Biemann2002.PDF - En.id

Empat Dasawarsa Penentuan Struktur oleh Mass
Spectrometry: Dari Alkaloid ke Heparin

Klaus Biemann Departemen Kimia, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA
Awal (tahun 1950-an dan 1960-an) penggunaan spektrometri massa dalam kimia produk alami dan evolusi untuk signifikansi
hadir dalam biokimia diceritakan. Metodologi ini memungkinkan penentuan lancar dan cepat dari struktur dari sejumlah alkaloid
indol, seperti sarpagine, quebrachamine, dan dua kelompok terisolasi dari akar Aspidosperma quebracho blanco. Pada saat yang
sama, strategi pertama untuk urutan peptida kecil dengan spektrometri massa ditunjukkan. Perlahan-lahan maju, selama dua
dekade, untuk alternatif penting dari mana-mana otomatis degradasi Edman. kemajuan lebih lanjut dalam metodologi dan
instrumentasi didirikan spektrometri massa sebagai alat yang sangat diperlukan hari ini untuk karakterisasi protein dalam
biokimia dan biologi. Sebuah konsep baru ionisasi senyawa yang sangat asam sebagai kompleks terprotonasi dengan peptida
dasar, yang memungkinkan penentuan akurat dari berat molekul mantan, metode yang sangat sensitif untuk sequencing fragmen
heparin dan glikosaminoglikan sulfat terkait dikembangkan baru-baru ini. (J Am Soc Mass Spectrom 2002, 13, 1254-1272)
2002 American Society untuk Mass Spectrometry
saya
n upaya struktur 1950 di organik dan sebagian kimia kimia penuh semangat produk dikejar alami prihatin penelitian studi dan
Penjelasan mekanisme rinci reaksi kimia. Keduanya dipupuk oleh perkembangan sebelum, selama, dan setelah Perang Dunia II.
Pada saat itu rancangan obat rasional masih sebuah konsep yang relatif tidak dikenal. Sebaliknya, pencarian untuk farmakologi
dan medis produk tanaman yang berguna pada seluruh dunia, espe- secara resmi di daerah tropis. Banyak dari mereka alkaloid,
karena mereka dapat paling mudah diisolasi dengan asam encer dari ekstrak tanaman lain yang kompleks.
Suatu keberhasilan awal itu alkaloid diisolasi pada tahun 1932 dari akar Rauwolfia serpentina dan bernama pinus reser- [1].
Strukturnya tidak ditentukan sampai 12 tahun kemudian [2]. Reserpin adalah salah satu obat antihipertensi pertama dan menjadi
sukses finansial yang besar untuk CIBA (Basel, Swiss) pada awal tahun 1950-an. ratories penelitian labo- di industri farmasi dan
akademisi berlomba untuk menduplikasi prestasi dan rak mulai mengisi dengan alkaloid, yang memiliki nama dan titik leleh, tapi
sayangnya, sebagian besar tidak memiliki aktivitas cological Pharma berguna.
Penentuan struktur molekul kompleks (aronatic-alisiklik, sekitar 20 atom karbon, dua nitrogen dan beberapa oksigen) adalah
membosankan, waktu dan materi memakan. Pada saat itu (1950-an) itu Star Excursion Balance Test sekutu diperlukan degradasi
atau konversi ke com- dikenal
pon dan membangun identitas mereka menggunakan analisis unsur (pembakaran) dan campuran titik leleh [titik leleh
campuran dua senyawa yang identik sama dengan yang dari masing-masing komponen, sementara itu tertekan jika dua senyawa
yang berbeda dari titik lebur yang sama campuran], standar emas dari waktu. Pemahaman mekanisme reaksi in vitro telah
menyebabkan perumusan cara path- biosintesis in vivo, yang dibantu dalam postulation dari membangun struktur struc- yang
kemudian bisa dibuktikan dengan cara konvensional. spektrum ultraviolet yang digunakan secara rutin untuk mendeteksi
chromophores, pola substitusi khususnya aromatik dan spektrum inframerah datang perlahan-lahan mulai digunakan.
