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Electrophorse : Techniques manuelles.

ELECTROPHORSE
Techniques manuelles

1. ACCESSOIRES (ncessaires) :

1. Chambre pour lectrophorse avec couvercle et pont adaptable. Rf :31100025.


2. Gnrateur de courant, rglable. Rf :31100024.
3. Applicateur pour chantillons. Rf :31100030 ou 31100031.
4. Densitomtre (Scanion) Rf :LIRA400.
5. Lames de verre (60x64 mm). Rf :3040020.
6. Micro pipette rglable de 5-50 L. Rf :31100010.
7. Cuvettes pour tampon, colorant et dcolorant.
8. Etuve ou lampe IR pour membranes.

2. RACTIFS (ncessaires) :
1. Tampon sroprotines Simacel N. Rf :60010015.
2. Tampon lipoprotines Simacel N. Rf :60010015. plus additif. Rf :60010020
3. Tampon hmoglobines Simacel Hb. Rf :60010040.
4. Colorant Rouge Ponceau S, pour Sero et Hb. Rf :60010030.
5. Colorant Noir Soudan + sol Alc, pour lipo. Rf :60010046.
6. Solution colorante et dcolorante pour sero et Hb. Rf :60010035.
7. Membranes dactate de cellulose sches. Rf :60010061, (ou humides).
8. SERACARD, 4 traces. Rf :30100045. ou 8 traces. Rf :30100040.
9. Papier buvard feuilles 75x155 mm. Rf :30100015

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3. TECHNIQUE OPRATOIRE POUR SROPROTINES

3.1. Prparation de la chambre pour lectrophorse.

1. Assurez-vous que la chambre est bien dconnecte du gnrateur.


2. Verser 400 mL de tampon SIMACEL N dans un compartiment de la chambre.
3. Uniformiser le niveau du tampon dans la chambre, en linclinant de faon crer
une communication entre les deux compartiments. Bien essuyer la partie haute de
la sparation pour viter les effets lectriques indsirables.

3.2. Prparation des membranes

1. Verser 100 mL de tampon SIMACEL N dans une cuvette.


2. Codifier les membranes avec un stylo bille.
3. Les immerger compltement dans le tampon et les laisser 2 3 mN ( 5 10 mN si
elles sont de type humide).
4. Prendre la SERACARD au format adquat et codifier chaque ligne avec le mme
N que celui dj crit sur les membranes.
5. Extraire de la cuvette une membrane et la mettre entre 2 feuilles de papier buvard,
passer plusieurs fois avec le dessus de la main pour liminer le tampon en excs.
Procder de la mme faon pour les membranes suivantes en utilisant chaque fois
des feuilles de papier buvard neuves.
6. Positionner la membrane sur le pont en faisant concider les perforations avec les
supports du pont adapts, commencer par la partie mobile puis la fixe de faon
avoir une bonne tension.
7. Positionner le pont dans la chambre en veillant bien ce que les extrmits des
membranes soient immerges dans le tampon et touchent les appuis situs dans le
fond de chaque compartiment.

3.3. Application de lchantillon Excution de llectrophorse :

1. Prendre la SERACARD prcdemment prpare.


2. Prlever avec une micro pipette variable la quantit de srum ( 10 14 L )
indique sur la feuille de garantie prsente dans chaque confection de
SERACARD, et la dposer dans la cellule codifie pralablement.
3. Choisir lapplicateur appropri, sassurer quil soit propre et sec.
4. Effectuer un premier prlvement avec lapplicateur en lappliquant dlicatement en
position bien verticale sur la cellule de la SERACARD contenant le srum choisi.

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ATTENTION : Avant de commencer effectuer les dpts, tenir compte que ceux-ci
seffectuent toujours du cot de la cuve signal par le signe moins (cathode).

