors. La plus grande partie des
solvants halogns est issue des hydrocarbures aliphatiques. A part les plus petites molcules qui

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sont gazeuses (chloromthane, dichloromthane, chlorothane, chlorothylne, bromomthane),


tous les drivs halogns couramment utiliss sont des liquides incolores. Les solvants chlors
ne sont pas ou peu inflammables, de mme que les drivs fluors. Ils ont tous des points
dbullition et des densits plus levs que ceux des hydrocarbures correspondants. Ils sont
moins volatils et insolubles dans leau mais sont dexcellents solvants pour de nombreux
polymres synthtiques, huiles et graisses minrales. Les solvants halogns sont largement
utiliss dans le dgraissage la vapeur de surfaces mtalliques (trichlorthylne). Dautres
applications incluent le dcapage de peinture (dichloromthane) et le nettoyage sec
(perchlorthylne).

Selon leur structure molculaire, les solvants sont classs aussi en:
Solvants protiques polaires (solvants protognes): possdant un ou plusieurs atomes
dhydrogne susceptible(s) de former des liaisons hydrogne. Par exemple, leau, le
mthanol, lthanol, etc.
Solvants aprotiques polaires: possdant un moment dipolaire non nul et dnus
datomes dhydrogne susceptibles de former des liaisons hydrogne. Par exemple,
lactonitrile (CH3CN), le dimthylsulfoxyde (DMSO, (CH3)2SO), le ttrahydrofurane
(THF, C4H8O), etc.
Solvants aprotiques apolaires: possdant un moment dipolaire permanent nul. Par
exemple, le benzne, les hydrocarbures: alcanes linaires ou ramifis, alcanes cycliques,
alcnes, etc.

III) Utilisations
Un solvant organique dsigne tout compos organique utilis seul ou en association avec
dautres agents, sans subir de modification chimique, pour dissoudre des matires premires, des
produits ou des dchets, ou utilis comme agent dextraction (extraction des principe actifs
base de plantes) et de sparation analytique ou prparative.
Au XIXe sicle, lindustrie a dvelopp de nouveaux solvants. Avec eux, les chercheurs
ont isol des espces chimiques de certaines plantes pour en faire le principe actif de
mdicaments (un anti-inflammatoire venant de la reine des prs, un anticancreux venant de
lif,).
Les solvants servent comme milieux ractionnels, agents de nettoyage pour dissoudre des
salissures, ou comme dissolvant, disperseur, correcteur de viscosit, correcteur de tension
superficielle, plastifiant ou agent protecteur, adjuvants et diluants (peinture, vernis, encres,
colles, pesticides), dgraissants (le perchlorothylne qui est utilis pour le nettoyage sec),

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purifiants (parfums, mdicaments), dcapants (limination des peintures, vernis, colles), support
pour le conditionnement, le transport et la mise en uvre de cosmtiques, peintures et encres.

IV) Proprits physico-chimiques


Les solvants sont souvent des liquides transparents avec une odeur caractristique.
Certains solvants organiques se dissolvent dans leau. Dautres ne se mlangent pas, mais plutt
quils forment une couche spare avec une limite visible entre eux.
Habituellement, certains solvants ont une temprature de fusion faible et svaporent
facilement et faire bouillir basse temprature, tandis que dautres svaporent plus lentement et
faire bouillir des tempratures leves. La plupart des solvants organiques ont une densit
infrieure celle de leau, tandis que quelques-uns sont plus denses que leau. A lexception des
solvants halogns, la plupart des solvants sont plus lgers que leau.

Tableau 3: Structure chimique et caractristiques de certains solvants.

Formule Temprature Constante Masse


Solvant
chimique dbullition dilectrique volumique

Solvants aprotiques apolaires

Cyclohexane C6H12 80,75 C 1,9 0,7786 gml-1

CH3-CH2-CH2-
Hexane 69 C 2,0 0,655 gml-1
CH2-CH2-CH3

Benzne C6H6 80 C 2,3 0,879 gml-1

Tolune C6H5-CH3 111 C 2,4 0,867 gml-1

CH3CH2-O-CH2-
ther dithylique 35 C 4,3 0,713 gml-1
CH3

Chloroforme CHCl3 61 C 4,8 1,498 gml-1

CH3-C(=O)-O-
Actate dthyle 77 C 6,0 0,894 gml-1
CH2-CH3

Solvants aprotiques polaires

1,4-Dioxane /-CH2-CH2-O-
101 C 2,3 1,033 gml-1
CH2-CH2-O-\

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Ttrahydrofurane /-CH2-CH2-O-
66 C 7,5 0,886 gml-1
(THF) CH2-CH2-\

Dichloromthane
CH2Cl2 40 C 9,1 1,326 gml-1
(DCM)

Actone CH3-C(=O)-CH3 56 C 21 0,786 gml-1

Actonitrile (MeCN) CH3-CN 82 C 37 0,786 gml-1

Dimthylformamide
H-C(=O)N(CH3)2 153 C 38 0,944 gml-1
(DMF)

Dimthylsulfoxyde
CH3-S(=O)-CH3 189 C 47 1,092 gml-1
(DMSO)

Solvants protiques polaires

Acide actique CH3-C(=O)OH 118 C 6,2 1,049 gml-1

CH3-CH2-CH2-
n-Butanol 118 C 18 0,810 gml-1
CH2-OH

CH3-CH(-OH)-
Isopropanol (IPA) 82 C 18 0,785 gml-1
CH3

Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 C 20 0,803 gml-1

0,7 gml-1 -
Ammoniac NH3 -33,35 C 22
33 C

thanol CH3-CH2-OH 79 C 24 0,789 gml-1

Mthanol CH3-OH 65 C 33 0,791 gml-1

Acide formique H-C(=O)OH 101 C 58 1,21 gml-1

Eau H-O-H 100 C 80 1,000 gml-1

V) Toxicit des solvants


Aucun solvant nest inoffensif. Ils ont tous des effets sur la sant, variables selon les
produits et la nature de lexposition professionnelle, qui peuvent tre locaux (picotements:
sensations de piqres, irritations) ou gnraux (ou encore systmiques: vertiges, tats brieux,
intoxications aigus, coma). Ces produits savrent souvent dangereux pour lenvironnement
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et la sant humaine. Les solvants peuvent pntrer dans lorganisme de trois manires: voie
respiratoire (grce leur volatilit), voie cutane (quel que soit ltat de la peau), voie digestive
(absorption accidentelle). Ils sont alors soit limins sous forme inchange dans lair expir, soit
fixs dans les tissus, soit mtaboliss par le foie puis limins dans les selles, les urines et lair
expir. Le foie a notamment pour rle de transformer les substances trangres telles que les
solvants, en produits liminables. Certaines tapes de cette transformation peuvent aboutir des
drivs hautement toxiques. Les solvants peuvent provoquer des maladies de la peau, des lsions
chroniques du cerveau et le cancer.
Les homologues suprieurs du benzne (tolune, xylne) ont t incrimins dans la survenue
dun syndrome psycho-organique. Le tolune, le xylne et le styrne sont des narcotiques et
des irritants cutans et respiratoires. Le benzne est particulirement toxique vis vis de la
moelle osseuse, do linterdiction de son utilisation des concentrations suprieures 1%.
Les hydrocarbures chlors sont potentiellement hpato- et nphrotoxiques et ont une action
dprimante sur le systme nerveux central. Certains dentre eux sont aussi toxiques pour le
systme nerveux priphrique. Certains drivs des hydrocarbures aliphatiques (donnants
naissance dans lorganisme des poxydes) sont mutagnes et cancrignes.
Les alcools exercent une action narcotique et irritante. Leur inhalation peut provoquer des
vertiges et des cphales. Les vapeurs de butanol peuvent lser la corne (membrane de
lil).
Bien que les ctones soient modrment toxiques, elles ont une action narcotique. Le
mthyl-n-butylctone provoque des neuropathies priphriques.
Les thers ont des proprits anesthsiques et narcotiques. Certains sont hpatotoxiques. Les
drivs chlors du mthylther sont cancrignes.
Des contacts rpts avec des solvants peuvent en outre avoir des effets sur le systme
nerveux, le sang (hmatoxicit, cancer), le foie ou les reins (insuffisances rnales ou hpatiques,
cancers), le systme de la reproduction (fertilit, grossesse), le systme endocrinien et
cardiovasculaire. Certains solvants peuvent aussi avoir des effets mutagnes, tratognes et
cancrignes. Ces effets toxiques ou ces pathologies apparaissent parfois plusieurs annes aprs
lexposition.
a) Effets sur le systme nerveux central
Le systme nerveux est lorgane le plus sensible et le premier montrer des effets dus
une exposition aux solvants. La majorit des solvants tant liposolubles altrent la couche
lipidique de la membrane de la cellule nerveuse et de la myline (une action dmylinisante sur
le tissu nerveux). A forte concentration et lors dexposition aigu, les solvants dpriment le

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

systme nerveux. A faible concentration, ils provoquent des troubles du comportement et des
perturbations psychomotrices telles que: asthnies, cphales, troubles de la mmoire et de la
vigilance, vertiges et troubles de lhumeur. Ces manifestations sont en gnral rversibles
larrt de lexposition.
Dans le cas de mlange de solvants, des effets neurocomportementaux ont t dcel
alors que lintensit dexposition de chaque solvant considr isolment est faible. Lexposition
chronique aux vapeurs de divers solvants peut engendrer un syndrome psycho-organique,
caractris par un dficit intellectuel et des troubles motionnels.
b) Effets sur le systme nerveux priphrique
Lexposition chronique certains solvants (n-hexane, mthylbutylctone, mlange de
solvants) pourrait favoriser le dveloppement dune neuropathie priphrique. Des
polyneuropathies priphriques sont caractrises par une dgnrescence anoxale, et se
manifestent principalement par des symptmes de crampes musculaires, de faiblesse,
dengourdissements, de picotements et de douleur, surtout au niveau des membres infrieurs.
c) Effets sur la peau
Etant donn les proprits lipophiles de la plupart des solvants, ils exercent une action
dgraissante, do scheresse, crevasses (dchirure) et irritation de la peau. Dans certains cas, les
solvants peuvent mme dclencher des processus allergiques conduisant linstallation de
vritables eczmas (exma: maladie de la peau).
d) Effets sur les voies respiratoires
Les symptmes dirritation des voies respiratoires chez les travailleurs exposs aux
manations (odeur) des solvants ne sont pas exceptionnels.
e) Effets sur les reins
Il ne fait pas de doute quune exposition massive des solvants puisse provoquer des
lsions rnales. Plusieurs enqutes pidmiologiques semblent confirmer lhypothse quune
glomrulonphrite chronique (ventuellement auto- immune) pourrait tre induite par
lexposition aux solvants. Latteinte rnale auto-immune pourrait aussi bien tre induite par une
exposition aigu ou chronique aux solvants. Certains solvants (notamment les halogns)
exercent une action toxique directe sur le rein.
f) Effets sur le foie
Lexposition aigu certains solvants comme le ttrachlorure de carbone, le 1,2-
dichlorothane, le dimthylformamide peut engendrer une hpatite aigu cytolytique, plus
rarement une atteinte cytolytique et cholestasique suite lexposition des solvants comme le
ttrachlorthane.

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

g) Effets sur le systme hmatopotique


Le benzne connu pour son action aplasiante et leucmogne. Bien quil soit actuellement
soumis une rglementation trs stricte on le retrouve en quantits non ngligeables dans les
carburants et comme impuret dans les autres solvants. Le tolune et le xylne ne sont pas
hmatotoxiques. Laction dysplasiante dautres solvants comme le styrne et les thers de glycol
nest pas exclure.
h) Effets cancrigne
Plusieurs solvants, ou leurs mtabolites, ont des proprits mutagnes et/ou cancrignes
et/ou tratognes. Laction cancrigne du benzne nest plus un thme de discussion; Dautres
solvants sont souponns tres cancrignes ainsi les solvants halogns, le ttrachlorure de
carbone, le 2-nitropropane sont suspects provoquer ou augmenter le risque de cancer du foie.
i) Effets sur la fonction de reproduction
La majorit des solvants passent la barrire placentaire do ils ont ts souponns dans
plusieurs tudes avoir des effets sur la reproduction titre dexemple avortements spontans,
retard de croissance intra-utrine, et faible poids de naissance et malformations (en particulire
du systme nerveux central, bec de livre). Certains solvants sont mme incrimins dans les
troubles de la spermatogense et par consquent la fertilit masculine.

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

CHAPITRE II: TECHNIQUES DEXTRACTION

I) Introduction
Lextraction est utilise pour extraire slectivement un ou plusieurs composs dun
mlange initial, sur la base de proprits chimiques ou physiques.
Lhomme utilise des colorants, des parfums, des armes, et des extraits de produits
naturels depuis la haute Antiquit, par diffrentes techniques:
La filtration: Depuis les temps prhistoriques, lhomme utilise un lit de sable ou de mousse
pour rendre une eau boueuse (pleine de boue) limpide (claire et transparente).
Le pressage: Consiste exercer une pression sur une orange pour obtenir le jus, ou craser
des fleurs pour extraire les armes.
Lenfleurage: Est une forme dextraction utilise en parfumerie. Il repose sur le pouvoir
dabsorption dune huile essentielle par les corps gras. Par exemple, les fleurs fragiles sont
poses sur des cadres enduits de graisse animale trs pure et inodore qui absorbe le parfum des
fleurs au contact; en fin de schage, les graisses sont imprgnes de substances odorantes.
La dcoction: Cette mthode est trs ancienne. Elle consiste chauffer la racine ou lcorce
dune plante avec de leau; jusqu ce que cette dernire soit bouillante et les constituants se
dissolvent.
Linfusion: Elle consiste verser de leau bouillante sur des plantes (les feuilles ou les fleurs)
finement broyes puis les laisser tremper pour dissoudre leurs principes actifs.
La macration: Consiste laisser sjourner froid un solide dans un liquide pour en extraire
les constituants solubles dans ce liquide.
Lextraction par solvant: Cest un procd qui permet dextraire des composs qui ne peuvent
pas ltre avec de leau.
Lentranement la vapeur ou lhydrodistillation: Cette technique date de lEgypte
ancienne. Elle consiste extraire les parfums des plantes (huiles parfumes ou huiles
essentielles) par de la vapeur deau.
Nous ne pourrons appliquer que les mthodes dextraction par hydrodistillation ou bien
par solvants, lenfleurage tant trop long et coteux en matire premire (pour un litre dabsolu
de jasmin, il faut compter un tonne de fleurs).
II) Dfinitions
Lextraction consiste transfrer un compos dune phase une autre:
Dune phase liquide une autre phase liquide.
Dune phase solide une phase liquide.

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Cest une opration qui consiste sparer certains composs dun organisme (animal ou
vgtal) selon diverses techniques.