alkaloid
Keadaan yang menyebabkan saya untuk memilih spectro- massa Metry-bidang pada waktu itu mapan dalam fisika, industri
minyak bumi, dan kimia kemudian analitis, tetapi hampir tidak dikenal di kalangan organik ahli kimia-sebagai daerah penelitian
saya telah dijelaskan sebelumnya [3] . Pada tahun 1957, ketika saya membuat transisi dari seorang ahli kimia organik sintetis
untuk instruktur (pada hari-hari anak tangga bawah penguasaan-track di MIT) di kimia analitik, saya telah mempertimbangkan
penentuan struktur sarpagine, sebuah indole-alkaloid juga terisolasi dari R. serpentina.
Namun, sebelum aku bisa merancang strategi yang tepat, tiga kelompok penelitian independen menyarankan [untuk
membatasi
Diterbitkan online September 17, 2002 permintaan Alamat cetak ulang Dr. K. Biemann, Departemen Kimia, MIT, Cambridge,
MA 02.139-4.307, USA. E-mail: kbiemann@mit.edu
jumlah referensi yang tercantum dalam makalah sejarah ini, pembaca yang tertarik disebut rincian lebih lanjut dikutip pada
mereka dikutip di sini] Struktur 1. aromatik
2002 American Society for Mass Spectrometry. Diterbitkan oleh Elsevier Science Inc Diterima April 22, 2002 1.044-0.305 /
02 / $ 20,00 Revisi 1 Juli 2002 PII S1044-0305 (02) 00.441-5 Diterima 1 Juli 2002
1
255 J Am Soc Mass Spectrom 2002, 13, 1254-1272 EMPAT DEKADE STRUKTUR PENENTUAN
Gambar 1. Mass spektrum 3 dari sarpagine, 2 dari ajmaline, dan dari ibogaine (4) dan ibogamine (5) (direproduksi dari Referensi
[6], hak cipta 1960, dengan izin dari Elsevier Science).
Bagian didukung oleh UV-spektroskopi, tapi sistem alisiklik itu terutama didasarkan pada pertimbangan biogenetis. Salah satu
[4] kertas berjanji untuk memberikan bukti akhir dari struktur dengan konversi sarpagine ke 2, yang dapat dibuat dari loid alka-
lain, ajmaline, struktur diketahui [5]. Tidak ada laporan seperti muncul, mungkin karena konversi 1 sampai 2 akan cukup
membosankan, membutuhkan penghapusan aromatik dan hidroksil alifatik, pengenalan gugus metil di indole-nitrogen, dan
pengurangan ikatan ganda. Produk ini harus dimurnikan untuk titik leleh konstan, diikuti oleh bukti tity iDEN- dengan 2 oleh
titik leleh campuran.
Itu terjadi kepada saya bahwa korelasi ini dapat dicapai jauh lebih mudah dan membutuhkan jauh lebih sedikit bahan dengan
perbandingan spektrum massa dua senyawa analog, tetapi tidak harus sama. Daripada menghapus kelompok hidroksil aromatik,
yang sangat sulit, itu hanya alkohol; gugus hidroksil alifatik telah dihapus oleh tosylation dan pengurangan, dan ikatan ganda
katalitik dihidrogenasi untuk menghasilkan 3. Untungnya, perbandingan Senyawa 2 lebih mudah didapat: Ini diperlukan hanya
sebuah perjalanan singkat menyusuri Sungai ke Profesor Robert B. kayu- laboratorium bangsal di Harvard di mana ia duduk di
rak, yang tersisa dari karya sebelumnya [5].
Spektrum massa dari 2 dan 3 (Gambar 1) menunjukkan pola yang sangat mirip, bergeser tentu saja, dalam nilai-nilai m / z
puncak karena substituen yang berbeda pada sistem aromatik (methoxyl terhadap metil 16). Dengan demikian, apa sebuah
kelompok riset Swiss yang cukup besar tidak bisa melakukan dalam beberapa tahun, dicapai [6] dalam beberapa minggu dengan
menggunakan spektrometri massa dan beberapa miligram sarpagine baik yang disediakan oleh Dr. A. Hofman.
