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Revista Colombiana de Qumica

ISSN: 0120-2804
orodriguez@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia
Colombia

Espinel, Esperanza; Lpez, Elizabeth


PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE a-AMILASA DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA
MEDIANTE FERMENTACIN EN FASE SLIDA
Revista Colombiana de Qumica, vol. 38, nm. 2, 2009, pp. 191-208
Universidad Nacional de Colombia
Bogot, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=309026681001

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REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 38, No. 2 DE 2009

Orgnica y Bioqumica
PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE a-AMILASA
DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE
FERMENTACIN EN FASE SLIDA

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF a-AMYLASE FROM


PENICILLIUM COMMUNE PRODUCED BY SOLID STATE
FERMENTATION

PURIFICAO E CARACTERIZAO DA a-AMILASA DE PENICILLIUM


COMMUNE PRODUZIDA MEDIANTE FERMENTAO EM FASE SLIDA

Esperanza Espinel1,2, Elizabeth Lpez1,3

Recibido: 17/12/08 Aceptado: 21/08/09

xima actividad de hidrlisis de almidn


soluble con pH 6,0, y estabilidad en un in-
Este estudio reporta la purificacin y ca- tervalo de pH de 5,0-7,0. La estabilidad
racterizacin parcial de una a-amilasa trmica de la enzima se present en el in-
producida por Penicillium commune me- tervalo de temperatura 0-50 C y su tem-
diante fermentacin en fase slida, em- peratura ptima fue 70 C. Los iones
pleando yuca blanca colombiana (Ma- Ca2+, Ba2+ y Ag+ aumentaron significati-
nihot esculenta Crantz) como soporte. La vamente la actividad de la enzima, siendo
enzima fue purificada por precipitacin
el in Ca2+ el que tuvo el ms alto poder
fraccionada con sulfato de amonio, cro-
activador. Cu2+ no alter significativa-
matografa de intercambio aninico
mente la actividad de la enzima, mientras
(DEAE-Sephadex A-50), cromatografa
de filtracin por gel (Sephadex G-75) y que Li+ y Fe3+ la disminuyeron ligera-
cromatografa de intercambio catinico mente (13%), y Co2+ y Hg2+ la disminu-
(CM-Sephadex C-50) obteniendo una ac- yeron 25% y 40% respectivamente. Los
tividad especfica final de 314,82 U/mg, valores de Km y Vmx fueron calculados
un grado de purificacin del orden de 62 y usando la linealizacin de Lineweaver-
un rendimiento de 9%. La purificacin Burk, con el resultado Km = 0,48 mg/mL
hasta la homogeneidad fue confirmada y Vmx = 5,85 mmol glucosa/min. Entre
por SDS-PAGE. El peso molecular esti- los principales productos de hidrlisis del
mado fue 35 kDa. La enzima mostr m- almidn de yuca se encuentran la maltosa

1 Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. Bogot, Colombia.
2 Direccin actual Colegio Marruecos y Molinos IED, SED. Bogot, Colombia. neespinelb@unal.edu.co
3 melopezr@unal.edu.co

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y la glucosa, este resultado proporciona ver-Burk. Among hydrolysis products of


evidencia de que la enzima es capaz de tapioca starch are maltose and glucose,
romper los enlaces glicosdicos a-1,4 del this result provides evidence of the enz-
almidn, comportamiento caracterstico yme ability to hydrolyze the starch a-1,4
de una a-amilasa. glucosidic linkages, a characteristic
behavior of an a-amylase.
a-amilasa, Penici-
llium commune, fermentacin en fase s- a-amylase, Penicillium
lida, yuca blanca colombiana. commune, solid state fermentation, co-
lombian white tapioca.