III) Intrt de lextraction


Le but de lextraction est disoler une ou plusieurs molcules partir dun organisme.
Ainsi, la dcouverte de nouveaux mdicaments peut passer par ltude de ces substances
naturelles et si une molcule se trouve tre performante dans un domaine prcis, elle pourra faire
lobjet dune commercialisation sous forme de mdicament.

IV) Types dextraction


Il existe plusieurs mthodes dextraction dont certaines ont t dveloppes par les
artisans parfumeurs bien avant lessor de la chimie moderne.

4. 1. Enfleurage
Il consiste extraire naturellement le parfum des fleurs grce labsorption effectue par
les corps gras. Il existe deux types denfleurage: chaud et froid selon la rsistance de
la plante la chaleur. Cette mthode est particulirement employe lorsque lhydrodistillation
dnature les molcules extraire.
Enfleurage chaud (macration): consiste faire infuser les fleurs ou autres lments
odorants dans des matires grasses, huiles ou graisses, pralablement chauffes. Les
mlanges obtenus sont ensuite filtrs travers des tissus afin dobtenir des onguents
parfums.
Enfleurage froid: Les fleurs les plus fragiles qui ne supportent pas la chaleur sont
disposes sur des chssis de verre enduit de graisse et renouveles tous les 3 7 jours
selon les espces. Lorsque le parfumeur considre que la graisse est sature, elle est
gratte et mlange un peu dalcool pour obtenir des pommades ou bien puise par de
lalcool. On obtient alors un liquide nomm labsolu (Fig. 1).

Figure 1. Enfleurage de ptales de rose.


Le principe est assez simple:

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Les molcules odorantes tant des composs volatils, au lieu de les laissez schapper
dans lair, elles sont captes par la graisse qui a la proprit de les dissoudre. Lors de lajout de
lalcool les molcules organiques passent dans ce solvant.

4. 2. Extraction par solvant


Elle consiste faire passer, par solubilisation, la substance extraire dans un solvant.
Celui-ci peut tre de leau, mais gnralement il sagira dun solvant organique: thanol,
cyclohexane, ther de ptrole, tolune, etc. Dans lextraction par solvant, les plantes sont
mlanges un solvant. Les composs extraire tant emprisonns dans la cellule par la
membrane cellulaire, il faudra donc des solvants capables de la traverser. En plus, il arrive que
des traces de solvant soient prsentes dans les molcules extraire ou bien dans la matire
vgtale aprs traitement.
Lextraction par solvant fait intervenir trois tapes.
La mise en contact du solvant avec la substance contenant le compos extraire:
Elle peut se faire directement par le solvant dextraction ou en faisant intervenir dabord
leau. On fait alors agir le solvant sur une dcoction, une infusion ou une macration.
La dcantation: Est ralise laide de lampoule dcanter. En fonction de la nature du
solvant utilis et en particulier de sa densit par rapport celle de leau (1,00), la phase
organique rcuprer se situera au dessus ou en dessous.
Le schage et la filtration: Afin dliminer le peu deau susceptible davoir t retenue dans
la phase organique, on fait agir un dshydratant. On filtre ensuite pour ne recueillir que la
phase organique exempte deau.
Gnralement, on veut ensuite vaporer le solvant pour rcuprer lextrait seul, il faudra
donc aussi que le solvant soit volatil (temprature dbullition faible).
Le choix du solvant obit trois critres et ncessite la connaissance dun paramtre
physique caractristique de ce solvant.
Ltat physique du solvant: Le solvant doit tre liquide la temprature et la pression o
lon ralise lextraction.
La miscibilit du solvant: Le solvant doit tre non miscible la phase qui contient
initialement le compos extraire.
La solubilit: Le compos extraire doit tre trs soluble dans le solvant. Cest- dire,
beaucoup plus soluble dans le solvant que dans le milieu o il se trouve initialement (milieu
aqueux en gnral).

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La densit du solvant: Il est ncessaire de connatre ce paramtre car cest lui qui dtermine
si la phase organique, contenant le compos extraire, se trouve au dessus ou en dessous de
la phase aqueuse dans lampoule dcanter.
Les solvants dextraction doivent tre aussi:
Facilement limins aprs extraction et donc avoir un point dbullition bas. Leur point
dbullition doit tre le plus loign possible de celui des produits extraire.
Inertes chimiquement vis--vis de la solution extraire.
Peu toxiques que possible.
Tableau 1: Avantages et inconvnients de quelques solvants dextraction.
Solvants Temprature Densit Avantages Inconvnients
dbullition (C)
Cyclohexane 81 0,78 Peu toxique Facilement inflammable
Dichloro-1,2-thane 83 1,26 Peu inflammable Modrment toxique, vapeurs
irritantes
Dichloromthane 40 1,34 Facile liminer Forme des mulsions, nocif
Ether thylique 35 0,71 Facile liminer Trs inflammable
Hexane 69 0,66 Facile liminer Trs inflammable
Pentane 36 0,63 Facile liminer Trs inflammable
Tolune 111 0,87 Peu toxique Inflammable
Tricholorothylne 87 1,46 Ininflammable Modrment toxique

4. 3. Types dextraction par solvant


Il existe plusieurs types dextraction par solvant.

4. 3. 1. Extraction directe
Lespce chimique est extraite dun produit naturel par macration puis filtration (par
exemple lextraction des armes des zestes dorange).

4. 3. 2. Extraction liquide-liquide
Lextraction liquide-liquide est lune des techniques de prparation dchantillons les
plus anciennes. Cest une opration fondamentale de transfert de matire entre deux phases
liquides non miscibles, sans transfert de chaleur. Cette technique permet dextraire une substance
dissoute dans un solvant, laide dun autre solvant, appel solvant dextraction, dans lequel elle
est plus soluble. Le solvant initial et le solvant dextraction ne doivent pas tre miscibles.
Lextraction liquide-liquide est ralise par le contact intime du solvant avec la solution
dans des appareils destins mlanger les deux phases (ampoules, colonnes, mlangeurs). La
sparation des phases sobtient par dcantation gravimtrique ou centrifuge.

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Lextraction liquide-liquide est la succession de plusieurs tapes. La premire tape est la


mise en contact des deux phases. Pour augmenter la surface dchange, la phase extraire et la
phase dextraction sont mlanges. La seconde tape consiste obtenir lquilibre du systme
(saturation de la phase dextraction) qui est rgi par les lois de la diffusion et de la solubilit
(coefficient de partage). La dernire tape est la sparation des phases (dcantation).

4. 3. 2. 1. Principe
Du fait que leau ne svapore pas facilement, lespce chimique est difficilement
rcuprable si elle est en solution dans leau. Dans ce cas, il faut utiliser un solvant organique
dans lequel la substance est trs soluble (beaucoup plus que dans leau), celle-ci va passer de
leau au solvant organique. Il faut que leau et le solvant organique ne soient pas miscibles.
Lextraction liquide-liquide est lune des oprations les plus pratiques dans un
laboratoire de chimie organique. Elle consiste transfrer un compos dune phase aqueuse
une phase organique ou inversement, en utilisant pour cela deux solvants (lun aqueux et lautre
organique), non miscibles, mis en contact intime.
En pratique, cette extraction est une tape de prparation dchantillons trs utilise
prsentant de multiples inconvnients lorsquelle est pratique avec une ampoule dcanter:
Multiplication des tapes dextraction pour obtenir un rendement optimum.
Utilisation dimportants volumes de solvants organiques dont les cots de recyclage
deviennent de plus en plus chers.
Difficult dmulsion qui ne permet pas la rcupration de 100% de lextrait.
Traces dluant dans le raffinat qui ncessite un traitement supplmentaire de lchantillon
avant ltape dvaporation.

4. 3. 2. 2. Types dextraction liquide-liquide


Il existe deux types dextraction liquide-liquide.
A) Extraction liquide-liquide discontinue
Elle est ralise grce des ampoules dcanter. Il existe plusieurs modles dampoules
dcanter (Fig. 2). Celles ayant la tubulure au dessus du robinet sont les plus utilises, car elles
permettent de mieux visualiser linterface et donc de mieux sparer les deux phases.

Figure 2. Les diffrents types dampoule dcanter.


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B) Extraction liquide-liquide continue


Lorsque le produit isoler est relativement soluble dans la phase extraire, lextraction
discontinue peut se rvler insuffisante. On peut alors utiliser une mthode dextraction en
continu. Le solvant est recycl et passe continuellement travers la solution extraire.

4. 3. 3. Extraction solide-liquide
Lextraction solide-liquide est un phnomne lent qui permet dextraire une substance
prsente dans un solide pour la faire passer dans un solvant liquide. On peut utiliser
successivement des liquides dont le pouvoir solvant vis--vis des constituants de la phase solide
est diffrent (dissolution fractionne). La macration, linfusion et la dcoction sont des
mthodes dextraction solide-liquide.
Pratiquement, il est impossible de dissoudre un seul compos, dautres constituants de la
phase solide ont t entranes avec lui, quelque soit le solvant utilis. En laboratoire de chimie
organique, on utilise parfois des appareils plus efficaces, les extracteurs de Soxhlet et de
Kumagawa, qui fonctionnent en continu (Fig. 3).

A) Techniques de dissolution
Il faut avant tout rduire le prlvement en fines particules ce qui favorise laction du
solvant en augmentant la surface de contact.
Il est possible de procder en continu ou effectuer des phases successives dextractions
suivies de filtration ou de centrifugation.
Extracteur de Soxhlet Extracteur de Kumagawa

Lextracteur de Soxhlet est un appareil utilis Trs proche de lextracteur de Soxhlet, le


en chimie analytique qui permet de faire Kumagawa a lavantage de pouvoir tre
chaud lextraction par solvant dun solide utilis des tempratures bien suprieures
avec une grande efficacit. Cet appareil porte et dtre moins encombrant grce la
le nom de son inventeur: Franz Von Soxhlet. cartouche incorpore dans le porte-ballon.

Figure 3. Les extracteurs de Soxhlet et de Kumagawa.


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B) Principes des techniques de dissolution


Les principes des techniques de dissolution sont les suivants:
La variation du pouvoir solvant:
- La dissolution fractionne: Consiste utiliser initialement des liquides faible pouvoir
solvant puis augmenter progressivement la capacit de dissolution par lemploi des
solvants de plus en plus actifs.
- Le gradient de dissolution: Consiste utiliser de mlanges de solvants.
La limitation du volume de solvant: Afin dviter lutilisation de grands volumes de
solvants, il faut raliser lextraction et la concentration dans le mme appareil.
En rgle gnrale, un solide ne se laissera pas traverser par un liquide. Il est donc
ncessaire de raliser plusieurs extractions successives par utilisation dun extracteur de Soxhlet,
ou alors sa variante plus conomique.
C) Appareil de Soxhlet
Le Soxhlet est constitu dun (Fig. 4):
Ballon contenant une rserve de solvant.
Extracteur proprement dit permettant le contact entre le solvant et le solide dans une
cartouche poreuse.
Siphon qui permet lvacuation de la solution vers le ballon.
Rfrigrant eau qui permet la condensation des vapeurs de solvant dans la cartouche.
Le solide est toujours en contact avec le solvant pur grce au remplissage rgulier de la
cartouche, ce qui prsente les meilleures capacits de solubilisation des composs extraire.

Rfrigrant

Cartouche poreuse: produit extraire

Extracteur
Siphon dvacuation de lextrait

Solvant (s)

Source de chaleur

Figure 4. Schma dun appareil de Soxhlet.

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Le Soxhlet permet:
Le lavage dun compos solide par un solvant dans lequel il est totalement insoluble. Les
impurets sont extraites vers le ballon et le solide pur est rcupr dans la cartouche.
La recristallisation dun compos par un solvant dans lequel il est modrment soluble. Les
impurets insolubles restent dans la cartouche tandis que le compos cristallise dans le
ballon rcepteur par refroidissement lorsque la solution est assez concentre.
D) Mode opratoire
Il est important de rajouter quelques grains de carborundum (cristal de carbure de silicium
SiC) ou de pierre ponce dans le mlange pour viter une lvation de la temprature sans
bullition.
Le bon fonctionnement du siphon ncessite un volume suffisant du solvant dans le ballon.
Le solide est plac dans la cartouche, elle-mme insre dans lextracteur.
Le systme de chauffage est mis en marche et rgl de faon ce que les cycles
remplissage/vidange de la cartouche se fassent de faon rapproche.
Le systme peu tre laiss sans surveillance particulire si la vidange est rgulire.

4. 4. Extraction par hydro-distillation (ou par entrainement la vapeur deau)


Lhydro-distillation consiste distiller un compos par entranement la vapeur deau.
Cest une mthode trs utilise pour lextraction des huiles essentielles (Fig. 5). Elle montre ses
limites lorsque les molcules extraire sont fragiles et ne rsisteront pas au chauffage.
La vapeur deau produite va entraner avec elle un compos donn selon un phnomne
physique particulier: la cration dun azotrope (mlange de deux liquides qui bout temprature
fixe et ne se distille pas en bouillant). Il sagit en fait dun mlange de composs, non miscibles,
(leau et une molcule odorante). La vapeur deau charge en molcules organiques est
condense puis rcupre. Le liquide obtenu est appel distillat. Il y a donc sparation de deux
phases: lune aqueuse et lautre organique, cette dernire contenant le compos extraire. Pour
rcuprer lhuile essentielle, il faut procder une extraction liquide-liquide.

Figure 5. Schma dune hydro-distillation.


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Lhydro-distillation fait intervenir les tapes suivantes:


Lentranement la vapeur: Consiste bouillir un mlange deau et de substance naturelle
contenant le compos extraire (huile essentielle). La vapeur entrane les huiles essentielles
contenues dans le produit brut. Par la suite, ces vapeurs sont condenses laide dun
rfrigrant.
Le relargage: Consiste rendre les huiles essentielles, qui sont des composs organiques en
partie solubles dans leau, moins solubles par lajout du chlorure de sodium. De cette
manire, il sera plus facile de rcuprer ces huiles essentielles.
La dcantation: Est ralise dans une ampoule dcanter, dans laquelle le mlange se spare
en deux phases non miscibles. Une phase aqueuse, plus dense, se situe dans la partie
infrieure et une phase organique, de densit plus faible et contenant les huiles essentielles
se situe au dessus (Fig. 6).
Le schage et la filtration: Afin dliminer le peu deau susceptible davoir t retenue dans
la phase organique, il est important de faire agir un dshydratant (Cest le schage). Pour ne
recueillir que la phase organique exempte deau il faut raliser une filtration.

Figure 6. Processus de la dcantation aprs hydro-distillation.