5. Faire un premier dpt dessai sur la SERACARD en dehors des cellules ou sur un
morceau de papier buvard.
6. Effectuer un second prlvement du mme srum et le dposer sur la membrane,
en positionnant lapplicateur dans les cannelures du pont et en laccompagnant
doucement jusqu' son contact avec la membrane.
7. Laisser lapplicateur en contact avec la membrane environ 10 secondes. ( si lon
utilise des membranes de type humides, effectuer 2 dpts successifs ).
8. Procder de la mme manire pour toutes les autres membranes.
9. A la fin de lopration, ter lapplicateur et fermer la chambre avec son couvercle.
10. Connecter la chambre au gnrateur de courant.
11. Le temps de migration : est denviron 20 25 minutes pour les mthodes MICRO
et, de 25 30 minutes pour les mthodes SEMIMICRO.
12. Le voltage : est de 250 Vdc.

3.4. Coloration

1. Pendant la migration, prparer une cuvette avec 100 mL de colorant Rouge


ponceau S.
2. Le temps de migration termin, dconnecter la cuve du gnrateur, ter le
couvercle en faisant bien attention que les gouttes de condensation qui se sont
ventuellement formes sous celui-ci ne tombent pas sur les membranes.
3. Oter le pont de la chambre, en le tenant en position horizontale.
4. Oter les membranes du pont et, en les coupant le long des cots perfors, les
laisser tomber dans le bain de coloration.
5. Les laisser immerges au moins 10 minutes en les agitant de temps en temps.

ATTENTION ; le bain de coloration doit tre chang toutes les 10 oprations.

3. 5. Dcoloration Transparisation :

1. Pendant la coloration, prparer une cuvette avec 100 mL de solution de dcoloration


transparisation .
2. Sortir les membranes du bain de coloration et les immerger compltement dans ce
nouveau bain. Agiter lgrement et changer la solution lorsque celle-ci prend la mme
couleur que celle du fond de la bande, et ce jusqu obtenir un fond de membrane
compltement blanc. ( env. 4 5 oprations, 5 minutes )
3. Sortir de ce bain les membranes dcolores et, lune aprs lautre les dposer sur une
lame de verre propre et sche. A laide dune autre lame de verre, en utilisant le bord
de celle-ci et la tenant inclin, par glissement sur la membrane avec une lgre
pression liminer lexcs de liquide et les bulles dair.

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4. Disposer les membranes ainsi prpares sous une lampe I. R. ou mieux dans une
tuve sec ( poupinel), env.5 10 minutes 120 160C.

ATTENTION : une temprature trop leve ou un temps dexposition trop long la chaleur
entranent le dcollement de la membrane de la lame de verre. En effet, pour faciliter la
lecture la membrane doit rester colle sur la lame de verre.
Aprs complte transparisation, laisser refroidir les membranes sur leur plaques de
verre avant la lecture.

3. 6. Lecture :

Pour la lecture des membranes ainsi prpares, utiliser un densitomtre SCANION


et lire en lumire verte 525 nm.

IMPORTANT :

Aprs chaque utilisation essuyer parfaitement le pont ainsi que le


couvercle de la chambre.
Le tampon qui a servi la migration peut tre rutilis condition de
bien remlanger le tampon aprs chaque utilisation. Pour ce, verser le
tampon contenu dans la chambre dans un rcipient propre et sec,
lagiter et le reverser dans la chambre. Bien refermer la chambre avec
son couvercle pour viter une ventuelle vaporation ou une pollution
par la poussire ambiante.
Cette opration ne peut seffectuer que 4 5 fois maximum.

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4. TECHNIQUE OPRATOIRE POUR LIPOPROTINES

4. 1. Prparation du tampon

1. Ajouter le contenu dun petit flacon Additif pour tampon 1000 mL de tampon
SIMACEL N et agiter jusqu complte dissolution.
Conserver 2-8C

4. 2. Prparation de la chambre pour lectrophorse.

1. Assurez-vous que la chambre est bien dconnecte du gnrateur.


2. Verser 400 mL de tampon SIMACEL N dans un compartiment de la chambre.
3. Uniformiser le niveau du tampon dans la chambre, en linclinant de faon crer
une communication entre les deux compartiments. Bien essuyer la partie haute de
la sparation pour viter les effets lectriques indsirables.