This study reports the purification and


partial characterization of an a-amylase Este estudo reporta a purificao e carac-
from Penicillium commune produced by terizao parcial de uma a-amilasa pro-
solid state fermentation using colombian duzida por Penicillium commune median-
white tapioca (Manihot esculenta Crantz) te fermentao em fase slida usando
as support. The enzyme was purified by mandioca branca colombiana (Manihot
ammonium sulphate precipitation, anion esculenta Crantz) como suporte. A enzi-
exchange chromatography (DEAE-Sep- ma foi purificada por precipitao frac-
hadex A-50), gel filtration chromato- cionada com sulfato de amnio, cromato-
graphy (Sephadex G-75) and cation ex- grafia de intercambio aninico (DEAE-
change chromatography (CM-Sephadex Sephadex A-50), cromatografia de fil-
C-50). A purification factor of 62 with a trao por gel (Sephadex G-75) e croma-
9% yield and final specific activity of tografia de intercambio catinico (CM-
314.82 U/mg were recorded. Purification Sephadex C-50) obtendo una actividade
to homogeneity was confirmed by SDS especfica final de 314.82 U/mg, um grau
PAGE. The molecular weight was esti- de purificao na ordem de 62 e um rendi-
mated to be 35 kDa. The enzyme shows mento de 9%. A purificao at homo-
maximal activity in the soluble starch geneidade foi confirmada por SDS-
hydrolysis at pH 6.0, and is stable in a PAGE. O peso molecular estimado foi de
range of pH from 5.0 to 7.0. Thermal sta- 35 kDa. A enzima mostrou mxima acti-
bility was in the range of temperature vidade de hidrlises de amido solvel a
from 0 to 50 C, and its optimal tempera- pH 6.0, e estabilidade num intervalo de
ture was 70 C. Ions Ca2+, Ba2+ and Ag+ pH de 5.0-7.0. A enzima foi estvel num
significantly increase the activity of the intervalo de temperatura de 0-50 C, e
enzyme, with ion Ca2+ as the highest acti- sua temperatura ptima de reaco foi de
vator. Cu2+ does not alter significantly 70C. ons Ca2+, Ba2+ e Ag+ aumenta-
the activity of the enzyme, whereas Li+ ram significativamente a actividade da
and Fe3+ decrease it slightly (13%) and enzima, sendo o io Ca2+, o que teve o
Co2+ and Hg2+ decrease it 25% and 40% mais alto poder indutor. Cu2+ no alterou
respectively. Km = 0.48 mg/mL and Vmax significativamente a actividade da enzi-
= 5.85 mol glucose/min were calcula- ma, enquanto que Li+ e Fe3+ a diminu-
ted using the linearization of Linewea- ram ligeiramente (13%), e Co2+ e Hg2+ a

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diminuram 25% e 40% respectivamente. natural de hongos filamentosos como Pe-
Os valores de Km e Vmx foram calculados nicillium commune, lo que genera
usando a linearizao de Linewea- mayores rendimientos en la produccin
ver-Burk, obtendo Km = 0.48 mg/mL e de enzimas y la mnima degradacin por
Vmx = 5.85 mmol glucosa/min. Entre os accin de proteasas (5).
principais produtos de hidrlises do ami-
do de mandioca encontram-se a maltosa e Cada una de las aplicaciones industria-
glucosa; este resultado proporciona evi- les de las a-amilasas requiere propieda-
dencia de que a enzima capaz de romper des nicas respecto a especificidad, esta-
os enlaces glucosdicos a-1,4 do amido, bilidad, temperatura y dependencia del
comportamento caracterstico de uma pH (6), y la bsqueda de enzimas que pre-
a-amilasa. senten propiedades diferentes a las cono-
cidas se mantiene como un tema de inte-
a-amilasa, Penici- rs en investigacin.
llium commune, fermentao em fase s-
lida, mandioca branca colombiana. Recientemente se ha reportado la pro-
duccin de a-amilasa por hongos del g-
nero Penicillium (7, 8), sin embargo, en
estos trabajos no se lleva a cabo la purifi-
Las a-amilasas son enzimas que catalizan cacin y posterior caracterizacin de la
al azar la hidrlisis de enlaces glicosdi- enzima, etapas fundamentales para esta-
cos a-1,4 de polisacridos como el almi- blecer su potencial en aplicaciones bio-
dn y el glicgeno, para producir malto- tecnolgicas.
sa, oligosacridos de diferentes tamaos En esta publicacin se describe la pro-
y cadenas ms o menos ramificadas lla- duccin, purificacin y caracterizacin ci-
madas dextrinas lmite (1). Son de gran ntica de una a-amilasa obtenida a partir
importancia en la industria alimenticia, de una cepa nativa de Penicillium commu-
textil, papelera y farmacolgica, y aun- ne mediante fermentacin en fase slida,
que las fuentes productoras de a-amilasas empleando yuca blanca colombiana (Ma-
incluyen plantas, animales y microorga- nihot esculenta crantz) como soporte.
nismos, son las enzimas microbianas las
que encuentran mayor demanda en apli-
caciones industriales (2). Tradicional-
mente la produccin de a-amilasas se ha
llevado a cabo mediante procesos de fer-
mentacin lquida sumergida (FLS) debi- Una cepa de Penicillium sp. fue donada
do al mayor control de factores ambienta- por el laboratorio de microbiologa del de-
les como temperatura y pH, sin embargo, partamento de farmacia de la Universidad
la fermentacin en fase slida (FFS) Nacional de Colombia. El microorganis-
constituye una alternativa interesante mo se mantuvo a temperatura ambiente en
puesto que los metabolitos se concentran, medio Saboraud agar-maltosa 4%. El al-
y los procesos de purificacin son menos midn de yuca empleado fue adquirido en
costosos (3, 4). Los medios empleados en Ciacomeq Ltda., Bogot, Colombia. La
FFS son semejantes en textura al hbitat yuca (Manihot esculenta Crantz) fue com-

