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•Oggi si preferiscono usare saggi tipo EIA, ELISA e RIA, basati sulla reazione
antigene-anticorpo.
Alternativa IgA, che offrono il vantaggio di non ricomparire nel siero durante le
reinfezioni.
AA BB CC
Differenziazione tra
Virus dell’influenza (A, B, C)
(con l’emaglutinina)
e
i virus erpetici (D)
(senza l’emaglutinina)
Indagine sierologica:
Saggio di inbizione dell’emoagglutinazione
Opportune diluizioni di siero vengono fatte reagire con una quantità nota di virus.
Incubazione 1h 37°C, reazione antigene-anticorpo. Aggiunti eritrociti a
concentrazioni definite. Presenza di anticorpo: non agglutinazione, assenza di
anticorpo:emoagglutinazione.
Il titolo emoagglutinante è anch’esso proporzionale alla
concentrazione di virioni nel campione in esame.
Detection of astrocyte
marker antigens
Microscopia a piccolo ingrandimento
Normal and poliovirus-infected monkey kidney cells in culture (cells neither fixed nor stained; *150).
A: Monolayer of normal unstained monkey kidney cell in culture. B: Unstained monkey kidney cell
culture showing early stage of cytopathic effect typical of poliovirus infection. Approximately 25% of
the cytopathic effect (especially rounding) indicative of virus multiplication (1+ cytopathic effect
score). C: Unstained monkey kidney culture illustrating more advancedcytopathic effect (3+ to 4+
cytopathic effect). Almost 100% of the cells are affected, and most of the cell sheet has come loose
from the wall of the culture tube. (From ref. 207, with permission.)
In situ hybridization detection of the location of viral nucleic acids in infected cells.
Monkey cells infected with HSV-1 were fixed in formaldehyde, permeabilized in acetone,
and incubated with biotin-labeled HSV DNA. The cultures were heated to denature the
cellular DNA and the probe, and the culture and solution were allowed to cool. The cells
were then reacted with mouse anti-ICP4 monoclonal antibody followed by rhodamine-
conjugated goat antimouse immunoglobulin antibody and fluorescein-conjugated avidin.
A: Rhodamine fluorescence showing the location of the HSV trans-activator protein
ICP4. B: Fluorescein fluorescence showing the location of HSV DNA in the infected
cells. Micrograph courtesy of S. Rice.
Altered localization of viral proteins in cells infected with recombinant SV5 expressing an HN protein with a
truncated cytoplasmic tail. In wild-type recombinant SV5 (rSV5)-infected cells, HN was found in highly localized
patches on the cell surface, and it is likely that these patches are the sites of budding virus. In contrast, in cells
infected with rSV5 HNd2–9, a recombinant SV5 lacking residues two to nine of the HN cytoplasmic tail, a striking
redistribution of the HN staining pattern was observed, with HN being distributed all across the cell surface.
Concomitant with the altered HN staining pattern in cells infected with rSV5 HNd2–9, a redistribution of the M
protein straining pattern was observed. The similarity of HN and M staining patterns suggests that targeting of M
protein into presumptive budding sites at the cell surface depends on the presence
Electron micrographs of virions and infected cells. A: Purified St. Louis encephalitis (SLE) virus negatively stained with
ammonium molybdate (472). Surface projections appear as a very thin, indistinct layer. (Courtesy of Dr. Frederick A.
Murphy.)B: Thin section of a BHK-21 cell at 48 hours after infection showing SLE virions in the cisternae of the
endoplasmic reticulum (765). (Courtesy of Frederick A. Murphy, Sylvia G. Whitfield, and A. K. Harrison.) C: Para-
crystalline array of SLE virus in a Culex pipiens mosquito salivary gland cell 25 days after blood-meal-feeding on an
infected suckling mouse. (Courtesy of Sylvia G. Whitfield, Frederick A. Murphy, and W. Daniel Sudia.) D: Classical
swine fever virus (CSFV) virions negatively stained with uranyl acetate. (Courtesy of Dr. Frank Weiland.)E: Ultrathin
section of STE cells infected with CSFV and immunostained with Erns-specific monoclonal antibody (MAb) 24/16 and
colloidal gold. Bar = 100 nm. (From ref. 746, with permission.) F: Thin section showing virus-like particles (arrows) in
HPBALL cells harvested 14 days after infection with
HCV (632). Particles measured approximately 50 nm in diameter. (Courtesy of Dr. Yokho Shimizu.)