4. 3. Prparation des membranes

1. Verser 100 mL de tampon SIMACEL N dans une cuvette.


2. Codifier les membranes avec un stylo bille.
3. Les immerger compltement dans le tampon et les laisser 2 3 mN ( 5 10 mN si
elles sont de type humide.)
4. Prendre la SERACARD au format adquat et codifier chaque ligne avec le mme
N que celui dj crit sur les membranes.
5. Extraire de la cuvette une membrane et la mettre entre 2 feuilles de papier buvard,
passer plusieurs fois avec le dessus de la main pour liminer le tampon en excs.
Procder de la mme faon pour les membranes suivantes en utilisant chaque fois
des feuilles de papier buvard neuves.
6. Positionner la membrane sur le pont en faisant concider les perforations avec les
supports du pont adapts, commencer par la partie mobile puis la fixe de faon
avoir une bonne tension.
7. Positionner le pont dans la chambre en veillant bien ce que les extrmits des
membranes soient immerges dans le tampon et touchent les appuis situs dans le
fond de chaque compartiment.

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4. 4. Application de lchantillon Excution de llectrophorse :

1. Prendre la SERACARD prcdemment prpare.


2. Prlever avec une micro pipette variable la quantit de srum ( 10 14 L )
indique sur la feuille de garantie prsente dans chaque confection de
SERACARD, et la dposer dans la cellule codifie pralablement.
3. Choisir lapplicateur appropri, sassurer quil soit propre et sec.
4. Effectuer un premier prlvement avec lapplicateur en lappliquant dlicatement en
position bien verticale sur la cellule de la SERACARD contenant le srum choisi.

ATTENTION : Avant de commencer effectuer les dpts, tenir compte que ceux-ci
seffectuent toujours du cot de la cuve signal par le signe moins (cathode).

5. Faire un premier dpt dessai sur la SERACARD en dehors des cellules ou sur un
morceau de papier buvard.
6. Effectuer un second prlvement du mme srum et le dposer sur la membrane,
en positionnant lapplicateur dans les cannelures du pont et en laccompagnant
doucement jusqu' son contact avec la membrane.
7. Laisser lapplicateur en contact avec la membrane environ 10 secondes. ( si lon
utilise des membranes de type humides, effectuer 2 dpts successifs ).
8. Procder de la mme manire pour toutes les autres membranes.
9. A la fin de lopration, ter lapplicateur et fermer la chambre avec son couvercle.
10. Connecter la chambre au gnrateur de courant.
11. Le temps de migration : est denviron 35 40 minutes pour les mthodes MICRO
et, de 40 45 minutes pour les mthodes SEMIMICRO.
12. Le voltage : est de 200 Vdc.

4.5. Coloration

1. Environ 10 minutes avant la fin du temps de la migration, prparer une cuvette


avec 160 mL de NOIR SOUDAN B + 40ML de SOLUTION ALCALINE, agiter
doucement.
2. Le temps de migration termin, dconnecter la cuve du gnrateur, ter le
couvercle en faisant bien attention que les gouttes de condensation qui se sont
ventuellement formes sous celui-ci ne tombent pas sur les membranes.
3. Oter le pont de la chambre, en le tenant en position horizontale.
4. Oter les membranes du pont et, en les coupant le long des cots perfors, les
laisser tomber dans le bain de coloration.
5. Les laisser immerges dans le bain de coloration de 2 4 heures en les agitant de
temps en temps. Un temps plus long, ci cela est possible, est conseill.

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4. 6. Dcoloration :

Sortir les membranes du bain de coloration et les rincer leau courante en les
lissant bien avec les doigts pour liminer les rsidus de colorant prcipits.

4. 7. Lecture :

1. Pour la lecture des membranes ainsi prpares, utiliser un densitomtre SCANION


et lire en lumire rouge 630 nm ou la lumire blanche quand les membranes
sont encore compltement mouilles, les positionner sur une lame de verre.
2. Les membranes peuvent tre conserves quelques temps en les immergeant dans
un peu deau distille jusqu leur lecture

IMPORTANT :

Aprs chaque utilisation essuyer parfaitement le pont ainsi que le


couvercle de la chambre.
Jeter le bain de coloration aprs chaque utilisation. Ne jamais le
rutiliser.
Le tampon qui a servi la migration peut tre rutilis condition de
bien remlanger le tampon aprs chaque utilisation. Pour ce, verser le
tampon contenu dans la chambre dans un rcipient propre et sec,
lagiter et le reverser dans la chambre. Bien refermer la chambre avec
son couvercle pour viter une ventuelle vaporation ou une pollution
par la poussire ambiante.
Cette opration ne peut seffectuer que 4 5 fois maximum.