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prada en un supermercado en Bogot y fue teo de esporas con un hemacitmetro.


rallada manualmente luego de retirar la Una suspensin de 1x107 esporas/mL se
cscara empleando un rallador de plstico utiliz para inocular los medios de fer-
domstico convencional. mentacin.

La identificacin se realiz mediante tc-


nicas de biologa molecular en el labora- Los medios de fermentacin se prepara-
torio de micologa y fitopatologa ron tomando como referencia el medio
(LAMFU) de la Universidad de los Czapcek-Dox (9), y se suplementaron
Andes de Bogot. El Penicillium sp. fue con CaCl2. Se formularon dos medios,
crecido en medio lquido SDY (sucrosa, segn la fuente de carbono, almidn de
dextrosa y extracto de levadura) (9). A yuca o yuca rallada, y se realizaron dos ti-
partir de la biomasa generada se realiz pos de fermentaciones, FFS y FLS, en
una extraccin de ADN total a travs del condiciones estticas.
mtodo de extraccin por fenol-cloro- Para las FFS el medio se prepar con 10 g
formo (10). Posteriormente, se amplifi- de almidn 10 g de yuca rallada, hume-
c por PCR la regin ITS1- 5,8S-ITS2 decidos con 10 mL de solucin de sales.
de la subunidad ribosomal, con los ceba- El medio para la FLS contena 3,0 g de al-
dores universales ITS4 e ITS5 (11). La midn de yuca 3,0 g de yuca rallada,
regin amplificada fue secuenciada por suspendidos en 100 mL de solucin de sa-
la compaa Macrogen (Sel, Corea). La les diluda 1:10. La solucin de sales con-
identificacin molecular se realiz com- tena (g/100 mL de agua destilada):
parando la secuencia obtenida contra to- (NH4)2SO4, 3,00; MgSO4, 0,50; KCl,
das las secuencias nucleotdicas de hon- 0,50; FeSO4, 0,01; K2HPO4, 1,00;
gos reportadas en la base de datos del CaCl2, 0,15.
NCBI (National Center for Biotech-
nology Information: http://www.ncbi. Los medios se esterilizaron a 121 C
nlm.nih. gov), los anlisis bioinformticos y 15 psi por 15 min, se inocularon con 1
se hicieron utilizando el algoritmo Blastn. mL de suspensin de esporas de P. com-
Los alineamientos con mayor puntaje y m- mune y se incubaron a 22 C. Se hizo se-
xima identidad obtenidos (E value = 0; guimiento cada 24 horas de la produc-
identidad 100%) permiten identificar el mi- cin de la enzima. Para la FLS se separ
croorganismo como perteneciente a la es- el hongo mediante centrifugacin por 30
pecie P. commune. min a 8 000 rpm, en una centrfuga
MLW modelo T52; el sobrenadante
constituy el extracto crudo. En el caso
de la FFS se adicionaron 50 mL de buf-
El micelio de P. commune fue suspendido fer fosfato 0,1 M pH 7,0, se agit mec-
en agua estril, con agitacin constante nicamente durante 30 min en un agitador
durante 10 min. se filtr sobre gasa estril de placa MLW modelo Thys 2 a 80 osci-
en condiciones aspticas para retirar el laciones completas por minuto, se filtr
micelio sobrenadante, y se realiz el con- la solucin sobre algodn y se centrifug