4. 5. Extraction des protines
Lextraction dune protine partir dun tissu commence par la destruction de
lorganisation cellulaire par des mthodes mcaniques, chimiques ou par laction denzymes qui
dsorganisent les tissus. Le mlange rsultant du matriel biologique ainsi bris et du solvant est
appel extrait brut ou homognat. Les dbris cellulaires sont spars par centrifugation: le
matriel soluble est recueilli et dialys pour liminer les petites molcules. Diverses mthodes
sont ensuite utilises pour purifier une protine particulire partir du mlange.
4. 5. 1. Techniques mcaniques
4. 5. 1. 1. Le broyage mcanique
Les broyeurs mcaniques sont utiliss pour rduire la taille des particules de diffrents
types de matriaux. Ils sont utiliss dans le cas o le matriel est sous forme solide, sche ou
congele. Il existe deux types de broyeurs:
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A) Lhomognisateur de type Dounce


Il ressemble une prouvette dans laquelle senfonce un piston serr (Fig. 7). Le
renflement du piston et la zone de broyage du mortier sont souvent en verre fritt. Le passage des
cellules dans lespace trs petit entre le piston et la paroi interne du tube induit leur rupture.
B) Lhomognisateur de type Potter-Elvehjem
Il sagit dun pilon compos dune tige dacier et un renflement de tflon ainsi que dun
mortier de verre pais (Fig. 7).

Figure 7. Broyeurs mcaniques en verre.


4. 5. 1. 2. La bombe disruption
Cette technique consiste traiter lchantillon avec de lazote haute pression. La
pression force lazote se solubiliser dans les liquides. Par la suite, la pression est libre tout
dun coup; lazote en solution reprend son tat gazeux, forme des bulles lintrieur des cellules
et les faits clats.
4. 5. 1. 3. La Presse de French
Cest un cylindre creux en mtal dans lequel senfonce un piston mtallique dou de
plusieurs o-rings dun caoutchouc trs solide (Fig. 8). Il est utilis en exprimentation biologique
pour interrompre la membrane plasmique des cellules en les faisant passer travers une valve
troite sous haute pression, ce qui dchire leur membrane. Plus que la pression est haute dans le
cylindre, plus que la lyse est totale. Cette technique est fiable, efficace et respecte lactivit des
enzymes prsentes dans les cellules biologiques.

Figure 8. Schma de la presse de french.


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4. 5. 1. 4. La sonication (Ultrasons)
Elle consiste dtruire les cellules par les ultrasons qui sont des ondes de mme nature
que le son mais dont la gamme de frquence se situe entre 20 kHz et plusieurs centaines de
mgahertz. Cette gamme est trop leve pour que loreille humaine puisse la percevoir.
La sonication est ralise grce un appareil appel sonicateur qui permet de transformer
lnergie lectrique en vibration mcanique longitudinale le long dune sonde. Cette dernire
permet de casser les cellules biologiques en suspension. Il est indispensable de travailler basse
temprature et deffectuer des pauses entre les cycles de sonication afin dviter la surchauffe de
lchantillon.
4. 5. 1. 5. La conglation-dconglation
Des cycles de conglation (-20C) et de dconglation (37C) permettent de dtruire les
membranes plasmiques des cellules surtout lorsquil sagit dune protine ou dune enzyme
bactrienne. Durant la conglation des cristaux de glace se forment, ce qui provoque la
dsintgration de la membrane cellulaire.
4. 5. 2. Les Techniques chimiques et enzymatiques
Ces techniques regroupent la lyse ou choc osmotique, la modification de la force ionique
ou du pH et la lyse enzymatique.
4. 5. 2. 1. La lyse ou choc osmotique
Le choc osmotique consiste incuber les cellules fragiles dans une solution hypo-
osmotique, ce qui permet leau dentrer dans la cellule la fait gonfler jusqu ce que les
membranes lipidiques se rompent et laissent passer leur contenu dans le milieu. Lclatement des
organites est linconvnient de cette technique.
4. 5. 2. 2. Modification de la force ionique ou du pH
La modification de la force ionique du milieu par addition des ions ou la modification du
pH entrainent la rupture des membranes plasmiques de certains types cellulaires. Ces traitements
peuvent rendre les membranes plus permables aux constituants du milieu.
4. 5. 2. 3. Lyse enzymatique
Pour lyser la paroi cellulaire qui protge la membrane plasmique de plusieurs types de
cellules (les levures, les plantes et les bactries), diffrentes enzymes comme le lysozyme du
blanc duf de poule ou la lyticase de S. aureus peuvent tre utilises.
4. 6. Extraction des acides nucliques
Lextraction de lADN consiste isoler lADN partir dune cellule en quantit et en
qualit suffisante pour permettre son analyse. Les principales tapes de lextraction de lADN
sont:

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La lyse cellulaire par des mthodes physiques ou chimiques permet daccder lADN.
Llimination ou la sparation des lipides membranaires et des dbris cellulaires se fait
gnralement laide de dtergents comme le sodium dodecyl sulfate et par centrifugation.
Llimination ou la dnaturation des protines de lextrait cellulaire est effectue laide
dune protase.
Llimination de lARN est effectue par addition de RNase qui dgrade rapidement lARN
en ribonuclotides.
La prcipitation/agrgation/lution de lADN.

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CHAPITRE III: MOYENS DE PURIFICATION


1- La filtration

I) Dfinition de la purification
En chimie, la purification est la sparation de substances chimiques dans le but de
dcontaminer des substances.

II) Moyens de purification


Il existe plusieurs moyens de purification:
La filtration.
La centrifugation.
La chromatographie.
Llectrophorse.

2. 1. Filtration
La filtration est une mthode mcanique utilise pour sparer un solide dun liquide ou
dun gaz en faisant passer le mlange par une membrane ou un chiffon fin, par laide dun
entonnoir.
La filtration est un procd de sparation permettant de sparer les constituants dun
mlange qui possde une phase liquide et une phase solide au travers dun milieu poreux. Cest
une technique trs utilise que ce soit dans le domaine de lagro-alimentaire ou de la pharmacie
ou par de nombreuses espces animales, principalement aquatique. Lutilisation dun filtre
permet de retenir les particules du mlange htrogne qui sont plus grosses que les trous du
filtre (porosit). Le liquide ayant subi la filtration se nomme filtrat, et ce que le filtre retient se
nomme un rsidu (aussi communment appel "gteau" ou rtentat).
La microfiltration est une sparation de particules de lordre de micromtre.
La filtration strilisante est un cas particulier, les particules tant des microorganismes.
Les applications de la filtration courante rsultent de la sparation dun solide dispers
dans un liquide pour obtenir:
Un liquide clarifi, dbarrass des particules solides.
Un solide essor de lexcs de liquide.

2. 1. 1. Principe de la filtration
La filtration est une sparation selon le diamtre des particules solides de diffrentes
tailles, qui sont disperses dans un liquide. La diffrence de pression force le liquide passer
travers le filtre alors que les particules solides restent la surface.
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Deux phnomnes accompagnent souvent la filtration:


Le premier phnomne est le colmatage: La pntration des particules dans les interstices
[petits espaces vides entre les parties du filtre] de la matire filtrante provoque le phnomne
du colmatage. Ceci modifie la porosit et ralentie la filtration.
Le deuxime phnomne est ladsorption: Il rsulte de la charge lectrique qui possde la
matire filtrante. Ceci induit la rtention de certains produits par le filtre malgr que leurs
dimensions permettent leur passage travers les pores du filtre.

2. 1. 2. Matriel de filtration
Le matriel de filtration regroupe les filtres et les entonnoirs.

2. 1. 2. 1. Les filtres
Il existe deux types de filtre, les filtres dpaisseur et les filtres membranes. Lutilisation
de lun de ces deux types dpend du but de lexprience, de la qualit et la quantit du matriel
filtrer. Ils peuvent tre utiliss sparment ou ensemble, selon les besoins. Les filtres doivent tre
inerte chimiquement et physiquement vis--vis du liquide filtrer; insolubles et ne subissent
aucun changement dtat physique (gonflement, rtrcissement, distorsion).
a) Les filtres dpaisseur (pais ou en profondeur)
Ils retiennent les particules dans un rseau de fibres (papier, amiante, cellulose, coton,
fibre de verre, etc.) ou de canalicules (verre fritt, sable, charbon, etc.). Lefficacit dun filtre en
profondeur augmente avec son paisseur par contre elle diminue lorsque la pression applique
sur le filtre augmente.
Les matriaux utiliss dans les filtres dpaisseur sont:
Les papiers filtres classiques, qui diffrent par leur formes (en feuilles rectangulaires,
circulaires, plisses, etc.), leur texture (lche, fine), leur porosit, leur puret (brut, purifi,
sans cendre, etc.). Il existe des papiers filtre sans cendres, dminraliss par lavage aux
acides, dune trs grande puret et qui, aprs combustion, najoutent aucun lment tranger
au prcipit. Il existe un code de couleur ou de numrotation dfinissant la porosit du
papier.

Les textiles: gaze, coton, laine.

Les fibres: laine de verre, amiante.

Les terres dinfusoires, argiles et porcelaine.

Le matriel fritt: le verre fritt est obtenu par compression temprature contrle de
microbilles de verre. Des porosits diffrentes sont obtenues selon le diamtre de ces grains
et la temprature de frittage. Les porosits sont codes de 0 (larges pores) 4 (pores troits).

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b) Les filtres membranes (crans ou de surface)


Les plus utiliss sont les membranes millipores (Fig. 1). Ils sont constitus dune fine
lame plastique perce de pores calibrs. Les membranes filtrantes sont constitues de cellulose,
dactate de cellulose, de nitrate de cellulose ou de tflon. Le diamtre des pores est faible, et
varie de 5 35 nm pour lultra-filtration et de 0.1 8 m pour la microfiltration.
Les membranes de la microfiltration permettent une filtration rapide, malgr le faible
diamtre des pores, cela est d leur faible paisseur et la forte densit des pores (1010
pores/cm2). Ces membranes ne sont constitues que par 15 35% de leur volume par de la
matire, le reste tant occup par des pores.

Figure 1. La membrane millipore.

2. 1. 2. 2. Les entonnoirs
Ce sont des instruments en forme de cne, termins par un tube et destins recevoir un
matriel filtrant. Deux types dentonnoirs sont distingus:
a) Les entonnoirs ordinaires: peuvent tre en verre, en porcelaine ou en polycarbonate (Fig. 2).

Figure 2. Lentonnoir ordinaire.

b) Les entonnoirs spciaux: Sont des entonnoirs dont la partie plate est perfore et sur laquelle
on place de papier filtre (Fig. 3). Ils peuvent tre en verre ou en porcelaine. Deux types
dentonnoirs se distinguent dans cette catgorie:

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Les entonnoirs de BUCHNER: Utiliss pour la filtration de quantits assez importantes


de solide.
Les entonnoirs de HIRSCH: Utiliss pour la rcupration de petites quantits de solide.
a) b)

Figure 3. Entonnoirs de BUCHNER (a) et de HIRSCH (b).

2. 1. 3. Mthodes de filtration
La filtration consiste sparer les constituants dun mlange liquide -solide par passage
travers un milieu filtrant. Elle est beaucoup plus rapide que la sdimentation. Il existe plusieurs
procds de filtration.

2. 1. 3. 1. Filtration gravimtrique (filtration par gravit)


Dans cette mthode, lentonnoir de laboratoire quip dun papier filtre est utilis (Fig.
4). La diffrence de pression est cre par la hauteur du liquide sur le filtre.

Figure 4. La filtration par gravit.

La filtration gravimtrique prsente les inconvnients suivants:


La filtration est lente.

La difficult de rcupration de la phase solide isole, surtout lorsquelle est peu abondante.

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La sparation est incomplte: le solide retient une quantit non ngligeable de liquide.

2. 1. 3. 2. Filtration sous vide


La vitesse de filtration est augmente par la cration dune dpression en aval du
matriau filtrant (Fig. 5). Cest le mode de filtration utilis dune manire courante pour les
verres fritts et les membranes filtrantes. Des entonnoirs spciaux adapts sur une fiole
succion, dans laquelle on cre une dpression, sont utiliss. Lentonnoir est adapt sur la fiole
par lintermdiaire dun cne en caoutchouc, qui collera la fiole et lentonnoir lorsque la
dpression est tablie.

Figure 5. La filtration sous vide.

2. 1. 3. 3. Filtration sous pression


La vitesse de filtration est augmente en exerant une pression sur le liquide filtrer en
amant du matriel filtrant reprsent par une membrane filtrante (Fig. 6). La filtration sous
pression vite le moussage et lvaporation du solvant; elle est dun emploi frquent dans
lindustrie. Ce systme de filtration sous pression avec membranes filtrantes existe galement
sous forme de cartouches filtrantes (millipore) adaptable sur une seringue pratique pour la
filtration des petits volumes de solution filtrer.
Au laboratoire, la microfiltration strilisante laide du dispositif Swinnex Millipore est
une filtration sous pression. Ce dispositif est constitu de deux pices plastiques, que lon visse
lune sur lautre enserrant une membrane filtrante.

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Figure 6. La filtration sous pression.

2. 1. 3. 4. Ultrafiltration
Cest une sparation de macromolcules en solution dans une phase dispersante. Il sagit
dune membrane avec une porosit trs faible (25 nm) qui peut retenir les protines et les acides
nucliques. Elle permet la concentration des solutions de macromolcules et llimination de la
plupart des contaminants de petite masse molculaire (sels, glucides).
Les applications de lultrafiltration et de la microfiltration sont plus analytiques, outre la
clarification et les filtrations striles, on cite galement:
Les analyses microbiologiques et tests de strilit.
Les analyses gravimtriques.
Les isolements des cellules dun liquide cphalo-rachidien.
Les analyses de poussires.
Les isolements de virus.

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CHAPITRE III: MOYENS DE PURIFICATION


2- La centrifugation

2. 1. Introduction
La sdimentation est une technique danalyse permettant de sparer une dispersion dun
solide au sein dun liquide ou une dispersion dun liquide au sein dun autre liquide non miscible
et de densit diffrente. Cette sparation peut se faire delle-mme sous laction de la pesanteur
lorsque la dispersion est forme dune substance plus dense que le liquide (dcantation). La
centrifugation permet de remplacer lacclration de la pesanteur (g) par une acclration
centrifuge dveloppe par un rotor tournant grande vitesse (6 10000 tours par minute).

2. 2. Dfinition
La centrifugation est une technique qui permet la sparation des composs dun mlange
en fonction de leur densit sous laction dune force centrifuge. Elle permet de rcuprer un
prcipit (culot) et un surnageant. Le mlange sparer peut tre constitu de deux phases
liquides ou de particules solides en suspension dans un liquide.
Lultracentrifugation utilise des vitesses de rotation encore plus grandes (allant jusqu
75000 tours par minute) et permet la sdimentation de particules ultramicroscopiques.