Perlu dicatat bahwa spektrum ini diperoleh dengan ionisasi elektron. Berbeda dengan banyak digunakan lunak ionisasi hari
ini (CI, FAB, ESI, dan MALDI) ini keras ionisasi menghasilkan kation radikal molekul kelebihan energi tinggi yang fragmen
luas dan sangat reproducibly.
Karena bukti ini struktur adalah novel dan UN precedented, itu harus menunjukkan bahwa isomer lain dari kerangka karbon
yang berbeda pameran trum massa spec- yang berbeda yang, bagaimanapun, khusus untuk jenis itu. Fortu- nately, Dr William I.
Taylor (CIBA, Summit, NJ) memiliki pasangan seperti di tangan: Ibogaine (4) dan ibogamine (5), struktur yang telah ditentukan
sesaat sebelum dengan cara konvensional [7]. Spektrum massa tersebut
1256
BIEMANN J Am Soc Mass Spectrom 2002, 13, 1254-1272
dua alkaloid (Gambar 1) memang menunjukkan pola yang identik (dengan pergeseran dari 30 u, CH
3
O vesus H), yang, bagaimanapun, sangat berbeda dari yang ditunjukkan oleh 2 dan 3. Memiliki demikian menunjukkan validitas
konsep baru, yang kemudian dikenal sebagai teknik pergeseran trometric massa spec-, itu menarik untuk melihat untuk contoh
lain, sebaiknya alkaloid indol, yang struktur telah diusulkan tetapi bukti akhir sulit dengan metode konvensional. Salah satu kasus
seperti itu quebrachamine terisolasi lama [8] dari Aspidosperma quebracho blanco. Hal itu diketahui mengandung sistem indole-
tersubstitusi pada cincin nya benzena dan nitrogen, dan gugus amino tersier. Namun, tidak ada fungsi yang dapat memberikan
situs yang cocok untuk degradasi selektif. Semakin drastis seng debu dis tillation, prosedur lain di dada alat kimiawan organik
klasik, menyebabkan campuran kompleks indoles alkil dan pyridines alkil [9]. Mereka te diously dimurnikan dengan kristalisasi
sebagai pikrat dan iDEN- tified oleh analisis unsur, titik leleh, dan titik leleh campuran ketika sampel otentik yang tersedia.
Sebagai salah satu contoh awal dari spektrum proton-NMR digunakan dalam bidang ini, kehadiran indole stituted unsub-
dikuatkan, tapi kelompok N-metil sebelumnya nyarankan- gested dapat dikesampingkan [10]. Kurangnya resolusi dan data
pergeseran kimia yang luas pada saat itu tidak memungkinkan Bubarnya sistem alisiklik. Atas dasar semua data agak kurus ini,
Witkop et al. menyarankan struktur 6a atau b untuk quebrachamine [11].
Oleh karena itu, kami mengulangi distilasi Zn-debu quebrachamine pada skala yang sangat kecil (13 mg). Spektrum massa
dari fraksi piridin, setelah pemisahan pada kolom GC dikemas dan koleksi masing-masing puncak, kembali vealed yang paling
berlimpah produk jauh adalah 3-ethylpyridine, sementara 3-metil-5-ethylpyridine, yang telah mendukung Struktur 6b adalah
komponen yang sangat kecil. Bisa juga muncul dengan penataan ulang termal dari 6a selama kondisi yang keras dari percobaan.
Struktur ini berkaitan erat dengan aspidospermine, alkaloid utama Aspidosperma quebracho blanco. Its struktur (7a) baru saja
ditentukan oleh x-ray kristalografi [12]. Itu cukup jelas bahwa pembelahan ikatan di 7b (desacetylaspidospermine) akan
menghasilkan 9, saya-a
analog thoxy dari 6a memungkinkan korelasi dari dua struktur dengan teknik spektrometri pergeseran massa.