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por 30 min a 8 000 rpm, el sobrenadante
constituy el extracto crudo. Se tomaron
10 mL de cada extracto crudo y se diali-
zaron contra agua destilada para realizar
Para medir la actividad a-amilasa se utili-
medidas de concentracin de protena y
z el mtodo de Nelson-Somogyi (12). La
actividad enzimtica.
mezcla de reaccin contiene 1 mL de so-
lucin de almidn soluble al 1% (p/v),
El trabajo se continu empleando la
200 mL de una dilucin apropiada de la
FFS con yuca rallada, por ser el medio
muestra que contiene la enzima, y 800
en el cual se obtuvo la mayor produccin
mL de CaCl2 5mM. Luego de 20 min de
de enzima.
reaccin a 37 C, se adicionan 500 mL
del reactivo de Somogyi y se lleva la mez-
cla a un bao Mara a temperatura de ebu-
llicin. Pasados 10 min, se retira la mez-
cla del bao y se adicionan 500 mL del
Se emplearon bandejas de aluminio reactivo de Nelson, se completa el volu-
(22,50 cm X 16,50 cm X 2,50 cm), en men a 10 mL con agua destilada y se reali-
cada una se puso una capa de 1 cm de es- za la determinacin colorimtrica a 500
pesor aproximadamente de la mezcla de nm (espectrofotmetro Genesys 5).
100 g de yuca rallada y 100 mL de solu-
cin de sales. Las bandejas con el medio Una unidad de actividad enzimtica se
se esterilizaron a 121 C y 15 psi durante define como la cantidad de enzima que li-
15 min y se inocularon con 3 mL de la bera 1 mg de glucosa por minuto bajo las
suspensin de esporas. La incubacin se condiciones del ensayo, 37 C, pH 6,0.
realiz a 22 C durante siete das. Para La actividad especfica se define como las
obtener el extracto crudo se aadieron unidades de actividad por miligramo de
150 mL de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0, protena.
se agit mecnicamente durante una hora La concentracin de protenas fue de-
a temperatura ambiente en un agitador de terminada por el mtodo colorimtrico de
placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscila- Bradford (13), empleando albmina sri-
ciones completas por minuto, y se filtr la ca bovina como protena patrn.
solucin sobre algodn para retirar los
slidos gruesos. Al residuo se le realiz
una segunda extraccin bajo las mismas
condiciones y se juntaron los dos extrac- Precipitacin con sulfato de amonio
tos. El filtrado total se centrifug a 8 000
rpm por 30 min, en una centrifuga MLW El extracto crudo fue sometido a precipi-
modelo T52, el precipitado se descart y tacin fraccionada con sulfato de amonio.
se obtuvo un sobrenadante con un volu- La fraccin con la protena de inters pre-
men de 2085 mL. De este sobrenadante se cipit entre 50 y 80% de saturacin. Este
tomaron 100 mL para realizar ensayos precipitado se disolvi en el mnimo volu-
preliminares de precipitacin fraccionada men de agua destilada, se dializ 24 h
con sulfato de amonio. contra agua destilada y se liofiliz.

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Cromatografa de intercambio aninico ca (NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad de


flujo fue de 27 mL/h. A cada fraccin
El liofilizado de la etapa anterior se di- (4,5 mL) se le midi la absorbancia a 280
solvi en el mnimo volumen de buffer nm y la actividad enzimtica. Las frac-
fosfato 50 mM, pH 6,0, y se aplic a una ciones que contenan la protena de inte-
columna de DEAE Sephadex A-50 (2,5 x rs, se mezclaron en un pool (pool
30,0 cm) equilibrada con el mismo buff- CM-pico I) que se dializ contra agua
er. La elusin se realiz por medio de un destilada y se liofiliz.
gradiente discontinuo de fuerza inica
(NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad de flu-
jo fue de 30 mL/h. A cada fraccin (5 ml)
se le midi la absorbancia a 280 nm y la
actividad enzimtica. Las fracciones que Determinacin del peso molecular
contenan la protena de inters, se mez- por electroforesis en condiciones
claron en un pool (pool DEAE-pico II), desnaturalizantes
que se dializ contra agua destilada y se
liofiliz. Se corrieron electroforesis SDS-PAGE
(14), con geles de poliacrilamida al 12%,
los cuales se tieron con azul de Coomas-
Cromatografa de filtracin por gel sie. Los marcadores de peso molecular
empleados fueron de la marca Bio-Rad,
El pool DEAE-pico II se disolvi en con las siguientes protenas como estn-
NaCl al 1% y fue sometido a cromato- dares: fosforilasa B (104 kDa), albmina
grafa de filtracin por gel sobre Sepha- de suero bovino (83 kDa), ovoalbmina
dex G-75 (2,5 X 30,0 cm). La elusin de (49 kDa), anhidrasa carbnica (37 kDa),
las protenas se realiz con NaCl al 1%. inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa) y
La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. A lisozima (20 kDa).
cada fraccin (4,5 mL) se le midi la ab-
sorbancia a 280 nm y la actividad enzi-
mtica. Las fracciones que mostraron
Efecto del pH sobre la actividad
mayor actividad enzimtica, se mezcla-
y la estabilidad de la enzima
ron en un pool (pool G-75-pico II) que se
dializ contra agua destilada y se con-
El pH ptimo de la enzima fue determina-
centr por liofilizacin.
do realizando medidas de actividad en un
rango de pH entre 2,0 y 12,0 a 37 C.
Cromatografa de intercambio Para establecer el efecto del pH sobre la
catinico estabilidad, la enzima fue incubada a 37
C por 1 h en diferentes buffers en un ran-
El pool G-75-pico II se disolvi en buffer go de pH entre 2,0 y 12,0 y la actividad
fosfato 0,05 M, pH 7,0 y fue sometido a residual fue determinada bajo las condi-
cromatografa de intercambio catinico ciones normales del ensayo. Se usaron
sobre CM Sephadex C-50 (2,5 x 30,0 buffers glicina-HCl, acetato-actico, fos-
cm). La elusin se realiz por medio de fato y glicina-NaOH, todos con concen-
un gradiente discontinuo de fuerza ini- tracin 100 mM.