2. 3. Principe
La centrifugation permet de sparer des constituants de taille et de masse trs diffrentes
contenus dans un liquide. Les constituants contenus dans un chantillon sont soumis deux
forces:
La gravit: Cest la force qui sexerce du haut vers le bas.
La pousse dArchimde: Cest la force qui sexerce du bas vers le haut.
Pour une vitesse de rotation donne, chaque rotor a une force relative de centrifugation en
x.g (force de gravit relative ou acclration) qui peut tre exprime en vitesse de rotation en
rotations par minute selon la formule mathmatique de conversion. Celle-ci est:
g = 1.119 10-5 r N2
o g est la force relative de centrifugation, r est le rayon de rotation du rotor (en cm) et N
(rotations par minute: rpm) exprime la vitesse de rotation.

2. 4. Matriel de centrifugation
La centrifugeuse est lappareil utilis pour la centrifugation. La centrifugeuse est
constitue dun axe de rotation enferm dans une chambre de centrifugation. A lexception des
centrifugeuses de paillasse dont la vitesse de rotation et le temps dutilisation sont relativement
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limits, il est ncessaire dempcher lchauffement des chantillons. Pour cela, la chambre de la
centrifugeuse doit tre rfrigre (Fig. 1).
Les chantillons centrifuger doivent tre quilibrs deux deux. Chaque couple doit
tre plac symtriquement par rapport laxe de rotation.

Figure 1. Centrifugeuse.

2. 5. Type de centrifugeuses
La force du moteur qui le fait tourner constitue la principale limite qui dtermine la
vitesse de rotation du rotor. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus leffort que doit fournir le
moteur est grand. Selon les besoins exprimentaux (acclrations, volume du matriel
centrifuger, la temprature de travail), plusieurs types de centrifugeuse ont t dvelopps.
Centrifugeuses de table (ou cliniques): Constituent les modles les plus simples et sont
caractrises par de faibles acclrations (1000 3000 g). Elles peuvent tre rfrigres.
Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes et caractriss par des
acclrations de lordre de 20000 g. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger des
volumes relativement gros. Certains rotors peuvent mme contenir quatre ou six bouteilles
de 250 ml. Tous les modles sont rfrigrs.
Ultracentrifugeuses: Comme leur nom indique, ce sont des appareils qui permettent
datteindre des acclrations trs leves (jusqu 300000 g). Tous les modles sont
rfrigrs. Les rotors ne peuvent contenir quune dizaine de tubes de 40 ml.
Micro-centrifugeuses: Ce sont des centrifugeuses spcialement conues pour les micro-
volumes. Elles peuvent tre rfrigres et atteindre des acclrations de lordre de 12
15000 g.

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Ultracentrifugeuses analytiques: Elles servent surtout analyser la taille et la masse des


particules et des protines. Elles sont moins utilises.

Selon laxe de rotation, il existe trois catgories de machines centrifuger:


Les centrifugeuses horizontales: Sont ainsi nommes car les pots sont horizontaux en
rotation. Des tubes centrifuger fond conique sont utiliss pour clarifier un liquide (pour
rcuprer le liquide surnageant et rejeter le culot). Alors que les tubes fond rond sont
utiliss pour rcuprer le culot. Ce type de centrifugeuse prsente quelques inconvnients:
mauvais arodynamisme du rotor et, de plus, les particules qui sdimentent doivent traverser
une grande paisseur de liquide
Les centrifugeuses verticales: Sont des centrifugeuses avec un bol assiettes ou chambre
qui tourne sur un axe vertical.
Les centrifugeuses obliques: Dans ce type de centrifugeuses, les tubes sont logs dans un
rotor circulaire appel couronne dans lequel ils sont inclins 45. A linverse de
centrifugeuses horizontales, ce type de centrifugeuses prsente un bon arodynamisme
permettant datteindre des vitesses leves. De plus, les particules neffectuent quun court
parcours au sein dun liquide, elles migrent horizontalement, atteignent la paroi et glissent le
long de celle-ci. Ceci favorise la sdimentation.

2. 6. Types de centrifugation
Il existe deux principaux types de centrifugation.

2. 6. 1. La centrifugation diffrentielle
Elle se base sur les diffrences de vitesse de sdimentation entre particules qui diffrent
par densit et dimensions. Le principe de ce type de centrifugation est de sparer les diffrents
constituants laide de plusieurs cycles de centrifugation acclration croissante. Dans une
centrifugation faible acclration, les lments les plus massifs vont sdimenter et former un
culot au fond du tube. Les lments dont lacclration est trop faible pour contrebalancer les
effets de lagitation molculaire, ou le temps de centrifugation est trop court vont rester dans le
surnageant. Cette mthode est utilise, par exemple, pour rcuprer les lments (les cellules) du
sang qui sdimentent pour des acclrations trs faibles.
Exemple: Isolement des organites cellulaires. Tout dabord au cours dune premire
centrifugation, les constituants les plus lourds sont isols. Puis, en augmentant la vitesse de
sdimentation les constituants de densit croissante seront spars (Tab. Fig. 2).

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Tableau. Conditions de sdimentation de quelques constituants cellulaires.


Constituants cellulaires Conditions de sdimentation

Noyau 10 minutes 500 g

Mitochondries, lysosomes, peroxysomes 10 minutes 5000 g

Rticulum endoplasmique, appareil de Golgi 1 heure 100000 g

Figure 2. Isolement des organites cellulaires.

2. 6. 2. La centrifugation en gradient de densit


Dans cette mthode, les particules sdimentent au sein dun gradient de densit. A
lquilibre, elles se stabilisent dans la zone du gradient o la densit est gale la siennes. La
diffrence entre la densit de la particule et celle du solvant constitue lun des facteurs qui
influence la vitesse de sdimentation. Cette dernire peut tre module en faisant varier cette
diffrence de densit par la cration dun gradient de densit.

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Si la densit de la particule est plus grande que celle du milieu, elle sdimentera. Plus la
diffrence de densit est grande plus la sdimentation est rapide.
Sil ny a aucune diffrence de densit, il ny aura aucune sdimentation, quelle que soit
lacclration.
Si la particule est moins dense que le milieu, celle-ci slvera dans le tube jusqu atteindre
un niveau de densit gal la sienne ou, le cas chant, jusqu flotter la surface.
Pour obtenir des solutions de densits diffrentes, deux gradients peuvent tre utiliss, un
gradient de saccharose form pralablement la centrifugation, et un gradient de chlorure de
csium (CsCl).
Il existe deux types de gradients:
A) Les gradients discontinus
Le gradient est prform par des dpts successifs de solution de CsCl de densit
croissante (Fig. 3). Les diffrents lments saccumulent aux interfaces entre les solutions de
densit diffrentes. Au dessus, leur densit tant plus leve, ils migrent vers le bas, et au
dessous, leur densit tant plus faible ils migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient
deux densits seulement avec une solution infrieure trs dense.

Figure 3. Centrifugation en gradient de densit discontinu.

B) Les gradients continus


Ce sont des gradients pour lesquels la variation de densit est continue. Une solution de
CsCl de densit donne soumise une force de gravit intense forme spontanment un gradient
de densit continu (Fig. 4). Les diffrents constituants vont alors migrer jusqu atteindre le
point prcis o leur densit est gale celle du solvant formant des bandes.

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Exemple de gradient continu

Figure 4. Centrifugation en gradient de densit continu.

Les gradients les plus utiliss sont:


Le saccharose (sucrose)
Il est trs souvent employ. Il permet datteindre des densits assez leves, de lordre de
1.3 g/ml avec du saccharose 2.5 M. Ce produit est peu coteux, lectriquement neutre et inerte
pour la plupart des fractions cellulaires.
Le chlorure de csium
Il est couramment utilis, particulirement dans la sparation des acides nucliques. Ce
sel peut atteindre une densit trs leve, de lordre de 1.9 g/ml 7.5 M. Cette possibilit
datteindre des densits si leves en solution aqueuse est son principal avantage. Son cot et le
fait quil sagisse dun sel, donc de molcules charges, rduisent son champ dapplication.
Dautres sels de csium peuvent aussi tre employs comme le sulfate de csium (CsSO4).

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CHAPITRE III: MOYENS DE PURIFICATION


3- La chromatographie

3. 1. Historique
La chromatographie (du grec chroma: couleur et graphein: crire) a t invente par le
botaniste Mikhail Tswett dans les annes 1900. La premire chromatographie a t ralise par
ce botaniste en 1905. Il a ralis la sparation de pigments vgtaux de la chlorophylle sur une
colonne remplie de carbonate de calcium avec de lther de ptrole. Des bandes colores qui se
dplacent le long de la colonne des vitesses propres sont obtenues.
Le prix Nobel de chimie est attribu en 1952 aux biochimistes Martin et Synge pour leur
contribution au dveloppement de la chromatographie moderne.

3. 2. Dfinition
La chromatographie est une mthode de sparation des constituants prsents dans des
mlanges varis. Elle sert en analyse pour purifier, identifier et quantifier des composs au sein
dchantillons divers. Le principe de base repose sur les quilibres de concentration qui
apparaissent lorsquun compos est mis en prsence de deux phases non miscibles, lune dite
stationnaire, est emprisonne dans une colonne ou fixe sur un support et lautre, dite mobile, se
dplace au contact de la premire. Si plusieurs composs sont prsents, ils se trouvent entrans
des vitesses diffrentes, provoquant leur sparation.

3. 3. Principe
La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur les diffrentes
affinits dun (des) compos(s) lgard de deux phases (stationnaire et mobile). Le principe de
cette technique est bas sur la migration diffrentielle des divers soluts contenus dans un
chantillon analys. Lchantillon est entrain par la phase mobile au travers de la phase
stationnaire qui a tendance retenir plus ou moins les composs de lchantillon laide
dinteractions comme les forces de Van der Waals ou les liaisons hydrogne. Une fois la phase
stationnaire traverse, les composs sont lus. Les diffrents composants de lchantillon ont
gnralement une affinit diffrente pour lune et lautre des deux phases. Il en rsulte une
diffrence de vitesse de progression des produits et donc dlution. Ceci permet de les sparer les
uns des autres voire de les identifier. Cette vitesse de sparation est fortement indpendante de la
nature des phases mobile et stationnaire.

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3. 4. Types de chromatographie
Les mthodes chromatographiques peuvent tre classes selon le support de la phase
stationnaire en:
- Chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice).
- Chromatographie sur surface (chromatographie sur couches minces ou CCM,
chromatographie sur papier).
Elles peuvent tre classes aussi selon la nature de la phase mobile en:
- Chromatographie en phase gazeuse (CPG).
- Chromatographie en phase liquide (CPL):
Chromatographie sur couche mince (CCM).
Chromatographie de partage centrifuge (CPC).
Chromatographie liquide haute pression (ou performance) (HPLC).
Suivant le type de chromatographie, elle peut servir identifier (CCM, HPLC, CPG),
sparer ou purifier les composs dune raction (chromatographie sur colonne, HPLC). Cette
technique peut galement, grce un tmoin, permettre de quantifier un produit (CPG, HPLC).
Le choix de lune ou lautre de ces techniques dpend de la nature des composs
sparer et en fonction de celle-ci, le choix de ladsorbant utilis (Tab. 1).

3. 4. 1. Chromatographie sur colonne


Cest une mthode de sparation des constituants dun mlange par migration dans un
dispositif constitu de deux phases:
- La phase stationnaire: support solide.
- La phase mobile: le solvant.
La vitesse de dplacement des composs dans la colonne dpend de:
Laffinit la phase stationnaire: plus que laffinit la phase stationnaire est grande, plus
que le dplacement des composs dans la colonne est trs lent.
La solubilit dans la phase mobile (plus que le compos est trs soluble dans la phase
mobile, plus que son dplacement dans la colonne est trs vite).
Le choix du type de chromatographie et du support dpend de la nature des composs
sparer (Tab. 1).

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Tableau 1: Choix du type de chromatographie et du support.


Type de chromatographie Nature de ladsorbant Nature des composs sparer
Adsorption Gel de silice Molcules organiques simples,
molcules contenant plusieurs
groupements polaires, substances
lectrophiles, substances haut poids
molculaire.
Oxyde daluminium Vitamines, alcalodes, colorants,
substances caractre nuclophile.
Partage Gel de silice Substances trs polaires.
Oxyde daluminium Substances trs polaires.
Kieselguhr Sucres et composs amphotres,
acides amins.
Partage en phase inverse Film E.C.S. 511 V Composs hydrophiles de sries
homologues.
Film E.C.S. 541 V
Polyamide Phnols et drivs nitrs aromatiques.
Cellulose Acides gras et leurs esters
mthyliques.
Electrophorse Gel de silice Amines, acides amins et peptides,
colorants
Oxyde daluminium Htrocycles azots polynuclaires
Kieselguhr Acides nucliques
Echange dion DEAE Composs dont la charge lectrique
Ecteola dpend du pH.
Sephadex (Nuclotides et acides carboxyliques)
Dowex
A) Elments chromatographiques
Les lments de la chromatographie sont: Lchantillon, la phase stationnaire, la phase
mobile, la colonne, la pompe, le dtecteur, le collecteur de fractions et lenregistreur.
Lchantillon: Cest la solution qui contient les composs analyser.
La phase stationnaire: Cest un gel constitu de granules qui se trouve dans une colonne
(Tab. 2). Les granules peuvent: tre poreuses, porter une charge ionique ou un site
daffinit.

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Tableau 2: Les diffrents types de granules en fonction des diffrents types de chromatographie.
Type de chromatographie Type de granules
Chromatographie dexclusion strique Poreuses (rticules)
Chromatographie changeuse dion Portent une charge ionique positive ou
ngative
Chromatographie daffinit Portent un site daffinit

La phase mobile: Cest un liquide qui se dplace travers la phase stationnaire, en


entranant avec lui les composs de lchantillon. Elle doit tre soluble et interagir avec les
composs de lchantillon et non pas avec la phase stationnaire.
La colonne: Cest le support de la phase stationnaire (gel ou rsine). A travers lequel, la
phase mobile passe. Elle peut tre en verre, en plastique ou en inox et de diffrentes
dimensions (Fig. 1).

Figure 1. La colonne chromatographique.


La pompe: Elle permet de rgler le dbit de la phase mobile travers la colonne (Fig. 2).

Figure 2. La pompe.
Le dtecteur: Il value la quantit de chacun des composs spars et envoie un signal
lectronique vers lenregistreur (Fig. 3). Par exemple, les protines sont dtectes grce un
dtecteur UV-visible.
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Figure 3. Le dtecteur.
Lenregistreur: Il dessine les pics en fonction de leur intensit (Fig. 4).

Figure 4. Lenregistreur.
Le collecteur de fractions: permet de collecter les fractions de lchantillon (Fig. 5).

Figure 5. Le collecteur de fraction.


