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Introduccin a las tinciones

n Tincin de Gram
n Tincin de Cpsula
n Tincin de Esporas
n Tincin de Ziehl-Neelsen
n Tincin Negativa (Dugid)
Objetivos
n Conocer las ventajas de la tincin de microorganismos
n Conocer el mecanismo bsico de una tincin
n Aprender las destrezas del proceso de preparacin de
un frotis y el ensayo de diferentes tinciones
diferenciales y selectivas: Gram, cido-resistente,
esporas y cpsula
n Establecer las diferencias entre bacterias basadas en las
tinciones
CROMFORO
Da la caracterstica de color a una substancia pero no tie, ya que carece de
afinidad o capacidad para unirse a fibras o tejidos.

-NO2 -N=N- -N=O -N=


Nitro Azo Nitroso Indmico

C=S- N -N=N+- -S= N+

N O- -N-

Tiocarbonil Acina Azoxi Tiacina


Un grupo cromforo + un anillo bencnico = cromgeno (no tie)
AUXCROMO

Grupo que le confiere a una substancia la


propiedad de disociacin electroltica, es decir,
formar sales y por lo tanto da la capacidad a un
cormgeno de fijarse y teir.

OH-
H+
COLORANTE
NO2

Ciamgeno
+ NO2 (amarillo)
No tie
Cromforo
NO2 NO2
Anillo bencnico
-OH
Auxcromo
NO2 NO2
Disociacin
El color proviene
de los grupos NO2
y sus propiedades
Tintoriales del -OH
NO2
NO2 NO2 NO2
O- OH
+ H+ Ac. pcrico
Tipos de colorantes
n Bsicos- Tienen carga catinica. La porcin del
cromgeno tiene carga positiva y poseen gran afinidad
por los componentes celulares negativos.
n Estos colorantes son los ms utilizados debido a que las
bacterias tienen una superficie con carga negativa.
n Ejemplo: Azul de metileno, cristal violeta y
carbolfucsina
Tipos de colorantes (cont.)
n cidos- Tienen carga aninica. La porcin del
cromgeno es negativa y tienen gran afinidad
por los componentes celulares positivos.
n Las sales de sodio, potasio, calcio o amoniaco
de cidos con color son ionizados para producir
un cromgeno con carga negativa.
MORDENTE

Cualquier substancia que forme compuestos


insolubles con los colorantes y determine su
fijacin a una estructura determinada.
Ejemplo: Lugol (I), fenol, oxalato de amonio, cido tnico,
sulfato de anilina, etc.
FIJADOR

Substancia que va a permitir conservar en su


lugar a las estructuras correspondientes por
medio de la coagulacin de sus molculas.
Ejemplo: metanol, formol, tetrxido de osmio, calor (no >
60C)
Preparacin del frotis:
n Limpiar la laminilla con papel de lentes. Libre de grasa
n Prepara el frotis
n Medio lquido- solo se coloca de 2 a 3 asadas del
cultivo en la laminilla. (Agitar)
n Medio slido- se coloca una gotita de agua en la
laminilla y se diluye la porcin de cultivo en ella.
Se esparce bien.
n Secar a temperatura ambiente
n Fijacin por calor
TINCIONES
Simple
Usa un solo colorante
Diferenciales: Gram y Ziehl-Neelsen
Usa dos colorantes
Primario
Secundario o de contraste
Mordente
Diferenciacin (decoloracin)
Selectivas
Usa uno o ms colorantes
Mordente
TEORAS

Fsica: Es un fenmeno o proceso fsico, es una reaccin


entre dos substancias sin formacin de un nuevo
compuesto. Todas las reacciones se explican por
fenmenos de capilaridad, smosis, adsorcin y
absorcin.

Qumica: Es una reaccin donde se forma un compuesto


nuevo con propiedades fsicas y qumicas diferentes a las
que muestras las substancias originales reaccionantes.
TINCIONES

Na+ Na+ Na+


Na+
Na+
+ AM+ Cl -
Na+
Na+

Na+ Na+
Na+ Na+ Na+

+ NaCl
Tincin simple

n Utilizada para observar la forma, la


agrupacin, el tamao y la presencia de
esporas.
n Se utiliza un solo colorante.
n tincin directa se tie a la bacteria.
n Tincin negativa tie el fondo pero no a la
bacteria
TINCIN SIMPLE
Permite observar la forma, tamao, agrupacin de
las bacterias usando un solo colorante
(generalmente bsico)
Tincin diferencial

n Tincin diferencial: es una gran herramienta para


separar y clasificar a los microorganismos.
n Utiliza dos colorantes y un mordente.
n El primer colorante aplicado es el primario. Despus de
l suele hacerse la diferenciacin (decoloracin). El
colorante secundario o de contraste, se adiciona para
establecer la diferenciacin de las bacterias.
n Ejemplo: Tincin Gram y Ziehl-Neelsen
Tincin de GRAM
n Colorante primario- cristal violeta, tie la bacteria de
color morado

n Agente mordente- Yodo- forma un complejo insoluble


con cristal violeta y los compuestos protoplsmicos.
Ayuda a adherir el tinte a la clula. Ayuda a resistir la
decoloracin

n Agente decolorante- alcohol etlico al 95% y acetona, el


cual sirve como solvente de lpidos y agente
deshidratante de protenas.