Konversi ini mudah dicapai dengan dogenation dehidrogenase dari 6b ke indolenine 8 yang dapat dikurangi dengan natrium
borohidrida untuk cincin dibuka bentuk 9 [13]. Spektrum massa (Gambar 2) dari quebrachamine dan 9 jelas dipamerkan pola
yang sama, mengingat identitas fragmen yang mewakili sistem alisiklik dan pergeseran oleh 30 u untuk yang aromatik.
Kelimpahan relatif dari fragmen-fragmen akan telah diubah secara signifikan untuk 6b isomer kurang bercabang.
Karya yang dijelaskan di atas dihasilkan tidak hanya analog bervariasi dalam substituen aromatik ( substituen label) tetapi
juga isotop pelabelan dengan menggunakan deuterasi katalitik, LiAlD
4
dan NaBH
4
. spektrum massa mereka memungkinkan untuk menggambarkan cara fragmentasi path-
ini ion molekul radikal agak rumit [13-15, 18].
Ketika pekerjaan ini dipresentasikan pada ference IUPAC Con- pada Produk Natural diselenggarakan di Melbourne, tralia
Aus-, di Agustus 1960 itu menciptakan banyak perhatian di antara para pemimpin bidang ini dan menempatkan spektrometri
massa pada peta kimia organik. Memang, setelah kuliah, Profesor Carl Djerassi datang untuk mengundang saya untuk Stanford
University untuk membantu dengan pemasangan spektrometer massa di laboratorium dan untuk melatih Postdoc (yang ternyata
Herbert Budzikiewicz) dalam operasi dan interpretasi dari spektrum. Dia menceritakan kesannya 32 tahun kemudian: . . . Itu
rasionalisasi elegan dengan Biemann et al. dari perilaku fragmentasi spektral massa alkaloid dari
1
Gambar 2. Mass spektrum (a) quebrachamine dan (b) analog metoksi berasal dari laspidospermine desacety- (direproduksi
dengan izin dari Referensi [13], hak cipta 1962, American Chemical Society).
kelas aspidospermine yang merangsang upaya serius di Stanford pada aplikasi kimia organik dari trometry massa spec-.[16].
Penjelasan bahwa fragmentasi yang (Skema 1) dari desacetylaspidospermine (7b), yang mengarah ke spektrum massa yang
ditunjukkan pada Gambar 3, mendorong kami untuk mencari alkaloid lainnya yang dihasilkan oleh Aspidosperma quebracho
blanco. Setelah suntikan ekstrak kulit tanaman ini [karena permintaan oleh laboratorium pencarian ulang farmasi pada waktu itu,
bahan tanaman tropis dapat diperoleh secara komersial (dalam hal ini dari SP Penick dan Co)] ke dalam kolom GC dikemas
diadakan di 265 C, kromatogram (Gambar 4) diperoleh, yang
tampak mengerikan dengan standar saat ini, tetapi pada waktu itu hebat. Fraksi dikumpulkan secara individual oleh Stick ing titik
leleh kapiler selama keluar dari kolom dan pendinginan dengan sepotong es kering. kapiler itu kemudian ditempatkan ke dalam
sistem inlet dipanaskan dari spektrometer massa 21-103C CEC. spektra mengungkapkan adanya sedikitnya 17 alkaloid yang
berbeda. Dilihat dari berat molekul mudah discerened, sebagian besar dari mereka baru. Itu jelas dari spektrum bahwa ada dua
jenis kerangka karbon hadir. Satu (Grup A), diakui oleh sinyal yang kuat pada m / z 124, yang ditanggapi corre- dengan jenis
aspidospemine (lihat Gambar 3), tapi yang lain (kelompok B), didominasi oleh puncak pada m / z 136 harus merupakan jenis
struktur yang berbeda.