B) Mode opratoire
Il consiste :
- Prparer le gel.
- Remplir la colonne.
- Equilibrer la colonne.
- Injecter lchantillon.
- Effectuer llution.
- Rcuprer les fractions.
- Analyser le chromatogramme.
- Rgnrer le gel.
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3. 4. 1. 1. Chromatographie dexclusion strique (filtration sur gel ou tamisage molculaire)


Cest une mthode chromatographique qui permet de sparer des molcules en fonction
de leur poids molculaire et de leur forme. La phase stationnaire est un solide poreux dont la
dimension des pores est voisine de celle de certaines molcules sparer. Les grosses molcules
dont le diamtre est suprieur celui des pores sont exclues et donc lus en premier. Les petites
molcules et les molcules de taille moyenne sont lues plus tardivement, elles pntrent dans
les pores du gel, leurs migration est donc retarde (Fig. 6).
La chromatographie dexclusion strique est gnralement utilise pour dterminer le
poids molculaire des composs dun chantillon par lutilisation de substances standards.

Figure 6. Tamisage molculaire.


Le gel de ce type de chromatographie est caractris par:
Le diamtre des pores (la porosit): Il est fix par le degr de rticulation du gel qui
correspond la proportion de substrat dans lensemble de la phase stationnaire. Il
dtermine le pouvoir de sparation (sparation microporeuse ou macroporeuse).
Linertie chimique: Le gel ne doit pas ragir avec la phase dispersante. Il se dgrade si le
pH est infrieur 2 et suprieur 8. Donc il doit tre inerte chimiquement vis--vis des
composs de lchantillon et de la phase mobile.
La stabilit physico-chimique: Le gel doit tre rsistant la temprature et la pression
de lexprience.
La taille et la forme des particules (la granulomtrie): Les particules du gel sont petites
de granulomtrie de 40 300 m en chromatographie classique et de 20 80 m en haute
performance.
La forme: La forme sphrique assure un coulement uniforme de la phase mobile.
La nature: Les gels peuvent tre en dextran, en polyachrylamide ou en agarose.

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La consistance: Elle varie selon la nature et le degr de rticulation des gels. On distingue:
- Les xrogels: Sont des gels semi-rigides qui ne gardent pas leur forme initiale lorsque la
phase dispersante est limine.
- Les aerogels: Sont des gels rigides intressants lorsquon travaille avec des dbits levs ou
sous forte pression.
Les diffrentes tapes de la chromatographie dexclusion strique regroupent:
Le choix du gel: Il dpend du poids molculaire des composs sparer (Tab. 3).
Le choix de la phase mobile: Le pH et la force ionique de la phase mobile dpendent de
la nature des composs de lchantillon. La phase mobile ne doit pas interagir avec la
phase stationnaire.
La prparation du gel: Il existe des gels prts lemploi et des gels qui ncessitent un
gonflement par leau.
Le remplissage de la colonne avec la phase stationnaire.
Lquilibration de la colonne: Cest le lavage de la colonne avec la phase mobile (3 fois).
Linjection de lchantillon.
Llution: Elle se fait avec la phase mobile qui se dplace le long de la phase stationnaire
avec un dbit bien dtermin selon le poids molculaire des composs de lchantillon.
La collection des fractions et lanalyse du chromatogramme.
Tableau 3: Les diffrents types de gel et leur capacit de rtention.
Type de gel Capacit de rtention (Da)
Dextran
Sephadex G-10 700
Sephadex G-25 1000-5000
Sephadex G-75 3000-70000
Sephadex G-200 5000-800000
Polyacrylamide
Bio-gel P2 200-2000
Bio-gel P6 1000-6000
Bio-gel P-150 15000-150000
Bio-gel P-300 60000-400000
Agarose
Sepharose 2B 2 000000-25000000
Sepharose 4B 300000-3000000
Bio-gel A-0,5M 30000-500000
Bio-gel A-15M 30000-15000000
Bio-gel A-150M 5000000-150000000

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La rgnration du gel: Pour liminer les contaminants, le gel est lav par une solution
saline. Le gel est conserv 2-4C aprs addition dun agent antimicrobien et de
conservation (azide de sodium).
Applications de la chromatographie dexclusion strique
Le domaine dapplication de ce type de chromatographie est celui de la sparation des
macromolcules de masses molaires leves.
Sparation de petites molcules et de macromolcules: Comme llimination des ions
dune solution de macromolcules (exemple le facteur VIII antihmophilique) et la
purification dune protine aprs marquage liode 131.
Analyse dun mlange de macromolcules: Cest la purification de fractions plasmatiques
(immunoglobulines M) pour la prparation de mdicaments ou de ractifs de diagnostic.
Fractionnement de petites molcules: Il regroupe lanalyse de peptides (en analyse
alimentaire dans les fromages), lanalyse denzymes et lanalyse de colorants dans les
produits alimentaires.
Sparation de cellules: La chromatographie sur gel de dextran permet disoler les
lymphocytes des monocytes.
Dtermination des poids molculaires: La meilleure mthode est ltalonnage direct des
colonnes de chromatographie dexclusion strique avec des talons de poids molculaires
connus tels que le cytochrome C (12600), la myoglobine (17500), lalbumine (68000),
lovalbumine (45000) et la -globuline (160000).

3. 4. 1. 2. Chromatographie changeuse dions


Elle permet la sparation de molcules charges (La sparation est en fonction de la
charge lectrique). La phase stationnaire est un solide ayant des proprits particulires que lon
appelle un changeur dions constitu par une rsine porteuse de groupements ioniss
ngativement ou positivement, exerant des interactions lectrostatiques (ioniques) avec des
composs (protines) ionises. Les changeurs dions sont des macromolcules insolubles
portant des groupements ionisables ayant la proprit dchanger de faon rversible certains de
leurs ions au contact dautres ions provenant dune solution (Fig. 7).
Cest une sparation des composs base sur des interactions ioniques rversibles entre
une phase stationnaire appele changeur dion, des contres ions changeables ou mobiles et un
solut ou protine charg.

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Groupement ngatif li par covalence au support

- +
Support ou matrice G X

Contre-ion changeable

Figure 7. Schma dune rsine changeuse de cations (rsine cationique).

A) Les changeurs dions


Ce sont des solides plus au moins poreux, glifiables le plus souvent, se prsentant sous
forme granule. Ils constituent un rseau de macromolcules insolubles. Il existe deux grands
groupes de rsines utilises dans ce type de chromatographie (Fig. 8):
1. Les rsines changeuses de cations dont la phase stationnaire possde des groupements
fonctionnels de nature anionique se classent en fonction de leur aptitude lionisation en:
Rsines cationiques fortes: Rsines sulfoniques (trs fortement ionises quelque soit le
pH).
Rsines cationiques intermdiaires: Rsines phosphoriques.
Rsines cationiques faibles: Rsines carboxyliques (non ionises en milieu acide fort).
Rsines cationiques trs faibles: Rsines phnoliques (ionises en milieu basique
uniquement).
2. Les rsines changeuses danions dont la phase stationnaire possde des groupements
fonctionnels de nature cationique se classent en fonction de leur aptitude lionisation en:
Rsines anioniques fortes (rsines amine quaternaire).
Rsines anioniques faibles (rsine amine secondaire).
A) Echangeurs anionique B) Echangeur cationique
Rsine charge positivement Rsine charge ngativement

+ - - +

+ - - +
- +
- +
+ - - +

Protine charge ngativement Protine charge positivement


+ - - +
Contre ion charg ngativement Contre ion charg positivement

Figure 8. Les diffrents types dchangeurs ioniques.

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Les changeurs cationiques sont:


Le CM-polyoside (carboxymthyle): cest un changeur faible.

Le SP-polyoside (sulfopropyle): Cest un changeur fort.

Les changeurs anioniques sont:


Le DEAE-polyoside (dithylaminothyle): Cest un changeur faible.

Le QAE-polyoside (quaternaire aminothyle): Cest un changeur fort.

B) Mode opratoire
Il consiste :
- Choisir le gel.
- Choisir la phase mobile.
- Remplir la colonne.
- Equilibrer la colonne (fixation des contres ions).
- Injecter lchantillon (ltape de fixation ou adsorption des protines).

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- Effectuer llution (tape de dsorption par la Fi ou pH).


- Rcuprer les fractions.
- Analyser le chromatogramme.
- Rgnrer le gel.
Donc, la colonne est remplie, sans irrgularit, puis quilibre (leffluent doit avoir la
mme composition que lluant). Lorsque le dpt de lchantillon est fait, on procde une
lution soit en modifiant le pH, soit en modifiant la force ionique de lluant. On peut oprer
avec un gradient continu ou un gradient discontinu.
Le pH influe sur la charge nette de la protine (caractre amphotre):
Si le pH du milieu est suprieur au point isolectrique de la protine, cette dernire devient
charge ngativement: Pour lluer, il faut diminuer le pH. Les protines seront charges
positivement et elles dcrocheront de la rsine.
Si le pH du milieu est infrieur au point isolectrique de la protine, cette dernire devient
charge positivement: Pour lluer, il faut augmenter le pH. Les protines seront charges
ngativement, elles dcrocheront de la rsine.
La force ionique exerce un effet de comptition entre la protine fixe et des autres ions
(dplacement des ions fixs les protines par un autre ion qui est fortement charg et de
concentration plus leve (exp. Cl-, HO-, Na+, H+...).
C) Applications
La chromatographie changeuse dions est utilise au laboratoire, depuis la prparation
de leau dminralise jusqu lanalyse de traces ioniques dans un chantillon. Elle sapplique
lanalyse et la sparation de sels minraux, dacides amins, de peptides, de protines, de
nuclotides, dacides nucliques, de lipides et de glucides ioniss.

3. 4. 1. 3. Chromatographie daffinit
Elle est base sur des interactions spcifiques et rversibles entre des composs
spcifiques (ligands), li par covalence un support inerte qui constitue la phase fixe et son
partenaire daffinit en solution (substance analyser ou affinant) (Tab. 4; Fig. 9). Le ligand est
fix sur une matrice (rsine) directement ou indirectement laide dun bras fixateur (espaceur).
Dans le complexe de nature biologique, dont la formation est la base de la chromatographie
daffinit, lun des partenaires au moins est une protine ; cette protine peut constituer le ligand
fixe ou le partenaire daffinit en solution.

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Tableau 4: Exemples de ligand et daffinant.


Ligand Affinant
Une enzyme Le substrat ou linhibiteur
Un antigne Lanticorps
Une hormone Le rcepteur

Matrice (rsine)

Ligand
Partenaire daffinit
Contaminants

Figure 9. Principe de la chromatographie daffinit.


La phase stationnaire (le gel): Est constitue dun effecteur (ligand), fix par covalence
un support poreux (matrice ou rsine) par lintermdiaire dune chane latrale: le bras
fixateur. Le support peut-tre en dexran, en agarose ou en polyachrylamide. Ce sont des
particules uniformes. Il doit tre insoluble dans leau, stable chimiquement et
mcaniquement et doit porter des groupements fonctionnels ractifs permettant la fixation
des bras fixateurs
Le bras fixateur: Cest une chane polycarbonne (C6-C8) intercale entre la matrice et le
ligand.
Le ligand: Toute substance capable de former des complexes stables avec les molcules
isoler et possdant, par surcrot un groupement ractif assez loign du site actif pour que
celui-ci reste librement accessible aprs la fixation. Cest la molcule fonctionnelle, fixe
directement ou indirectement sur la matrice.
Les effecteurs utiliss sont:
- Pour la purification des enzymes:
Des substrats et analogue de substrat.
Des inhibiteurs rversibles.
Des effecteurs allostriques.
Des coenzymes.
- En immunologie:

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Des haptnes.
Des antignes.
Des anticorps.
- Pour ltude des protines rceptrices:
Des hormones.
A) Mode opratoire
Il consiste :
- Choisir la phase mobile.
- Remplir la colonne.
- Equilibrer la colonne.
- Injecter lchantillon.
- Laver la colonne pour liminer les substances non adsorbes.
- Eluer les substances adsorbe ou fixe.
- Rcuprer les fractions.
- Analyser le chromatogramme.
- Rgnrer le gel.
La premire opration consiste prparer le gel daffinit, en fixant le ligand sur le
support. Une colonne est remplie de ce gel daffinit. On y fait passer la solution aqueuse
contenant la substance purifier. Celle-ci est retenue, alors que les contaminants en solution
passent librement. Des lavages successifs permettent dliminer toute trace de produits
indsirables. Enfin, on lue la substance retenue en dcomposant le complexe (Fig. 10).

Figure 10. Les diffrentes tapes de la chromatographie daffinit.

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B) Elution
Pour luer les substances adsorbes, il est ncessaire de modifier certains paramtres:
Le pH: Le substrat voit alors ses charges lectriques se modifier et son affinit pour le ligand
changer voire disparatre (lution non spcifique).
La force ionique en augmentant la concentration en sels (lution non spcifique).
La composition en ajoutant un compos (un tampon dlution qui contient un comptiteur ou
un ligand non fix) dont laffinit avec le ligand est plus forte (lution spcifique).
C) Applications
La chromatographie daffinit est adapte, soit lanalyse, soit la prparation de
substances biologiques. Elle a t utilise en:
- Enzymologie, pour lextraction denzymes et la purification dextrait enzymatiques.
- Immunologie, pour la purification danticorps.
- Protino-chimie, pour ltude des protines membranaires.
- Chimie des acides nucliques, pour le fractionnement de divers acides nucliques
(ARNm, ARNr, etc.)

3. 4. 1. 4. Autres types de chromatographie sur colonne

A. Chromatographie dinteraction hydrophobe


Le gel de chromatographie dinteractions hydrophobes porte un groupement
hydrophobe tel quun noyau phnol lextrmit dune chane carbone.
Dans la figure (11) suivante, les parties hachures reprsentent les rgions de caractre
hydrophobe en surface de la protine.
1re tape: La protine sparer est fixe sur le support chromatographique en prsence
dune forte concentration en sel: Dans un milieu haute force ionique, les molcules deau de
lenveloppe dhydratation des protines sont mobilises pour hydrater les anions et les cations
issus de la dissociation du sel, cest le phnomne de "salting-out". Il en rsulte une modification
de lorganisation des molcules deau autour des protines et ce changement denvironnement
est thermodynamiquement favorable ltablissement dinteractions hydrophobes entre les
rgions hydrophobes la surface des protines et le groupement hydrophobe port par la phase
stationnaire.
2me tape: Aprs rinage du gel afin dliminer les protines non adsorbes, llution des
protines fixes est obtenue: En faisant passer un tampon de force ionique dcroissante, les ions
du sel tant ainsi progressivement limins. Les acides amins chargs ou polaires la surface
des protines peuvent de nouveau tablir des liaisons hydrogne avec la phase mobile, cest--
dire que la solubilit des protines dans la phase mobile redevient maximale et elles sont lues.
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Figure 11. Chromatographie dinteraction hydrophobe. Inspir de: "Strategies for Protein
Purification and Characterization" Marshak et al. (1996)- Cold Spring Harbor Laboratory Press.

B. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)


Elle a t utilise depuis 1975 et elle a rduit en moyenne de dix fois le temps ncessaire
lanalyse de nombreux composs biochimiques. Elle se distingue des systmes classiques par
une augmentation de la vitesse dchange entre phase solide et liquide.
Cest une technique de sparation analytique en fonction de lhydrophobicit et
prparative des molcules dun compos ou dun mlange de composs. Pour certains, HP
signifie haute pression. Cette forme de chromatographie est frquemment utilise en
biochimie, ainsi quen chimie analytique. Le P du sigle, lorigine signifiait Pression mais
lorsque la mthode a t amliore (rduction des particules et rgulation de la phase
stationnaire) le P a donc t attribu Performance afin de marquer cette innovation. La fine
granulomtrie de la phase stationnaire permet une meilleure sparation des composants. Les pics
obtenus sont plus troits donc la rsolution est amliore (les pics sont bien spars). La
combinaison de la rapidit et de la rsolution leves conduit lappellation haute performance.
Le champ dapplication de ce type de chromatographie recouvre une grande partie du
domaine de la chromatographie en phase gazeuse auquel sajoute lanalyse:
Des composs thermosensibles.
Des composs trs polaires.
Ainsi que des composs de masses molaires leves.

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Un appareil dHPLC comprend diffrents modules: un rservoir solvant contenant la


phase mobile, un systme de pompage permettant deffectuer des lutions gradues, un injecteur,
une colonne, un dtecteur et un systme dacquisition de donnes (Fig. 12).

Figure 12. Appareillage de lHPLC.

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CHAPITRE III: MOYENS DE PURIFICATION


4- Llectrophorse
4. 1. Historique
Lorigine de cette technique a t imagine par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se
sont inspirs des tudes de Hermann Von Helmholtz menes sur llectro-osmose. Celui-ci
constate quil est possible, sous un champ lectrique, de dplacer des particules charges vers le
ple de signe oppos leur charge.
En 1937, Ame Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la premire lectrophorse:
llectrophorse libre. Cette technique lui a permis de sparer les protines du srum sanguin en
appliquant un champ lectrique. La solution est place dans un tube en U de section carre afin
de raliser des mesures optiques au travers du tube. Il a pu obtenir sur le ple positif des
protines de charge trs ngative comme lalbumine et sur le ple ngatif des protines de charge
plus positive comme les globulines.
En 1939, P. Knig et D Von Klobusitzky ont spar avec succs les composants du venin
de serpent en laborant la technique dlectrophorse sur papier.
En 1952, Pierre Grabar labore, en collaboration avec C.A. Williams, une mthode
danalyse immuno-lectrophortique, qui permet danalyser des mlanges trs complexes
dantignes. Ds la premire application de cette mthode lanalyse du srum sanguin humain,
il parvient dceler dans le srum plus de 30 constituants indpendants, alors que
llectrophorse en veine liquide ou sur papier ne permettait disoler que 5 ou 6 groupes de
protines.
En 1955, O. Smithies met au point llectrophorse en gel damidon.
En 1957, Joachim Kohn spare les phnotypes de lhmoglobine en laborant la
technique dlectrophorse sur membrane dactate de cellulose.
En 1969, Beber et Osbom introduisent lagent dnaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
pour sparer les diffrentes sous-units protiques.

4. 2. Dfinition
Cest une des nombreuses techniques de sparation et danalyse de particules charges
par migration diffrentielles sous laction dun champ lectrique.
Des particules charges sont donc places dans un champ lectrique cr par une tension
continue et se dplacent vers le ple de signe oppos leur charge une vitesse proportionnelle
cette charge. Si on dpose une espce anionique (charge ngativement), elle migrera vers
lanode (+) et une espce cationique (charge positivement) du ct de la cathode (-).

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4. 3. Principe
Llectrophorse est une technique permettant de dplacer des ions (molcules ayant
perdu leur neutralit lectrique) sous leffet dun champ lectrique. Ceux-ci migrent vers leur
lectrode respective: Les anions migrent vers lanode et les cations migrent vers la cathode. Pour
les molcules non charges, il nexiste pas de migration. Du fait de leurs caractristiques propres
et des conditions de llectrophorse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la
matrice par ces ions diffrent, ce qui permet leur sparation.

4. 4. Facteurs influenant la mobilit lectrophortique


Plusieurs facteurs peuvent influencer la mobilit lectrophortique.

4. 4. 1. Nature de la molcule
La taille et la charge de la molcule influencent le processus lectrophortique. En effet,
les petites molcules migrent facilement mais leur mobilit dpend des autres substances
dissoutes susceptibles de les solvater et de diminuer leur vitesse. De mme, la charge des
molcules influence directement leur mobilit. La charge est fonction du pH pour les molcules
ionisables, de la force ionique et de la formation ventuelle de complexes. Le signe de la charge
dtermine le sens de migration et sa vitesse.

4. 4. 2. Composition ionique du tampon dlectrophorse


La prsence dions tant ncessaire au passage du courant, un compromis est obtenu avec
une force ionique comprise entre 0.05 et 1 mol/l. Le pH influe sur lionisation des acides faibles
et bases faibles, pour lesquels il savre ncessaire de travailler dans un milieu tamponn.
A pH et force ionique identiques, deux tampons de nature diffrente ne produisent pas
toujours des mobilits lectrophortiques identiques. Certaines substances ajoutes au tampon de
migration modifient aussi les comportements lectrophortiques. Ainsi:
La prsence dEDTA ou dacide citrique favorise par complexation la sparation de certains
ions minraux.
Les ions borats forment avec les sucres des complexes chargs rendant ainsi possible leur
sparation.
Laddition dure modifie le comportement lectrophortique des macromolcules par rupture
de liaisons hydrogne.

4. 4. 3. Support
Certains supports possdent des proprits adsorbantes et peuvent fixer les molcules de
solvants ou de soluts. Il en rsulte un ralentissement de la migration entrainant un largissement

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des zones sur llectrophorgramme. Ces proprits adsorbantes sont lies la prsence de
certains groupements fonctionnels comme les hydroxyles.

4. 4. 4. Champ lectrique
Il reprsente la chute de potentiel par unit de longueur entre deux lectrodes spares par
une distance. Le champ lectrique est fourni par un gnrateur de courant continu. Le support
de ce champ est constitu par un tampon de pH dont les ions conduisent le courant dun ple
un autre. Ce support peut tre liquide: on parle alors dlectrophorse en veine liquide. Dans une
large majorit des cas, on utilise un support poreux stabilisant la phase liquide: on parle alors
dlectrophorse sur support ou dlectrophorse de zones. Le mlange sparer est dpos sur
un support poreux imprgn de tampon. Ce support peut tre du papier, un driv de cellulose,
de lamidon, de lagarose, du polyacrylamide, etc. Le support doit tre homogne et inerte.
Les particules sparer peuvent tre de nature et de taille trs diffrentes: des composs
organiques ou minraux, de la taille dune cellule ou de celle dun ion. Cette mthode est
souvent utilise pour sparer des acides nucliques, des petits peptides ou des protines.

4. 5. Types dlectrophorse
Llectrophorse peut tre en des conditions non dnaturantes ou en des conditions
dnaturantes (SDS-PAGE).
4. 5. 1. Electrophorse en des conditions non dnaturantes
Les molcules sont spares dans leur tat le plus proche possible de leur tat natif. La
vitesse de migration dpend de la charge native de la molcule et de sa structure
tridimensionnelle.
4. 5. 2. Electrophorse en des conditions dnaturantes
Les molcules sont soumises un traitement dnaturant avant la sparation
lectrophortique, dtruisant la structure tridimensionnelle native. La sparation est donc en
fonction de la masse molculaire. Les agents de dnaturation sont le SDS (Sodium Dodcyl
Sulfate) et le -mercaptothanol qui rduit les ponts disulfures des protines. Le SDS (Fig. 1) est
un dnaturant doux et un surfactant, il agit sur les protines de plusieurs faons:
- Si la protine est oligomrique, ses sous units sont spares les unes des autres.
- Il se fixe sur les protines, les tapissant de charge ngative (Fig. 2). Les protines transformes
en manopolyanions, possdent toutes la mme mobilit lectrophortique. La charge ngative
globale permet la migration vers lanode, mais les molcules sont spares uniquement en
fonction de leur masse molculaire.

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Figure 1. Structure chimique du SDS.

Figure 2. Action du SDS sur les protines.

Selon le support lectrophortique, il existe deux types dlectrophorse:


4. 5. 3. Electrophorse en veine liquide (lectrophorse libre)
Il sagit de la premire mthode lecrophortique dcrite. La solution chantillon est
place dans un tube en U et recouverte dune solution tampon de densit plus faible que celle de
lchantillon pour viter les courants de convection. Les lectrodes sont places dans le tube o
lon applique le champ lectrique. La migration dans ce cas seffectue au sein dun liquide
constitu par une solution tampon de pH et de concentration convenable dont les ions conduisent
le courant dun ple un autre. Ce type de dlectrophorse prsente de multiples inconvnients
(Appareillage couteux, mise en uvre longue et dlicate, sparation incomplte des particules).
4. 5. 4. Electrophorse de zone sur support
Les mobilits obtenues en ce type dlectrophorse sont plus faibles que celles de
llectrophorse en veine liquide. Ce type utilise un support poreux stabilisant la phase liquide.
Le mlange sparer est dpos sur un support convenable, homogne, poreux, inerte et
imprgn de tampon. Ce support peut tre du papier, un driv de cellulose, de lamidon, de

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lagarose, du polyacrylamide (PAGE), etc. Les diffrents types dlectrophorse de zone sont
souvent nomms en fonction du type de support (papier, ester de cellulose, gel, etc.).
Electrophorse sur papier, sur actate de cellulose, sur gel (amidon, agar, agarose,
polyacrylamide).
Les fractions spares par lectrophorse de zone migrent comme des zones
individuelles. La taille des pores pour le support en gel peut influencer la vitesse de migration
(ralentissement du dplacement des grosses molcules).
A) Appareillage dlectrophorse
Lappareillage usuel est constitu de (Fig. 3):
Un gnrateur du courant continu stabilis reli aux lectrodes de la cuve. Ce courant cre
un champ lectrique qui va permettre de faire migrer les molcules.
Une cuve dlectrophorse ferme (horizontale ou verticale) et ventuellement thermostate
comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du tampon de migration.
Des accessoires comme le support dlectrophorse, les plaques de verre pour couler le gel
et les peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composs analyser
seront dposs.

Cuve Support

Plaques de verre Peigne

Figure 3. Appareillage dlectrophorse.

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B) Mode opratoire
Il consiste :
- Prparer le gel de concentration et le gel de sparation.
- Couler le gel de sparation entre des plaques de verre fixes sur un support suivi par le gel de
concentration.
- Dposer un peigne entre ces plaques.
- Retirer le peigne aprs polymrisation du gel (formation des puits).
- Dposer lchantillon et les marqueurs de masse molculaire dans les puits.
- Placer les plaques de verre contenant le gel polymris dans une cuve dlectrophorse.
- Remplir la cuve avec le tampon de migration.
- Mettre en marche le gnrateur de courant.
- Enlever le gel partir des plaques la fin de la migration.
- Colorer puis dcolorer le gel.
- Analyser le gel.
Prparation du gel
Elle consiste prparer deux gels: un gel de sparation dont les pores sont srs et un gel
de concentration dont les pores sont lches.
Le gel de polyacrylamide est une macromolcule rticule utilise comme support
dlectrophorse. Cest un copolymre dacrylamide qui forme des chanes et de NN-
mthylne bis-acrylamide qui assure le potage entre les chanes de polyacrylamide (Fig. 4). La
polymrisation de lacrylamide ncessite la prsence la prsence de deux catalyseurs: Le
TEMED (N, N, N, N-ttramthylthylne diamine: TMEDA) et le persulfate dammonium
[(NH4)2S2O8] qui deviennent des anions hyperactifs en prsence de lumire. La porosit du gel
varie en fonction du taux de lacrylamide, de bis-acrylamide, du TEMED (Fig. 5) et du
persulfate dammonium. Plus que le pourcentage dacrylamide est lev, plus que la densit des
chanes est leve et les mailles du rseau sont serres. Par consquence, plus le pourcentage
dacrylamide est lev, moins les molcules volumineuses peuvent migrer (Tab. 1). Donc, plus
que la masse molculaire du compos est leve, plus que la migration est lente.
Tableau 1. Pourcentage dacrylamide en fonction de la taille des protines sparer.
Acrylamide (%) Gamme de sparation (KDa)
7,5 45-400
10 22-300
12 13-200
15 2,5-100

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Acrylamide: CH2=CH-CO-NH2
+
Mthylne bis-acrylamide: CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2
=

Figure 4. Formation du gel de polyacrylamide.

Figure 5. Structure chimique du TEMED.

Le gel de sparation permet la sparation de la solution analyser. La densit typique de


ce gel peut tre 6, 8, 10, 12, ou 15%. Plus le gel est dense meilleure sera la sparation des
composs. Le gel de concentration est coul en haut du gel de sparation et sa densit est de
lordre de 5%. Il permet une entre homogne de lchantillon dans le gel de sparation.
Prparation de lchantillon: Lchantillon est soumis laction de plusieurs composs:
Le mercaptothanol: Compos qui exerce une action dnaturante sur les protines
oligomriques en rompant les ponts disulfures ce qui dsorganise leur structure
tridimensionnelle. Les sous units des protines sont donc dissocies.
Le SDS: Compos capable de venir se fixer sur la priphrie des chanes de protines tout
en leur confrant une charge ngative.
Le sucrose ou le glycrol: Qui donnent une densit lchantillon permettant ainsi ce
dernier dtre dpos facilement au fond des puits.
Le bleu de bromophnol: Est galement utilis comme marqueur color afin de vrifier le
bon droulement dune lectrophorse sur gel de polyacrylamide ou en gel dagarose.
En consquence, les protines sont dnatures (elles ont perdu leur structure
tridimensionnelle) et nont plus de ponts disulfures (elles sont sous une forme
monomrique).

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Les marqueurs de masse molculaire: La dtermination de la masse molculaire des


protines inconnues ncessite lutilisation des protines standards de masse molculaire
connue.
Le tampon de migration: Il contient des lectrolytes qui sont responsables du transport du
courant lectrique. Si la concentration de ces lectrolytes est faible, la totalit du courant est
transporte par le solut et une faible proportion est transporte par les lectrolytes, ce qui
entraine la migration des protines et donc leur sparation. Le tampon dlectrophorse est
constitu de glycine qui joue le rle de conducteur de courant.
La coloration: Une fois la migration lectrophortique termine, le gel est dmoul, sch
puis plong dans un colorant. Les protines sont rvles par une coloration spcifique (par
exemple avec le bleu de Coomassie).
La dcoloration: Une succession de bains dans la solution de dcoloration permet
dliminer la coloration du fond de faon faire apparatre les bandes correspondant aux
diverses protines spares. Les protines sont fixes dans le gel par une solution qui
contient du mthanol et de lacide actique.