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5. TECHNIQUE OPRATOIRE POUR HMOGLOBINE

5. 1. Prparation de lhmolysat.
HMOLYSE effectue avec de lEAU DISTILLE (Mthode Quantitative).

1. Centrifuger environ 10 mn 3000/3500 t/mn, 3 4 mL de sang prlev sur


hparine ou citrate.
2. liminer compltement le plasma.
3. Prlever 1 mL de globules rouges et y ajouter 2,5 mL deau distille.
4. Agiter nergiquement pendant 5 mn.

HMOLYSE effectue avec du Tolune (Mthode quantitative)

1. Centrifuger environ 10 mn 3000/3500 t/mn, 3 4 mL de sang prlev sur


hparine ou citrate.
2. liminer compltement le plasma.
3. Mettre en suspension les globules rouges dans 4 5 mL de solution physiologique.
4. Centrifuger environ 10 mn 3000/3500 tmn et liminer le surnageant.
5. Rpter les phases 3 et 4 deux fois.
6. Prlever 1 mL de globules rouges et ajouter 2mL deau distille et 0,5 mL de
tolune.
7. Agiter energiquement pendant 5 mn.
8. Centrifuger 4000/4500 tmn pendant 10 mn.
9. Eliminer la couche suprieure de tolune et, ventuellement des globules rouges.
10. Filtrer avec du papier filtre et, si ncessaire, conserver 2-8C 48 heures
maximum.

5. 2. Prparation des chantillons.

Prparer lhmolysat par la mthode avec le tolune. Effectuer le dosage de la


concentration totale de lhmoglobine dans lhmolysat. Diluer ventuellement avec
de leau distille les chantillons qui seraient trop concentrs jusqu' obtenir une
concentration de lhmoglobine denviron 10 gr/100mg.

5. 3. Prparation de la chambre pour electrophorse

1. Assurez-vous que la chambre est bien dconnecte du gnrateur.


2. Verser 400 mL de tampon SIMACEL HB dans un compartiment de la chambre.
3. Uniformiser le niveau du tampon dans la chambre, en linclinant de faon crer
une communication entre les deux compartiments. Bien essuyer la partie haute de
la sparation pour viter les effets lectriques indsirables.

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Electrophorse : Techniques manuelles.

5. 4. Prparation des membranes

1. Verser 100 mL de tampon SIMACEL HB dans une cuvette.


2. Codifier les membranes avec un stylo bille.
3. Les immerger compltement dans le tampon et les laisser 2 3 mN ( 5 10 mN si
elles sont de type humide).
4. Prendre la SERACARD au format adquat et codifier chaque ligne avec le mme
N que celui dj crit sur les membranes.
5. Extraire de la cuvette une membrane et la mettre entre 2 feuilles de papier buvard,
passer plusieurs fois avec le dessus de la main pour liminer le tampon en excs.
Procder de la mme faon pour les membranes suivantes en utilisant chaque fois
des feuilles de papier buvard neuves.
6. Positionner la membrane sur le pont en faisant concider les perforations avec les
supports du pont adapts, commencer par la partie mobile puis la fixe de faon
avoir une bonne tension.
7. Positionner le pont dans la chambre en veillant bien ce que les extrmits des
membranes soient immerges dans le tampon et touchent les appuis situs dans le
fond de chaque compartiment.

5. 5. Application de lchantillon, excution de llectrophorse.

1. Prendre la SERACARD prcdemment prpare.


2. Prlever avec une micro pipette variable la quantit de srum ( 10 14 L )
indique sur la feuille de garantie prsente dans chaque confection de
SERACARD, et la dposer dans la cellule codifie pralablement.
3. Choisir lapplicateur appropri, sassurer quil soit propre et sec.
4. Effectuer un premier prlvement avec lapplicateur en lappliquant dlicatement en
position bien verticale sur la cellule de la SERACARD contenant le srum choisi.