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Efecto de la temperatura sobre la nes metlicos fue definida como de
actividad y la estabilidad de la enzima 100%. Para medir los efectos de EDTA y
SDS, la enzima fue incubada con el com-
La temperatura ptima de la enzima fue ponente respectivo por 30 min a 37 C,
determinada en un rango de temperatura luego se realiz la medicin de actividad
entre 0 y 92 C en buffer fosfato 100 mM, enzimtica residual bajo las condiciones
pH 6,0. El efecto de la temperatura sobre normales del ensayo. La concentracin
la estabilidad fue establecido incubando final en la mezcla de reaccin para ambos
por 1 h la enzima en buffer fosfato 100 compuestos fue 10 mM. La actividad en
mM, pH 6,0 en un rango de temperatura ausencia de EDTA y SDS fue considera-
entre 40 y 92 C. La actividad residual da como de 100%.
fue determinada bajo las condiciones nor-
males del ensayo.
Capacidad para hidrolizar el almidn
de yuca y productos de hidrlisis
Efecto de la concentracin de sustrato
Los productos finales de hidrlisis luego
Se utilizaron siete concentraciones dife- de 10, 20, 30 y 60 min de incubacin fue-
rentes de almidn soluble (0,2-1,4 ron evaluados segn Hmidet et al. (15),
mg/mL). Las mediciones de actividad se mediante comparacin con patrones de
realizaron bajo las condiciones normales glucosa y maltosa en una cromatografa
del ensayo. La mezcla de reaccin conte- de capa delgada (silica gel 60 F254
na 100 mL de enzima purificada; 100 mL Merck), la fase mvil fue clorofor-
de CaCl2 5 mM; 800 mL de buffer fosfato mo/actico/agua (70:60:10, v/v/v) y el
100 mM, pH 6,0, y 1 mL de solucin de revelado se hizo con H2SO4/metanol
almidn. La estimacin de Km y Vmx se (5:95, v/v). Los productos de hidrlisis
realiz a partir de la linealizacin de Li- fueron observados como manchas oscu-
neweaver-Burk. ras luego de adicionar el revelador y ca-
lentar a 120 C por 3 min.

Efecto de algunos iones metlicos,


EDTA y SDS sobre la actividad
enzimtica

Se utilizaron las siguientes sales: La cintica de produccin de a-amilasa


CuSO4.5H2O, CaCl2.2H2O, LiCl, en los diferentes medios de cultivo se pre-
FeCl3.6H2O, AgNO3, HgCl2, BaCl2 y senta en la Figura 1.
CoCl2. La concentracin final de sal en la
mezcla de reaccin para todos los casos En los medios con yuca rallada hay un
fue 1,0 mM. La enzima, previamente dia- incremento de la actividad a-amilasa a
lizada contra agua destilada, se incub partir de 48 horas, con un mximo a las
con la solucin de la sal durante 30 min a 168 horas (siete das), en las que la activi-
37 C, luego se determin la actividad re- dad enzimtica fue de 8,21 U/mL para la
sidual bajo las condiciones normales del FFS y 6,15 U/mL para la FLS. En cuanto
ensayo. La actividad sin adicin de los io- a los medios con almidn de yuca, la acti-

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Actividad a-amilasa durante cultivos en FFS (-) y FLS () usando almidn de yuca (O) y yuca ralla-
da (p) como sustrato. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

vidad enzimtica comienza a aumentar a Los resultados obtenidos sugieren que


partir de las 120 horas (5 das) sin alcan- la yuca rallada constituye un mejor sopor-
zar los valores observados con yuca ralla- te para la produccin de a-amilasa por P.
da, no obstante, a partir de las 168 horas commune y que en caso de usar almidn
(7 das) se aprecia un incremento en la ac- de yuca en fermentacin en fase slida, la
tividad enzimtica en la fermentacin l- produccin de la misma cantidad de
quida sumergida que presenta un valor a-amilasa tomara ms tiempo.
mximo de 7,76 U/mL a los 10 das de
observacin.