Ketika porsi yang lebih besar dari ekstrak dipisahkan pada kolom alumina menggunakan kromatografi gravitasi, bahan murni
yang cukup diperoleh untuk merekam baik spektrum massa individu,. Berdasarkan massa dan UV analisa spektrum itu mungkin
untuk menetapkan struktur untuk semua komponen milik kelas aspidospermine (Grup A, Gambar 5). Dari apa yang telah
dipelajari tentang spektrum beberapa alkaloid indol dan menggunakan pergeseran massa dari berbagai komponen (Gambar 6),
adalah mungkin untuk menetapkan Struktur 10 alkaloid 266B (Skema 2) dan lima congener nya (Gambar 7). Posisi substituen
pada cincin benzena dari bagian indole lagi-lagi disimpulkan dari data UV. Cukup beberapa komponen yang cukup berlimpah
mengkristal sehingga titik lebur mereka juga bisa ditentukan. Nilai untuk 338B (157-9 C) dibandingkan dengan baik dengan
162 C dari zat terisolasi 80 tahun sebelumnya [8] dari tanaman yang sama dan diberi nama aspidospermatine. Identitas dua
senyawa selanjutnya dikuatkan oleh analisis unsur dan rotasi optik, satu-satunya data lain kembali porting oleh Hesse yang
ditugaskan itu rumus molekul C
22
H
28
N
2
HAI
2
, Yaitu, CH
2
terlalu banyak. Di masa lalu itu praktek umum untuk melaporkan produk alami yang baru
ditemukan setelah mencirikan mereka dengan komposisi unsur mereka (ditentukan oleh com-
1258
Gambar 3. Spektrum Massa desacetylaspidospermine (7b). (Direproduksi dengan izin dari Referensi [18], hak cipta 1963,
American Chemical Society.
bustion) dan titik leleh. Sebuah nama ditugaskan, umumnya didasarkan pada bagian dari nama botani dari tanaman dari mana
produk telah diisolasi. Karena kita menentukan struktur senyawa baru setelah isolasi mereka, kita tidak perlu untuk menciptakan
nama sepele untuk masing-masing dari mereka tetapi hanya karakter-ized mereka pertama dengan berat molekul mereka dan
jenis struktural. Setelah struktur individu ditentukan, kita bisa menurunkan suatu terminologi kimia berdasarkan nama
aspidospermine sejarah dan aspidospermatine dan menggunakan -idi- insert umum untuk analog tersubstitusi.
Ketika mengirimkan kertas penuh untuk publikasi di JACS, kami berlari ke dalam masalah dengan Asisten Editor, AL Autrey,
yang mengatakan dalam sebuah surat tanggal 9 Oktober, 1962: . . . Yang lebih penting adalah kebutuhan untuk menunjukkan
kegunaan dibatasi pekerjaan dalam bentuk yang sekarang. . . sampel Anda telah menerapkan itu [spektrometri massa] untuk
terbuka untuk pertanyaan untuk homogenitas mereka. Anda telah mendeteksi 20 senyawa, tapi kita mempertanyakan bahwa
Anda
skema 1
telah terisolasi 16 dari mereka. Tidak ada demonstrasi, selain dengan kromatografi gas, kemurnian mereka. Tak satu pun dari
kriteria yang biasa kemurnian telah diterapkan, tidak ada telah ditandai dengan cara klasik: Tidak ada titik leleh, ada
[pembakaran] analisis, beberapa UV dan tidak ada spektrum IR. . . . Hal ini sangat mungkin bahwa dalam kimia produk alam di
masa depan akan mengambil giliran pekerjaan Anda telah mengindikasikan, dan bahwa penyidik akan mendapatkan rial mate-,
nama mereka, dan menyimpulkan struktur mereka tanpa karakteristik mereka dengan cara yang diterima saat ini. Bagaimana-
pernah, sampai ini lebih umum, indikasi yang jelas dari tingkat keberangkatan Anda dari metode terakhir adalah iden-.
Dalam pembelaan pengikutnya dari status quo Dr. Autrey
Gambar 5. Struktur alkaloid milik kelompok A (aspido- jenis spermine).