ATTENTION : Avant de commencer effectuer les dpts, tenir compte que ceux-ci
seffectuent toujours du cot de la cuve signal par le signe moins (cathode).

5. Faire un premier dpt dessai sur la SERACARD en dehors des cellules ou sur un
morceau de papier buvard.
6. Effectuer un second prlvement du mme srum et le dposer sur la membrane,
en positionnant lapplicateur dans les cannelures du pont et en laccompagnant
doucement jusqu' son contact avec la membrane.
7. Laisser lapplicateur en contact avec la membrane environ 10 secondes. ( si lon
utilise des membranes de type humides, effectuer 2 dpts successifs ).
8. Procder de la mme manire pour toutes les autres membranes.
9. A la fin de lopration, ter lapplicateur et fermer la chambre avec son couvercle.
10. Connecter la chambre au gnrateur de courant.
11. Le temps de migration : est denviron 30 35 minutes pour les mthodes MICRO
et, de 35 40 minutes pour les mthodes SEMIMICRO.
12. Le voltage : est de 300 Vdc.

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Electrophorse : Techniques manuelles.

5. 6. Coloration

1. Pendant la migration, prparer une cuvette avec 100 mL de colorant Rouge


ponceau S.
2. Le temps de migration termin, dconnecter la cuve du gnrateur, ter le
couvercle en faisant bien attention que les gouttes de condensation qui se sont
ventuellement formes sous celui-ci ne tombent pas sur les membranes.
3. Oter le pont de la chambre, en le tenant en position horizontale.
4. Oter les membranes du pont et, en les coupant le long des cots perfors, les
laisser tomber dans le bain de coloration.
5. Les laisser immerges au moins 10 minutes en les agitant de temps en temps.

ATTENTION ; le bain de coloration doit tre chang toutes les 10 oprations.

5. 7. Dcoloration et transparisation.

1. Pendant la coloration, prparer une cuvette avec 100 mL de solution


de dcoloration transparisation .
2. Sortir les membranes du bain de coloration et les immerger compltement dans ce
nouveau bain. Agiter lgrement et changer la solution lorsque celle-ci prend la
mme couleur que celle du fond de la bande, et ce jusqu obtenir un fond de
membrane compltement blanc. ( env. 4 5 oprations, 5 minutes )
3. Sortir de ce bain les membranes dcolores et, lune aprs lautre les dposer sur
une lame de verre propre et sche. A laide dune autre lame de verre, en utilisant
le bord de celle-ci et la tenant inclin, par glissement sur la membrane avec une
lgre pression liminer lexcs de liquide et les bulles dair.
4. Disposer les membranes ainsi prpares sous une lampe I. R. ou mieux dans une
tuve sec ( poupinel), env.5 10 minutes 120 160C.

ATTENTION : une temprature trop leve ou un temps dexposition trop long la chaleur
entranent le dcollement de la membrane de la lame de verre. En effet, pour faciliter la
lecture la membrane doit rester colle sur la lame de verre.
Aprs complte transparisation, laisser refroidir les membranes sur leurs plaques de verre
avant la lecture.

5. 8. Lecture

Pour la lecture des membranes ainsi prpares, utiliser un densitomtre SCANION


et lire en lumire verte 525 nm.

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Electrophorse : Techniques manuelles.

IMPORTANT :

Aprs chaque utilisation essuyer parfaitement le pont ainsi que le


couvercle de la chambre.
Jeter le bain de coloration aprs chaque utilisation. Ne jamais le
rutiliser.
Le tampon qui a servi la migration peut tre rutilis condition de
bien remlanger le tampon aprs chaque utilisation. Pour ce, verser le
tampon contenu dans la chambre dans un rcipient propre et sec,
lagiter et le reverser dans la chambre. Bien refermer la chambre avec
son couvercle pour viter une ventuelle vaporation ou une pollution
par la poussire ambiante.
Cette opration ne peut seffectuer que 4 5 fois maximum.

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