La purificacin de a-amilasa de P. com-


El crecimiento de P. commune, un mune se resume en la Tabla 1. El extracto
hongo filamentoso, se favoreci en el me- crudo fue precipitado por adicin de sul-
dio slido empleando yuca rallada; este fato de amonio, la mayor actividad
medio ofreca una mayor rea superficial a-amilasa se encontr en la fraccin
y presentaba una textura ms rugosa, se- 50-80%, esta fraccin fue aplicada a una
mejante a las condiciones de los hbitats columna de DEAE Sephadex A-50, cuyo
usuales de este microorganismo. perfil de elusin (Figura 2) mostr un ni-

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Resumen de la purificacin de a-amilasa de Penicillium commune.

Extracto crudo 1985 873,40 4446,40 5,09 1,00 100


Precipitado sulfato 10 220,08 3414,14 15,51 3,05 76
de amonio fraccin
50 80%
DEAE-Sephadex 5 49,65 2660,55 53,59 10,53 59
A-50
Sephadex G-75 2 3,66 535,61 146,34 28,75 12
CM Sephadex C-50 0.7 1,28 402,97 314,82 61,85 9

co pico con actividad a-amilasa luego de con NaCl al 1%. El perfil cromatogrfico
la adicin de buffer fosfato 50 mM, pH (Figura 3) mostr un nico pico de activi-
6,0 NaCl 0,2 M. Las fracciones del pico dad a-amilasa, las fracciones del pico ac-
con actividad fueron reunidas en el pool tivo fueron reunidas en el pool G-75 pico
DEAE-pico II, el cual fue dializado con- II, el cual fue dializado contra agua desti-
tra agua destilada y liofilizado, alcanzan- lada y liofilizado, con este paso se alcan-
do un grado de purificacin de 10,53. z un grado de purificacin de 28,75.
Este pool fue aplicado a una columna El pool G-75 pico II se disolvi en
de Sephadex G-75, la elusin se realiz buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, y fue apli-

Perfil de elusin sobre DEAE-Sephadex A-50. (O) Absorbancia 280 nm; (p) actividad enzimtica.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

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Perfil de elusin sobre Sephadex G-75. (O) Absorbancia 280nm; (p) actividad enzimtica. Cada
punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

cado a una columna de CM Sephadex 10 y 210 kDa (2), sin embargo, la mayo-
C-50. El perfil de elusin (Figura 4) mos- ra de las a-amilasas microbianas tienen
tr un nico pico con actividad a-amilasa su peso molecular entre 30 70 kDa, ran-
luego de la adicin de buffer fosfato 50 go en el que se encuentra la a-amilasa de
mM, pH 7,0 NaCl 0,1 M. Las fracciones P. commune.
con actividad fueron reunidas en el pool
CM- pico I, el cual fue dializado contra
agua destilada, liofilizado y disuelto en
buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, alcanzan-
do un grado de purificacin final de
61,85. Este pool mostr una sola banda Cuando la actividad de la enzima fue en-
en la electroforesis SDS-PAGE (Figura sayada con diferentes valores de pH, la
5), indicando la purificacin hasta la ho- mxima actividad se obtuvo con pH 6,0.
mogeneidad de la enzima.
En otros estudios, el pH ptimo de la
a-amilasa de Penicillium chrysogenum
fue de 5,0 (7) y el de la a-amilasa de Peni-
La comparacin de la movilidad electro- cilium griseofulvum de 5,5 (8). Aunque el
fortica de la a-amilasa de P. commune pH ptimo para las a-amilasas vara entre
con la de los marcadores de peso molecu- 2,0 y 12,0 (2), la mayora de las a-amila-
lar en una electroforesis SDS-PAGE (Fi- sas microbianas tienen su pH ptimo en el
gura 6) permite establecer un peso mole- rango ligeramente cido a neutro, rango
cular de 35 kDa. El rango de peso en el que se encuentra el pH ptimo de la
molecular para las a-amilasas oscila entre a-amilasa de Penicillium commune.