1
Gambar 4. Gaschromatogram dari ekstrak dari kulit Aspidosperma quebracho blanco. garis miring braket koleksi fraksi. nomor
kode menunjukkan berat badan molecolar dan patterntype (repro- teknya dengan izin dari Referensi [18], hak cipta 1963,
American Chemical Society).
rupanya juga mengabaikan fakta bahwa kami telah menentukan titik leleh senyawa baru yang lebih berlimpah, yang mengkristal,
dan bahkan dibakar beberapa miligram 338B untuk membandingkan ysis anal- unsur dengan data Hesse ini dari 1882. Butuh
waktu tiga halaman bantahan dan salinan buku saya [17], yang baru saja muncul, untuk mendapatkan kertas akhirnya diterbitkan
[18]. Mengampuni tunately, produk alami ahli kimia cepat diterima dan diadopsi kami keberangkatan dari metode masa lalu.
Kebutuhan untuk membangun komposisi unsur dengan analisis pembakaran, yang diperlukan beberapa miligram, lebih dari
yang dibutuhkan untuk spektrum massa dan non-destruktif Data spektral lainnya (UV, IR, dan kemudian NMR) segera
dihilangkan dengan munculnya massa resolusi tinggi spektrometri. Terinspirasi oleh penggunaan J. Beynon tentang metode
puncak matching [19] untuk massa akurat Measures surements dengan ganda-fokus spektrometer Nier-Johnson massa (MS-8,
yang menjadi komersial MS-9 dari AEI), kami mencatat menyelesaikan spektra resolusi tinggi di piring fotografi terkena dalam
instrumen Mattauch- Herzog [17]. Kemampuan untuk menyimpulkan komposisi unsur tidak hanya dari molekul utuh, tetapi juga
dari masing-masing fragmen dalam percobaan tunggal sangat memfasilitasi penentuan struktur sejak saat itu.
Contoh dimana data resolusi tinggi menjadi penting adalah penentuan struktur Vin blastine, sebuah dimer alkaloid aktivitas
oncolytic. Ini telah didirikan sebelumnya bahwa itu terdiri dari dua alkaloid indol, Velbanamine dan vindoline, tetapi konektivitas
mereka tidak diketahui. Karena ukuran molekul ini, analisis unsur tidak meyakinkan, tapi massa yang tepat dari 810.4219 (rekor
dunia pada saat itu) mendirikan komposisi C
46
H
58
N
4
HAI
9
[20]. Komposisi dari sejumlah fragmen kunci memungkinkan
1260
Gambar 6. Massa spektrum alkaloid tipe B (direproduksi dengan izin dari Referensi [18], hak cipta 1963, American Chemical
Society).
penentuan struktur lengkap Vinblastine (11) serta bahwa dari vincristine terkait (12) [21].
Karya ini berlanjut sampai akhir tahun 1960-an ketika kita di kelompok MIT dan Djerassi di Stanford, serta yang lain, telah
membentuk struktur dekat dengan hun- alkaloid dred [22], sebagian atau seluruhnya dengan menggunakan spektrometri massa
dengan cara pertama menunjukkan hanya satu dekade sebelumnya [6]. Sekarang rak yang telanjang dan pencarian produk alami
baru dari kategori yang telah mereda, terutama karena tidak satupun dari mereka telah menjadi obat blok-buster. Pengecualian
kecil adalah vinblastine, untuk beberapa waktu obat yang paling berguna untuk jenis relatif jarang dari leukemia, penyakit
Hodgkin.
Gambar 7. Struktur alkaloid milik kelompok B (aspido- jenis spermatine).
1
Gambar 8. Konsolidasi Elektrodinamika Corp Model 21- 103C massa spektrometer. Kiri: Inlet kabinet sistem (di laboratorium
penulis, bagian atas itu tertutup dan heatable untuk 250 C); pusat: 3-Coil elektromagnet, tabung penerbangan di tengah, sistem
pompa utama bertempat di bawah ini; kanan: Operator konsol (perhatikan pintu bulat di kiri atas untuk pengambilan kertas
rekaman fotografi).
skema 2
Instrumentasi awal
Dalam terang hari ini kompak, mikroprosesor con- dikendalikan spektrometer massa menggabungkan sistem data yang canggih
dan perangkat pengambilan sampel kadang-kadang bahkan robot, mungkin pendidikan, setidaknya menghibur, untuk melihat
kembali hampir setengah abad. Banyak dari apa yang dijelaskan secara singkat sebagai berikut diuraikan secara rinci dalam
Referensi [17].