Electron micrograph of vesicular stomatitis virus (VSV), negatively stained with
phosphotungstic acid. Disrupted virions show the helical nucleocapsid core. The
surface of intact virions shows protruding glycoprotein spikes.
Electron micrographs of representative virion particles.
Figure 7-9 Electron microscope visualization of nuclear inclusion areas. The filled
triangles denote the electron-translucent nuclear inclusion area in a human HEp-2 cell
infected with HSV-1. The filled arrows indicate full capsids, and the unfilled arrows
indicate empty capsids. The unfilled triangles indicate host chromatin compressed to
the periphery of the nucleus, apparently by the nuclear inclusion. Micrograph courtesy
of D. Furlong and B. Roizman.
Electron microscope visualization of cytoplasmic “factories” in a cell infected
with reovirus. Micrograph courtesy
Microscopia elettronica
dNTPs
Primers
DNA polimerasi
DNA
PCR
3) Analizzare su un transilluminatore
amplificazione
PCR: Analisi del prodotto di amplificazione
M C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
200 bp
Informazioni importanti !!!
• L'uso della PCR nella routine richiede una cura particolare nell'evitare
contaminazioni da amplificati di DNA, attraverso l'adozione di pratiche
laboratoristiche rigorose.
• L’approccio migliore all’uso della PCR nella routine è quello di adottare pratiche di
laboratorio adeguate: separazione rigorosa dei reagenti pre e post amplificazione;
linee guida specifiche per il campione manipolato; il personale laboratoristico
dovrebbe essere costantemente cosciente delle fonti di contaminazione possibili:
- carryover da campione a campione
- contaminazione inavvertita dei campioni durante l’aliquotazione e la
distribuzione
- presenza di sequenze bersaglio clonate nei laboratori che hanno isolato e
caratterizzato le stesse sequenze che ricercano.
PCR
- Falsi positivi
- Analisi qualitativa
Nuove prospettive
PCR real-time
- Analisi quantitativa
Una PCR quantitativa permette di determinare in un campione la
quantità di DNA presente per unità di volume.
PCR real-time
Primers
Sonde
fluorescenti
DNA
PCR real-time
on line l’andamento
della reazione di
amplificazione
PCR real-time: Vantaggi
Semplicità di automazione
Flessibilità
Rapidità di esecuzione
Elevata riproducibilità
Analisi quantitativa
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)
Utilizzando 3 enzimi (RNA polimerasi T7, RT, RNASi H) e 2
primer specifici si consente l’amplificazione sia di RNA sia di DNA
in maniera esponenziale.
Si basa sullo schema di trasferimento dell’informazione genica
caratteristico del meccanismo di replicazione dei genomi dei
retrovirus: da RNA a DNA e, di nuovo, RNA.
Si usa contemporaneamente la miscela di enzimi che funzioneranno
a temperatura costante per ottenere la replicazione dell’acido
nucleico.
Due oligo, uno (A) funziona come
molecola ibrida con due distinti
domini e funzioni: la prima è
complementare alla sequenza target,
mentre la seconda contiene un
promotore per una RNA polimerasi.
I enzima RT che sintetizza DNA a
partire dall’RNA. Ibrido RNA_DNA.
II enzima RNAsi-H degrada RNA e
quindi il secondo oligo (B) si lega al
DNA ed inizia la sintesi del cDNA.
III enzima T7 RNA polimerasi (DNA
dipendente) trascrive il doppio
filamento di DNA partendo dal
promotore presente sul primo”ibrido”
primer .
Rilascio genoma
Microwell
Preamplifiers*
Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes
Microwell
Amplifiers *
Preamplifiers*
Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes
Microwell
Amplifiers * with
hybridized
Label Probes*
Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes
Microwell
Amplifiers * with
hybridized
Label Probes*
Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes
Microwell