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REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 38, No. 2 DE 2009

Orgnica y Bioqumica
Perfil de elusin sobre CM Sephadex C-50. (O) Absorbancia 280nm; (p) actividad enzimtica.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

Electroforesis SDS-PAGE de las fracciones de purificacin de a-amilasa de Penicillium commune


1) Extracto crudo 2) Sulfato de amonio fraccin 50-80% 3) DEAE-pico II 4) G-75 pico II 5) CM-pico I.

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Determinacin del peso molecular de a-amilasa de Penicillium commune por electroforesis


SDS-PAGE. 1) Marcadores de peso molecular. 2) a-amilasa purificada de Penicillium commune.

Luego de la incubacin de la enzima de estabilidad trmica de la enzima es


por 1 h en buffer de diferente pH, se ob- 0-50 C. Vale la pena destacar que la en-
serva que la enzima fue estable en el ran- zima conserva 35% de su actividad des-
go de pH 5,0-7,0. La enzima retuvo 95% pus de ser calentada una hora a 92 C.
de su actividad con un pH 5,0 y 98,8% Una consecuencia de orden prctico deri-
con un pH 7,0. Rangos de estabilidad en vada de este hallazgo, es la necesidad de
el pH similares han sido reportados para revisar cul es el tiempo requerido para la
las a-amilasas de Aspergillus awamori
inactivacin total de la enzima en las me-
(16) y Thricoderma viride (17).
didas de actividad por el mtodo de Nel-
son-Somogyi.

Con los datos obtenidos en la determi-


La temperatura a la cual se alcanza la m- nacin de la temperatura ptima se
xima actividad y, por tanto, corresponde construy una grfica de Arrhenius
a la temperatura ptima de reaccin, es 70 (Figura 8) para as poder analizar la inac-
C. Cuando se sobrepasa este valor, la tivacin trmica de la enzima. El cambio
actividad disminuye rpidamente porque de pendiente cerca a los 50 C que se ob-
la enzima se va desnaturalizando. serva en la grfica, sugiere que la incuba-
Como se puede observar en la Figura cin por periodos prolongados de tiempo
7, cuando la enzima fue incubada durante a esta temperatura induce un cambio con-
una hora en buffer fosfato 100 mM, pH formacional de la enzima. Un caso de
6,0 en un rango de temperatura entre 40 y comportamiento similar fue reportado
92 C, la actividad decreci rpidamente por Uchino, para una a-amilasa de Baci-
a partir de 50 C, indicando que el rango llus sp. (18).

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Orgnica y Bioqumica
Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de a-amilasa de Penicillium commune. Cada punto ex-
perimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

Grfica de Arrhenius. Se observan dos lneas rectas con cambio de pendiente cerca de los 50 C.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

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a-amilasas son protenas pequeas que


contienen por lo menos un in Ca2+ por
Los valores de Km y Vmx determinados molcula. La cantidad de iones Ca2+ pue-
usando la linelizacin de Lineweaver- de variar de uno a diez dependiendo del
Burk (Figura 9) fueron 0,48 mg/mL y origen de la enzima. De acuerdo con
5,85 mmol glucosa/min, respectivamen- Gupta, et al. (2), para lograr una comple-
te. La a-amilasa de Penicillium commune ta remocin de los iones Ca2+ no basta
presenta una cintica tpica de Michae- con dializar contra agua destilada, se hace
lis-Menten y posee una alta afinidad por necesario tratar la enzima con EDTA o
el almidn soluble respecto a otras a-ami- EGTA. Adems, segn Nielsen, et al.
lasas microbianas como Thermofibida (22), de los tres iones calcio (CaI, CaII,
fusca (0,88 mg/mL), Aureobasidium pu- CaIII) que la a-amilasa de Bacillus hal-
llulans (5,75 mg/mL) y Bacillus sp. (1,64 mapalus contiene, es posible remover
mg/mL) (18, 19, 20), sin embargo, es CaIII sin observar cambios estructurales
muy similar a la del hongo filamentoso significativos, pero no CaI o CaII. Lo an-
Aspergillus fumigatus (0,42 mg/mL) terior justifica que luego de la dilisis
(21). contra agua destilada no se genere prdi-
da total de la actividad enzimtica y, por
lo tanto, se pueda evaluar el efecto de los
iones escogidos, del EDTA y del SDS.
Como se puede notar, Ca2+, Ba2+ y
El efecto de algunos iones metlicos, del Ag+ aumentan significativamente la acti-
EDTA y del SDS sobre la actividad enzi- vidad de la enzima, siendo el in Ca2+ el
mtica de la a-amilasa de Penicillium que tiene el ms alto poder activador. El
commune se muestra en la Figura 10. Las efecto activador del calcio puede estar re-

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de a-amilasa de Penicillium commune.