The Mass Spectrometer

Pada saat itu saya berencana untuk menggunakan spektrometri massa untuk penentuan struktur produk alami, pilihan instrumen
yang tersedia secara komersial itu prac- tically terbatas pada satu pun: The Konsolidasi elektroforesis trodynamics Corporation
(CEC) Model 21-103C (Gambar 8). Ini adalah karena dominasinya di industri minyak bumi dan paten perlindungan, yang terus
fledg- ling British AEI (Asosiasi Listrik Industri, sekarang dibagi menjadi Kratos dan Micromass, Manchester, UK) MS-2 dan
Jerman ATLAS Werke (sekarang Finnigan MAT, laki-laki Bre-, Jerman) CH-4 dari Amerika Serikat. Sebuah titik penjualan
lanjut adalah (API) koleksi American Petroleum Institute yang dari spektrum massa, terutama dari bons hidrokarbon dan
senyawa organik monofungsional sederhana, sebagian besar yang telah direkam pada instrumen dari seri 21-103. Dominasi
kuantitatif,
Memperoleh spektrum massa sangat berbeda dari proses sangat otomatis hari ini. sampel harus menguap ke dalam sistem inlet
semua kaca diadakan sampai dengan 200 C. Cukup sampel (0,1-1 mg) dibutuhkan untuk menghasilkan 10 2 mm tekanan Hg di
reservoir dari yang bocor melalui kebocoran molekul multi-hole (CEC ini mendominasi paten!) Ke sumber ion. Bahwa
jumlah besar diperlukan sehingga tekanan relatif konstan selama ca. yang 20 menit. diperlukan untuk merekam spektrum.
Scanning adalah dengan mengurangi tegangan percepatan dari 3 kV ke 300 V pada medan magnet konstan, karena itu lebih
mudah dan lebih direproduksi dari pemindaian yang terakhir. Hukuman adalah terbatas (01:10) Kisaran massa, dan satu sehingga
harus merekam spektrum dalam dua bagian (misalnya, m / z 10-100 dan berkata, 50-500) di dua pengaturan medan magnet yang
berbeda. Setiap scan waktu sekitar 5-10 menit., Dibatasi oleh perangkat rekaman, galvanometer 5-cermin yang dibelokkan sinar
ke gulungan kertas fotografi. Pada akhir scan, kertas harus diambil menggunakan lengan sutra hitam, dibawa ke kamar gelap,
dikembangkan, tetap, dan dikeringkan. Sebuah pemeriksaan cepat dari rekor lama 1-2 m menunjukkan apakah spektrum adalah
yang baik dan sampel dapat dipompa keluar dari sistem inlet. Sementara pengolahan basah dari rekor itu cumber- beberapa, itu
memiliki keuntungan menghasilkan catatan permanen dengan jejak hitam-putih. Dalam hal itu, kertas self-mengembangkan UV-
sensitif yang mulai digunakan agak kemudian adalah regresi karena jejak itu kontras rendah dan memudar dengan cepat di siang
hari. Upaya untuk menggunakan mesin fotokopi berbalik catatan benar-benar hitam. Sementara ada penanda massa (dipicu
oleh medan listrik), yang menempatkan sebuah titik di bagian bawah catatan untuk setiap 10 unit massa, itu tidak cukup handal
untuk menetapkan skala massal. Oleh karena itu, salah satu harus mengenali puncak selalu hadir pada m / z 18, 28, 32, dan 44,
karena kebocoran udara tidak dapat dihindari, dan kemudian secara manual menghitung dari sana. Rentang dinamis tinggi dari
instrumen membuat ini cukup mudah, karena lima vanometers gal- memiliki rasio defleksi 1: 3: 10: 30: 100, pro masi berbagai
lebih baik dari 1: 100.000 dari skala penuh pada setidaknya jejak sensitif. Setelah skala massal didirikan pada scan massa rendah,