C) Applications
Llectrophorse est utilise pour vrifier la puret dune fraction chromatographique et
pour dterminer la masse molculaire dune protine inconnue laide des protines standards.

Dtermination de la masse molculaire


Le fait que le SDS rende ngatives les protines permet de les sparer en fonction de leur
taille (masse molculaire) et non pas en fonction de leurs charges. Il existe une relation de
linarit entre le logarithme de la masse molculaire et le dplacement lectrophortique (Rf) au
sein du gel. Cette technique est utilise pour dterminer la masse molculaire dune protine
inconnue.
Dans les mmes conditions, on soumet la protine analyser une lectrophorse, la
connaissance de son dplacement (Rf) et lextrapolation de ce Rf sur la droite: Log M = f (Rf),
permettent la dtermination de sa masse molculaire (Fig. 6).
A laide de marqueurs protiques (protines pures de masse molculaire connue) (Tab. 2)
on trace la droite dtalonnage Log M=f (Rf).
Le rapport frontal (Rf) reprsente le rapport de la distance parcourue par la protine sur la
distance parcourue par le front de migration (Fm).

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

Figure 6. Mobilit des protines en fonction du logarithme de leur masse molculaire.


(pnA: protine A de masse molculaire inconnue).

Tableau 2. La masse molculaire et les rapports frontaux de quelques protines standards.


Protines Phosphorylase Albumine Ovalbumine Anhydrase Inhibiteur Lactalbumine
b carbonique de la
tyrosine
MM (kDa) 97 66 45 30 20.1 14.4
Rf (cm) 0.11 0.23 0.41 0.56 0.80 0.95

4. 6. Autres types dlectrophorse


Il existe dautres types dlectrophorse: Electrophorse bidimensionnelle,
isolectrofocalisation, lectrophorse en champ puls et immunolectrophorse.

4. 6. 1. Electrophorse bidimensionnelle
Cest une mthode de sparation des protines selon leur point isolectrique (pHi) et leur
masse molculaire. La sparation se fait en deux dimensions: La premire dimension consiste
sparer les protines selon leur pHi par isolectrofocalisation (IEF) et la deuxime dimension
consiste sparer les protines selon leur masse molculaire par lectrophorse en prsence de
SDS.

4. 6. 2. Isolectrofocalisation
La focalisation lectrique ou isolectrofocalisation (IEF) est une mthode de sparation
des protines en fonction de leurs points isolectriques (valeur de pH laquelle la molcule ne
prsente aucune charge nette).
LIEF est pratique sur lame ou sur colonne, dans lesquelles un gradient de pH est
prtabli. Le gradient de pH est ralis en imprgnant le gel avec un mlange de substances
amphotres de points isolectriques diffrents. Lorsque la diffrence de potentiel est applique,

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

les diffrents ampholytes se rangent dans lordre de leur point isolectrique et ralisent un
gradient de pH entre les deux lectrodes. Les protines dposes migrent vers lanode ou la
cathode selon leur charge mais, au fur et mesure de leur dplacement, le pH extrieur varie,
ainsi que leur propre charge: elles ne migrent plus quand leur charge nette est nulle (elles
focalisent lendroit o le pH est gal leur propre point isolectrique (Fig. 7).
Les ampholytes sont des mlanges dun certains nombre de molcules de faible masse
molculaire, donc trs mobiles, et comportant chacune plusieurs groupements acide carboxylique
et amine.

Le pH augmente
Ple acide Ple basique
AA BB CC DD EE FF GG
Anode (+) Cathode (-)
AA BB CC DD EE FF GG

Figure 7. Gradient de pH en isolectrofocalisation.


A, B, C, D, E, F et G sont des ampholytes de pHi croissant de pHiA pHiG. Les ampholytes pH acide
migrent vers lanode, les ampholytes pHi basique migrent vers la cathode.

Lchantillon protique est dpos dans un large puits au centre du gel. Les protines
migrent dans une direction ou dans lautre jusqu ce quelles rencontrent leur point
isolectrique, point o elles cessent de migrer.
Dans lIEF, le gel de polyacrylamide doit tre de forte porosit pour que la taille des
protines ninfluence pas leur migration.
LIEF est utilise pour dterminer le point isolectrique dune protine inconnue par
lutilisation des marqueurs de point isolectrique (standards), en traant la droite dtalonnage:
pHi standards = f(Rf). Il ya une relation linaire entre le point isolectrique des protines et leur
rapport frontal (Fig. 8).

Figure 8. Mobilit des protines en fonction de leur point isolectrique.


(pnA: protine A de pHi inconnu).
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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

4. 6. 3. Electrophorse en champ puls


En 1984, Schwartz et Cantor, proposent une mthode dlectrophorse sur gel dagarose
dont le pouvoir de sparation peut aller au moins jusqu 9 000 kb. Cette technique est utilise
lorsque llectrophorse en gel dagarose ou de polyacrylamide ne permet pas de sparer des
molcules dADN dont la taille excde 50000 paires de bases (50 kb).
Les fragments dADN sparer sont soumis laction alternative de deux champs
lectrophortiques perpendiculaires agissant une certaine frquence et une certaine valeur des
champs, judicieusement choisies en fonction de la taille des fragments sparer. Lun des
champs tire le fragment dADN et lui permet de sortir du pige dans lequel il tait bloqu,
lautre assure lavancement du fragment au sein du gel.
Grce cette technique, il est pratiquement possible, pour tous les organismes petit
gnome, procaryotes et eucaryotes infrieurs, de localiser trs rapidement un gne quelconque.
Par exemple, 16 des 17 chromosomes de la levure Saccharomyces cerevisiae peuvent tre
spars par ce type dlectrophorse. Donc, le marqueur de tailles utilis le plus frquemment,
servant de rfrence pour la taille des fragments, est lADN de Saccharomyces cerevisae.
4. 6. 4. Immunolectrophorse
Cette technique permet de sparer les composs par lectrophorse et de les dtecter par
raction immunologique par formation darc de prcipitation entre antigne et anticorps. Les
prcipits peuvent tre facilement visualiss sur un gel. Donc, cest une mthode qui associe
llectrophorse de protines (Ag) une immuno-diffusion contre des Ac spcifiques.
Les antignes sont spars en lectrophorse de zones sur une lame de gel dagar
tamponn pH variable de 8.2 8.6 est perce de deux puits au centre. Les fractions protiques
particulirement mobiles du srum (srum-albumine, 1 lipoprotine, 1 antitrypsine,
haptoglobine, transfrrine, lipoprotine, etc.) migrent vers lanode pH 8.2-8.6, comme sur
lactate de cellulose (sens 1) (Fig. 9). Par contre, les fractions les moins mobiles comme les IgG
sont entraines vers la cathode par le courant dlectro-endosmose. Elles migrent donc en
apparence vers la cathode bien que charges ngativement (sens 2) (Fig. 9).
Cathode Sens 2 Sens1 Anode

Gouttire pour antisrum

Emplacement du dpt
Figure 9. Lame dimmunolectrophorse.

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

Lantisrum spcifique est dpos dans une rigole dcoupe paralllement la direction
de la migration lectrophortique (Fig. 10). La plaque est place en chambre humide pendant 24
48 heures. Aprs cette priode, les arcs de prcipitation apparaissent.

Figure 10. Immunolectrophorse dun srum.

Cette technique est une mthode analytique qui permet de dnombrer une trentaine de
protines dans le srum humain.
Lexploitation de la plaque est faite visuellement:
Par observation directe sur fond noir, ou la loupe clairante.
Par photographie et agrandissement.
Par coloration aprs lavage et schage.
Linterprtation des rsultats ncessite la comparaison de lchantillon analyser et un
srum normal. La comparaison porte sur:
La position lectrophortique des arcs.
Leur forme et leur paisseur.
Leur nettet.
Remarque:
Un arc pais, plus long et plus prs de la rigole indique un accroissement de la teneur en
cette protine.
Un arc plus fin, plus court et plus loign de la rigole indique linverse.
Un arc flou qui indique un mauvais rapport stoechiomtrique Ag-Ac, prs de la rigole,
signifie une augmentation de lantigne; loign de la rigole, une diminution.

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CHAPITRE IV: TECHNIQUES DE CONSERVATION

I) Dfinition de la conservation
La conservation est le maintien et la prservation dun lment dans un tat constant. Ce
mot est rencontr dans plusieurs domaines:
En cinmatographie, la conservation et la restauration des films.
En finance, la conservation de titres.
En politique, lidologie de conservation est appele conservatisme.
En cologie, la conservation de la nature et la conservation de la biodiversit.
En agroalimentaire, la conservation des aliments.
Scher, saler, acidifier, confire dans la graisse ou le sucre ont t longtemps les seuls
moyens connus et pratiqus pour conserver les aliments avant la dcouverte, par Nicolas Appert,
de la strilisation par la chaleur. Aprs la dcouverte de lintrt des traitements par la chaleur,
une nouvelle tape t franchie avec la conservation par le froid. Les esquimaux savaient
conserver leurs aliments dans la glace. Cest en 1876 que Charles Tellier inventa la premire
armoire conservatrice, anctre de notre rfrigrateur. En 1929, Clarence Bird-Seye inventait le
procd de surglation.
Dautres procds ont t utiliss avec succs: dshydratation, lyophilisation, etc. Quel
quen soit le principe ou le protocole, un procd de conservation a pour but soit de bloquer ou
de ralentir lvolution des flores microbiennes de laliment, soit de les dtruire.

II) Les techniques de conservation


Il existe plusieurs moyens de conservation.

2. 1. La conservation par schage


Le schage est lune des plus anciennes mthodes de conservation des aliments. Il fait
intervenir la chaleur. Le schage solaire (fruits, viande, poissons) fait participer le rayonnement
UV. Cette technique est trs rpandue dans les pays chauds et secs mais aussi frquemment dans
les pays industrialiss laide de techniques artificielles comme les fours et les schoirs. Elle est
simple, peu agressive, conomique et surtout naturelle. La plupart des procds de schage
ncessitent le contrle de la temprature, de lhumidit, de la turbulence de lair, du temps, etc.
Les produits scher doivent tre choisis et prpars avec soin pour limiter la charge
microbienne (lavage, blanchiment, etc.), car le schage ne fait souvent que stabiliser la flore.
Parmi les techniques de conservation par schage: la dshydratation, la lyophilisation et le
salage-fumage.

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

2. 1. 1. La dshydratation
Cette technique de stabilisation est trs ancienne: Elle est base sur la baisse de lactivit
deau du produit. Ds la plus haute antiquit, des grains, des fruits, des viandes, des poissons ont
t schs au soleil. Plus tard, le schage a t effectu dans des fours. Aujourdhui, les denres
sont dshydrates par diffrentes techniques: schoirs air chaud, cylindres chauffants, etc. Le
but de la dshydratation est dliminer la plus grande partie de leau lie prsente dans le produit
pour empcher le dveloppement de micro-organismes et bloquer lactivit enzymatique.
Il existe des tunnels de dshydratation comparables aux tunnels employs pour la
conglation. Les aliments sont soumis un courant dair chaud et sec. Lair est la fois la source
de chaleur (par convexion) et le vhicule permettant llimination de la vapeur deau.
Les produits obtenus par dshydratation (lait en poudre, crales, fruits secs) peuvent tre
conservs temprature ambiante dans des emballages les protgeant de lhumidit. Les
techniques actuelles de dshydratation permettent de conserver les qualits nutritionnelles des
denres alimentaires.

2. 1. 2. La lyophilisation
La lyophilisation (sublimation de leau froid ou cryodessiccation) est un procd trs
utilis qui conserve les proprits de laliment. Elle a t invente en 1906 par les franais
Arsne dArsonval et F. Bordas. Le produit est dabord congel puis plac pression rduite et
chauff. Le solvant passe directement de ltat solide ltat de vapeur (sublimation). Le solvant
sublim est gnralement de leau, mais ce peut tre galement un alcool. La dure moyenne
dun cycle de lyophilisation est comprise entre 60 et 72 heures. Ce procd de conservation a
diffrentes applications savoir les produits biologiques (protines, enzymes, micro
organismes...), les actifs pharmaceutiques et cosmtiques et les produits alimentaires.
La lyophilisation consiste enlever leau dun produit liquide, pteux ou solide, laide
de la surglation puis une vaporation sous vide de la glace sans la faire fondre. Le
rchauffement de leau ltat solide trs basse pression conduit sa sublimation (passage
directement de ltat solide ltat gazeux). La vapeur deau (ou de tout autre solvant) quitte le
produit et sera captur par conglation laide dun condenseur. Ce procd prserve
particulirement bien les proprits et la structure du produit sensible la chaleur. Il permet la
rhydratation rapide grce la structure poreuse des poudres et la petite humidit rsiduelle.
Trois phases majeures sont distingues dans un cycle de lyophilisation:
A) La conglation
Cest la phase la plus critique du cycle de lyophilisation car elle doit garantir que le
produit lyophiliser ne sera pas altr. Elle consiste diminuer de manire lente la temprature

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

du produit une valeur comprise entre -20C et -80C, de faon bloquer leau sous forme
solide (sans cristaux) dans la situation o elle se trouvait ltat liquide; pour viter la lsion des
cellules, des vaccins, des enzymes, ou tout autre principe actif. Par contre, la trop rapide
conglation dun produit trs liquide, produit de petits cristaux de glace qui poussent le produit
actif vers le haut, ce qui peut galement le dnaturer.
B) La dessiccation primaire (la sublimation)
Cest une tape de sublimation effectue sous vide. Durant laquelle, leau contenue dans
le produit passe de ltat solide ltat gazeux. Elle est effectue une temprature suprieure
-20C et consiste extraire leau libre, qui est sous forme de glace libre (ou interstitielle). La
chaleur est apporte au produit sous un vide qui varie de 5 bar 500 bar selon le produit
lyophiliser. Ceci permet la sublimation de la glace. Au passage ces niveaux de vide, la chaleur
est principalement apporte par radiation ou conduction avec les tagres contenant le fluide
caloporteur (fluide charg de transporter la chaleur entre deux ou plusieurs sources de
temprature), la convection pouvant tre considre comme nulle.
La temprature pendant le cycle peut varier selon le produit et les besoins de production.
La vapeur deau est capte par un pige froid ou condenseur et la dshydratation du produit se
poursuivra en continu. Le flux de sublimation lintrieur de lyophilisateur est dtermin par le
niveau de vide, la temprature du produit et le temps de dessiccation. Un flux de vapeur trop
lev peut emporter avec lui le produit lyophiliser. Un cycle trop court laissera trop deau dans
le produit, qui pourra tre dgrad lors de la dessiccation secondaire. Par contre, un cycle trop
long peut dgrader certaines molcules actives. Lorsque la plus grande partie de leau sest
sublime, le produit initial a perdu environ 80 90% de son eau.
C) La dessiccation secondaire (le schage final)
Cest une tape qui seffectue toujours sous vide une temprature nexcdant pas 50C.
Le vide est pouss jusquaux environs 5 bar. Elle consiste enlever leau captive du produit
par dsorption, car des molcules deau restent piges en surface. Cest une tape dlicate, car
pousse trop loin, elle peut dnaturer le produit. Pour arracher les molcules, la temprature du
produit est maintenue ou augmente jusqu des valeurs positives. Lopration peut tre
complter en baignant le produit dans une atmosphre dazote, dont les molcules prendront la
place des quelques molcules deau restantes. A la fin du cycle, le produit est sec 95% ou plus.
La lyophilisation peut seffectuer naturellement (schage aux montagnes) ou, plus
rapidement, dans un appareil appel lyophilisateur (Fig. 1). Le lyophilisateur est un appareil qui
permet de lyophiliser, par dessiccation sous vide basse temprature, des produits et des

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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

microorganismes. Il est compos au minimum dune enceinte frigorifique pouvant tre tire au
vide et dune surface plus froide faisant office de pige frigorifique.