Km=0,48mg/ml, Vmx=5,85 mmol glucosa/min.

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Orgnica y Bioqumica
Efecto de algunos iones metlicos, del EDTA y del SDS sobre la actividad enzimtica. La activi-
dad fue determinada luego de la incubacin de la enzima por 30 min a 37 C con diferentes sales, EDTA y
SDS. La concentracin final de los iones metlicos fue 1 mM, la de EDTA y SDS 10 mM. Al control no se le
adicionaron sales, EDTA o SDS.

lacionado con interacciones adicionales su efecto sobre la estructura terciaria de


favorables que contribuyen a la neutrali- la enzima, sin que se presente completa
zacin de las cargas negativas en la de los desnaturalizacin con la concentracin
dominios estructurales A y B de la enzima ensayada.
(22). Cu2+ no altera significativamente la
actividad de la enzima, mientras que Li+
y Fe3+ la disminuyen ligeramente y Co2+
y Hg2+ la disminuyen considerablemente.
El anlisis cromatogrfico de los produc-
La inhibicin por iones mercurio su- tos de hidrlisis del almidn de yuca por
giere, tal como lo indican Li, et al. (20), a-amilasa de Penicillium commune se
que residuos aminoacdicos con grupos muestra en la Figura 11. Entre los princi-
sulfihidrilo o imidazol son importantes en pales productos de hidrlisis se encuen-
la funcin de la enzima. Esta afirmacin tran maltosa y glucosa. La produccin de
concuerda con el hecho de que varios re- trazas de glucosa fue determinada desde
siduos de histidina (His210, His122, nu- los 10 min de reaccin, as como la for-
meracin para Taka amilasa) estn impli- macin de pequeas cantidades de malto-
cados en el mecanismo cataltico de las sa y dextrinas, cuya cantidad fue aumen-
a-amilasas. El agente quelante EDTA y tando a medida que aumentaba el tiempo
el surfactante SDS tambin mostraron ac- de reaccin. Este resultado proporciona
cin inhibitoria sobre la actividad de la evidencia de que la enzima presenta el
enzima. La inhibicin que ocasiona el comportamiento caracterstico de una
EDTA apoya la sugerencia de que la a-amilasa, ya que es capaz de romper los
a-amilasa de P. commune contiene cal- enlaces glicosdicos a-1,4 del almidn de
cio, y que su actividad es dependiente de yuca, lo cual es de inters por su potencial
este in. En cuanto al SDS, se corrobora en la produccin de biocombustibles.

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Cromatografa de capa delgada de los productos de hidrlisis de almidn de yuca por a-amilasa de
Penicillium commune. Las muestras fueron removidas con intervalos determinados de tiempo.

Resultados similares en la hidrlisis de xima estabilidad en el rango 0-50 C.


almidn han sido reportados para las Con temperaturas superiores probable-
a-amilasas de Penicillium griseofulvum y mente la enzima adquiere un estado con-
Penicillium chrysogenum (7, 8). formacional que le permite conservar
35% de su actividad despus de ser calen-
tada a 92 C durante una hora.

Tanto el almidn de yuca como la yuca La grfica de Arrhenius presenta un


blanca colombiana (Manihot esculenta cambio de pendiente cerca a los 50 C,
crantz) empleados como soporte, permi- sugiriendo que la incubacin por perio-
ten el crecimiento de Penicillium commu- dos prolongados de tiempo a esta tempe-
ne. En las condiciones usadas en esta in- ratura induce un cambio conformacional
vestigacin, el microorganismo slo de la enzima.
produce una a-amilasa. La comparacin
de las cinticas de produccin de la enzi- Dado que Ca2+ tiene el ms alto poder
ma en cultivos en FFS y FLS esttico, activador y el EDTA causa una fuerte in-
permite establecer que la fermentacin en hibicin, se confirma que la a-amilasa de
fase slida con yuca blanca rallada arroja Penicillium commune contiene calcio, y
los mejores resultados en cuanto a activi- que su actividad es dependiente de este
dad a-amilasa. in.

La enzima presenta un pH ptimo de La a-amilasa de Penicillium commune


6,0 y fue estable en un rango de pH entre es activa sobre almidn de yuca usado
5,0 y 7,0 a 37 C, adems tiene una tem- como sustrato, lo cual se evidencia en la
peratura ptima de 70 C y presenta m- produccin de maltosa y glucosa en la

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REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 38, No. 2 DE 2009

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