n Colorante secundario-safranina-tie de rojo a la


bacteria
Preparacin de la tincin de
Gram
n Preparacin del frotis
n Cristal violeta (30 segundos -
1minuto)
n Lavar con agua
n Yodo (1 minuto)
n Lavar con agua
n Alcohol etlico-acetona
suavemente (5-15 segundos)
n Lavar con agua
n Safranina (45-60 segundos)
n Lavar con agua
n Secar al aire
Gram +
Bacteria Gram-
Gram positivo Gram negativo

Fijacin

Cristal violeta

Mordente (Yodo)

Decoloracin

Colorante de
contraste
Resultados de Gram
TINCIN DE GRAM

Tincin de Gram de una muestra de lquido cerebro-


espinal infectado con Bacillus anthracis
Tincin Alcohol-cido Resistente

n Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son


alcohol-cido resistente.
n Los microorganismos alcohol-cido resistentes se
caracterizan por tener una pared celular gruesa de
cera (lipoidal) que contiene cido miclico.
n Los organismos que son decolorados por el
alcohol cido no son cido resistente.
Tincin Alcohol-cido Resistente:
Ziehl-Neelsen

n Colorante primario- Carbolfucsina (fenol 5%). Puede


penetrar la pared

n Agente decolorante- alcohol cido (3% HCl +95%


alcohol etlico)

n Colorante secundario o contrasto: Azul de metileno se


utiliza para teir de azul las bacterias que quedaron
incoloras
Preparacin de la tincin
alcohol-cido resistente

n Preparar un frotis
n Carbolfucsina (3 minutos). Cubrir completamente y
calentar a emisin de vapores por 5 minutos. No hervir.
n Lavar con agua
n Decolorar con alcohol etlico-HCl
n Lavar con agua
n Azul de metileno por 1-2 minutos
n Lavar con agua
n Secar al aire
Tincin de esporas
Mtodo de Schaffer-Fulton

n Clula vegetativa- forma metablicamente activa =


bacterias

n Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente


resistente

n Los miembros del gnero anaerobio Clostridium,


Desulfotomaculum y Bacillus pueden existir
metablicamente activos o inactivos.
Formacin de esporas como
mtodo de sobrevivencia
Condiciones ambientales
hostiles, ocurre esporo-
gnesis la cual forma la
espora. Condiciones ambien-
tales favorables, ocurre
germinacin, lo cual forma la
clula vegetativa
Preparacin de la tincin
de esporas

n Preparar el frotis
n Verde Malaquita (2-3 minutos) a emisin de
vapores
n Dejar enfriar la laminilla y enjuagar con agua
n Safranina (30 segundos)
n Lavar con agua
n Secar al aire
TINCIN DE SCHAEFFER Y
FULTON
Tincin de cpsula

n Cpsula: estructura gelatinosa secretada por


algunas bacterias
n Las clulas que tienen cpsula son virulentas y
causan enfermedades ya que protegen a la clula
de la accin fagoctica del hospedero.
n La mayora de las cpsulas estn compuestas de
polisacridos, por lo que son solubles en agua.
Tincin de cpsula
Colorante primario- Cristal Violeta 1%- tie todo el
frotis color oscuro
Decolorante y Colorante de contraste- Sulfato de
Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario

No se enjuaga con agua por que la cpsula es


soluble en agua.- funcin de decolorante
El CuSO4 es absorbido en el material de la
cpsula que ha sido decolorada - funcin de
colorante de contraste
Preparacin de tincin de cpsula

n Preparacin de un frotis grueso


n Dejar secar a temperatura ambiente
n Cristal violeta 1% (5-7 minutos)
n Enjuagar con CuSO4
n Secar al aire
Tincin negativa
(Dugid)

n Ideal para poder observar la estructura de la


cpsula
n La tincin se logra mediante una mezcla del
colorante y el cultivo de bacteria
n El colorante utilizado es India Ink(Tinta
China)
n Se le conoce como efecto de cielo estrellado
Pasos a seguir para tincin negativa de
cpsula
TINCIN DE KNAYSI. PARED
CELULAR
Preparar el frotis
Mordente de Kaysi (cido tnico a sturacin +
alumbre de potasio) 10 minutos
Enjuagar con agua
Colocar 1 gota de fucsina
Colcar un cubreobjetos
Observar a inmersin
PARED CELULAR
PARED CELULAR

Mordente

Fucisna

Pptidoglicana

Pared celular Soma


TINCIN DE LOS FLAGELOS

Los flagelos son estructuras demasiado finas


para poder ser visibles en el microscopio de luz.
Frotis
Mordente de cido tnico para formar un
precipitado denso en la pared celular y en
los flagelos
Teir con fuscina bsica
FLAGELO BACTERIANO
TINCIN DEL NUCLEOIDE
BACTERIANO

Tincin de Feulgen la cual es especfica


para el DNA.
Frotis fijado con tetrxido de osmio
Digerir con KOH calentando
Cubrir con el colorante de Shift
CUERPOS CROMTICOS
(NCLEO) FEULGEN
GRNULOS METACROMTICOS

Preparar el frotis
Azul de metileno de Leffler 15 segundos
Enjuagar con agua
Observar a inmersin
GRNULOS METACROMTICOS