Figure 1. Photo dun lyophilisateur.

2. 1. 3. Le fumage et le salage
Le fumage (fumaison) est lun des plus anciennes mthodes de conservation utilis
depuis le Palolithique. Il se fait en complment du salage. Le fumage des viandes ou des
poissons combine laction de la chaleur (dshydratation) celle des produits de pyrolyse
(antiseptiques) tels que le formol, les acides organiques, les acides pyroliques, les alcools, les
ctones, les phnols, les crsols, etc.); de plus, il ya une action sur la saveur, la couleur et la
texture.
Le fumage consiste soumettre un aliment laction de la fume (composs gazeux) qui
se dgage lors de la combustion de vgtaux. Durant ce processus, il se produit une limination
partielle de leau dans laliment et une imprgnation des composants de fume en lui mme. La
fume est le rsultat de la pyrolyse du bois. Elle contient en moyenne 50% de particules solides
(suie, goudron, rsine), 25% de composs volatiles (phnol, acides organiques) et 25% deau.
Le salage (salaison) est une mthode de conservation base sur lutilisation du sel sec.
Pour une bonne dshydratation et empcher le dveloppement des microbes et des bactries, il
faut compter environ 15% de sel selon le poids du produit conserver. Le chlorure de sodium est
le plus utilis comme sel pour absorber leau prsente dans des aliments comme les fromages et
les poissons.

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2. 2. La conservation par chaleur


Lutilisation de la chaleur est un procd de destruction de microorganismes trs efficace
et trs rpondu. La cuisson, lbullition et le blanchiment sont des procds trs anciens,
auxquels ils se rajoutent les processus industriels de pasteurisation et strilisation (appertisation).
La chaleur agit au niveau de lagitation molculaire. Elle provoque une augmentation de la
vitesse des ractions mtaboliques et de la vitesse de croissance, puis rapidement la dnaturation
des composs microbiens et en particulier des protines enzymatiques. Alors, il est observ une
diminution puis un arrt de la croissance, puis quand le niveau de modification devient important
et irrversible, la mort.

2. 2. 1. La pasteurisation
La pasteurisation (dbactrisation thermo-contrle) tire son nom des travaux de Louis
Pasteur sur la stabilisation des vins au XIXe sicle. Cest lui qui la dcouvre en 1865. Elle
dsigne un traitement thermique qui dtruit, de manire plus au moins totale, des lments
microbiens sous leur forme vgtative. En ralit, la pasteurisation se fait parfois dans des
conditions liminant de manire certaine les microorganismes pathognes (Staphylococcus,
Salmonella, etc.) mais pas forcment toutes les formes vgtatives: certaines, thermorsistantes,
peuvent survivre au cot de formes sporules. La thermo-rsistance de certains lments dpend
du milieu dans lequel la pasteurisation est pratique. Plus le milieu est acide, moins la rsistance
la chaleur est leve. Par exemple, dans un jus de fruit ayant un pH infrieur 4.5, tous les
microorganismes seront dtruits tandis que pour un produit ayant un pH suprieur 4.5 (produits
carns), les micro-organismes rsistants plus de 100C ne seront pas dtruits. Dans ce cas, on
parle des semi-conserves.
La pasteurisation a t au dpart gnralement pratique des tempratures infrieures
100C, mais elle a volue vers une baisse du temps et une lvation de temprature (Tab. 1).
Elle sert dtruire les bactries des aliments sans pour autant changer leur composition, leur
saveur ou leur valeur nutritive. Elle sapplique dans divers cas: lait, vinaigre, jus de fruit, etc. Un
lment pasteuris doit tre conditionn dans un emballage tanche et conserv au froid (+4C)
afin de prvenir la multiplication des bactries qui nauraient pas t dtruites. Pour
la conservation des vitamines, ce processus est le moins agressif des techniques thermiques.
Plusieurs procds de pasteurisation existent, parmi lesquels:
A) La pasteurisation basse
Le produit est maintenu au moins trente minutes 60-65C dans une enceinte double
paroi dans laquelle se trouve de leau chaude. Ce procd a t abandonn pour le lait (il tait

Dr. H. BENABDALLAH
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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

essentiellement destin inactiver Mycobacterium bovis). Il est encore trs utilis pour les corps
gras et les jus de fruits.
B) La pasteurisation rapide haute temprature
Elle consiste chauffer laliment un temps trs court, de quinze secondes deux minutes,
une temprature leve (70 90C). Le produit est plac entre des plaques dacier inoxydable
chauffes par un circuit deau chaude. Lindustrie laitire recourt ce procd pour prparer le
lait pasteuris. Elle est utilise aussi pour pasteuriser des pures de lgumes, des potages. Cest
une alternative la pasteurisation basse pour tous les produits concerns par ce type de
traitement.
Tableau 1: Barmes de pasteurisation.
Denre Temprature et temps ncessaire
Lait 30 minutes 60C ou 15 secondes 72C
Crmes/Crmes dessert 30 minutes 71C ou 16 20 secondes 82C
Jus de pommes en bouteilles 30 minutes 77C
Boissons gazeuses base de jus de fruit 30 minutes 66C

2. 2. 2. Lappertisation
En 1785, un confiseur, Nicolas Appert, eut lintuition dun procd de conservation qui
devait rvolutionner les habitudes alimentaires, liminer le scorbut et faire natre toute une
industrie: il enferma des lgumes dans des bouteilles tanches quil plongea un temps prolong
dans de leau bouillante. Laspect des lgumes restait identique pendant plusieurs mois, leur gout
tait prserv. Cette technique de conservation est appele appertisation autrement dit
strilisation par la chaleur couple un conditionnement tanche. Elle correspond un
traitement permettant dliminer tous les microorganismes (y compris sous forme sporule). Les
paramtres du traitement sont suprieurs ceux de la pasteurisation et ils varient selon le produit
entre dix minutes 115C et trente minutes 121C (Tab. 2).
Les traitements thermiques haute temprature prsentent linconvnient dinactiver une
proportion non ngligeable de diverses vitamines. Or, la relation temprature/dure est diffrente
pour les microorganismes et pour les vitamines. Un chauffage long temprature modre
dtruit les vitamines et nest pas suffisant pour inactiver les microorganismes. Au contraire, un
traitement pendant un temps trs court haute temprature est suffisant pour inactiver les
bactries tout en prservant les vitamines. Ce procd est utilis pour la conservation des
liquides. Le lait, par exemple, est chauff en couche mince une deux secondes 140C-150C:
cest le traitement ultra haute temprature (UHT). Ces laits sont conditionns aseptiquement en
rcipients tanches et striles; ils peuvent tre conservs plusieurs mois temprature ambiante.
Dr. H. BENABDALLAH
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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

Tableau 2: Barmes dappertisation.


Denre Dure (minutes) Temprature (C)
Haricots verts au naturel 24 121
Petits pois ltuve 10 15 121
Sardines lhuile 24 121
Corned-beef 64 121
Champignons 6 10 121

Lappertisation est donc un procd de conservation qui associe deux techniques:


Le conditionnement dans un rcipient tanche aux liquides, aux gaz et aux micro-
organismes toute temprature infrieure 55C.
Un traitement par la chaleur qui a pour but de dtruire ou dinhiber totalement, dune part les
enzymes de laliment, dautre part les micro-organismes et leurs toxines, dont la prsence ou
la prolifration pourrait altrer la denre considre ou la rendre impropre la
consommation humaine.

2. 3. La conservation par froid


Le froid est un bon agent de stabilisation des produits alimentaires. Il entrane le
ralentissement de la croissance et des transformations microbiennes. Il prolonge ainsi la dure de
vie des denres alimentaires en limitant leur altration. Nanmoins, les micro-organismes
ventuellement prsents ne sont pas dtruits et peuvent reprendre leur activit ds le retour une
temprature favorable.
Laction du froid en particulier de la rfrigration est limite; en effet, le froid ne fait que
ralentir les processus: la conservation a donc une dure limite (date limite de consommation).
Plusieurs procds de stabilisation des aliments font appel au froid:

2. 3. 1. La cryoconservation
Cest la conservation, notamment de tissus organiques, trs basses tempratures
(utilisation dazote liquide). Cest une technique de fixation ou de stabilisation des matriaux
biologiques (cellules, tissus, organes, ou des embryons) par la conglation. Dans les prparations
histologiques, la cryoconservation (cryofixation) est employe pour maintenir la forme existante,
la structure et la composition chimique de tous les lments constitutifs des spcimens. Ces
derniers sont de petits chantillons de plantes ou de tissus dorigine animale, des suspensions
cellulaires de micro-organismes ou de cellules en culture, des suspensions de virus et des
chantillons de macromolcules purifies (comme les protines).

Dr. H. BENABDALLAH
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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

La cryoconservation consiste refroidir les petits chantillons une temprature de -


80C ou au-dessous pour empcher tout mouvement et activit mtabolique et prserver la
structure interne. Le principe de cette technique est de maintenir lchantillon dans lazote
liquide (-196C), plus simple et un peu moins cher, ou dans la phase vapeur le surmontant (entre
-196C et -130C); plus sr mais requrant une technicit un peu suprieure et un quipement
plus important. Lchantillon est pralablement conditionn en tubes tanches rsistants au froid
extrme.

2. 3. 2. La rfrigration
Elle consiste baisser la temprature dun aliment des valeurs lgrement suprieures
son point de conglation. Lintrt de la rfrigration consiste inhiber le dveloppement des
germes msophiles, dont la plupart des microorganismes pathognes. La rfrigration qui utilise
une temprature comprise entre 0C et 4C empche la multiplication de nombreux germes mais
pas celle des germes psychrophiles. A partir de 10C, lvolution de la flore msophile nest que
ralentie.
La conservation prolonge dune denre alimentaire et sa scurit vis--vis des
microorganismes pathognes impliquent donc:
- Une rfrigration la temprature la plus basse possible.
- Une rfrigration continue (la chane du froid ne doit pas tre interrompue).
La rfrigration est souvent associe dautres procds de stabilisation des aliments:
pasteurisation, addition dun conservateur, etc.
La rfrigration ne sutilise que pour quelques jours et est effectue dans un rfrigrateur
ou dans une chambre froide. Elle rduit les phnomnes doxydation et prserve les saveurs. Elle
est aussi utilise grande chelle pour conserver des fruits (pommes, poires) plusieurs mois dans
les stations fruitires. La dure de stockage varie selon les aliments (produits frais et/ou semi-
conserves).

2. 3. 3. La conglation
La conglation est une technique consistant abaisser la temprature dune denre
alimentaire de faon faire passer ltat solide gnralement leau, quil contient. Cette
cristallisation de leau contenue dans la denre permet de rduire leau disponible pour des
ractions biologiques et donc de ralentir ou arrter lactivit microbienne et enzymatique. La
conglation 18C permet une stabilisation totale vis--vis des microorganismes et entrane
une mortalit plus au moins importante selon la nature des germes et la vitesse de
refroidissement. La conservation au froid, une temprature infrieure -18C ou gale -24C
2C est utilise pour:
Dr. H. BENABDALLAH
-72-
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .

- Certains milieux de culture et des ractifs.


- Des souches bactriennes.
- Des chantillons pour analyse.
La conglation lente dun tissu commence par la cristallisation de leau des espaces
extracellulaires. Ce phnomne accroit leur concentration en solut et cre, par osmose, un appel
deau en provenance des cellules. Celles-ci se dshydratent, deviennent plasmolyses. La
cristallisation reste essentiellement extracellulaire. Alors, que lvolution dun tissu soumis une
conglation rapide est sensiblement diffrente. Les germes de cristallisation se forment
simultanment dans les compartiments extra et intracellulaires.

2. 3. 4. La surglation
Un produit surgel est un aliment trs frais ayant subi une conglation ultrarapide. Il
sagit donc dun cas particulier de conglation. La surglation (-40C et mme - 80C), comme
la conglation, permet une stabilisation totale vis--vis des microorganismes et entrane une
mortalit plus au moins importante selon la nature des germes, celle de laliment, la vitesse de
refroidissement et la temprature de stockage.
Les produits surgels conservent toute leur texture, leur saveur et peuvent tre conservs
plus longtemps. Ils peuvent se conserver -18C pendant plusieurs mois (voire une anne) sans
modification notable des nutriments. Toutefois, pour certaines denres dorigine animale, la
prsence dune activit rsiduelle des enzymes peut causer le rancissement (altration des corps
gras entrainant une modification dsagrable de leur odeur et de leur saveur) des matires
grasses au stockage.
2. 4. La conservation par agents chimiques
Les additifs de conservation ou conservateurs chimiques sont utiliss dans le but de
prolonger la dure de conservation des aliments. Les produits microbiostatiques ou microbicides
susceptibles dtre ajouts aux aliments sont qualifis de conservateurs alimentaires. Un bon
conservateur doit tre bactricide plutt que bactriostatique; il doit agir sur les levures et les
champignons, il doit tre actif sur les germes pathognes et sur ceux responsables daltrations, il
doit tre stable et inoffensif (absence de toxicit) et sans action sur la valeur nutritionnelle.
Les effets des conservateurs alimentaires peuvent tre spcifiques (acides caprylique,
dshydroactique, sorbique et propionique, acide benzoque et benzoates, nitrites, anhydride
sulfureux, thanol, antibiotique, etc.) ou rsulter de modifications de certaines proprits de
laliment comme le pH (acide actique, citrique, formique, tartrique, lactique, etc.) ou lactivit
de leau (chlorure de sodium, saccharose, etc.). Ladjonction de sel ou de sucre modifie le got

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de laliment et permet dabaisser lactivit de leau des valeurs pour lesquelles seule une flore
non dangereuse pour le consommateur est susceptible de survivre ou de se multiplier.

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