ujung bawah scan tinggi-massa harus cocok dan menghitung terus sampai akhir massa atas (Gambar 9). Sebuah pos pemeriksaan
yang baik selalu pola karakteristik dari isotop merkuri pada m / z 196-204 (manfaat gratis pro- vided oleh sisa back-streaming
dari pompa sion Hg-diffu- digunakan). 000 dari skala penuh pada jejak paling sensitif. Setelah skala massal didirikan pada scan
massa rendah, ujung bawah scan tinggi-massa harus cocok dan menghitung terus sampai akhir massa atas (Gambar 9). Sebuah
pos pemeriksaan yang baik selalu pola karakteristik dari isotop merkuri pada m / z 196-204 (manfaat gratis pro- vided oleh sisa
back-streaming dari pompa sion Hg-diffu- digunakan). 000 dari skala penuh pada jejak paling sensitif. Setelah skala massal
didirikan pada scan massa rendah, ujung bawah scan tinggi-massa harus cocok dan menghitung terus sampai akhir massa atas
(Gambar 9). Sebuah pos pemeriksaan yang baik selalu pola karakteristik dari isotop merkuri pada m / z 196-204 (manfaat gratis
pro- vided oleh sisa back-streaming dari pompa sion Hg-diffu- digunakan).
Setelah menetapkan nilai m / z masing-masing puncak, tingginya harus diukur dengan penggaris dan dikonversi ke nilai
mutlak oleh perkalian dengan faktor yang sepatutnya. Tak perlu dikatakan bahwa butuh beberapa waktu dan usaha sampai satu
bisa menarik jenis bar-grafik saat ini langsung diberikan oleh sistem data strument in ini. Tediousness dari proses ini memiliki,
bagaimanapun, dua keuntungan besar: Pertama, yakin bahwa hanya sedikit tapi signifikan spektrum massa dicatat; dan kedua,
bahwa penyidik memiliki banyak waktu untuk berpikir tentang setiap spektrum, dan apa yang mungkin berarti. Saya pribadi
melakukan hampir semua pemikiran dan awal interpretasi saya selama ini tugas ing sebaliknya bor-.
Persyaratan untuk mencapai tekanan sampel dari sekitar 10 2 mm Hg di reservoir sampel relatif besar didikte oleh
penggunaan spektrometer massa untuk
1262
analisis kuantitatif campuran hidrokarbon dalam industri perminyakan. Prosedur itu, bagaimanapun, boros sejauh jumlah yang
diperlukan sampel prihatin, dan terbatas metodologi untuk senyawa yang dapat menguap pada 250 C untuk mencapai tekanan
tersebut tanpa dekomposisi. Untuk tujuan kita reproduksibilitas yang tepat dari intensitas relatif tidak penting dan oleh karena itu
kami mencoba untuk menghindari seluruh sistem inlet oleh menguapkan sampel langsung ke sumber ion, yang diperlukan hanya
uap Pres- yakin 10 6 mm Hg dan dipertahankan hanya dalam volume kecil dari perumahan sumber ion.
percobaan pendahuluan dilakukan dengan Bendix (TOF) spektrometer massa waktu-of-penerbangan. Itu dilengkapi dengan
probe pirolisis terdiri dari filamen dikan-dipanaskan resis- yang bisa ditempatkan di bawah sumber ion relatif terbuka melalui
kunci vakum. Dengan mengganti filamen yang dengan koil pemanas memegang sepotong pendek titik leleh kapiler yang berisi
sampel dekat dengan sinar pengion elektron, kami mampu memperoleh spektrum massa utuh, nukleosida underivatized dan asam
amino [23]. Karena resolusi rior infe- dari spektrometer TOF, kita kemudian con- structed mirip probe pengenalan langsung
untuk 21-103C CEC dan akhirnya untuk spektrometer massa resolusi tinggi secara singkat berikut ini.
Seperti disebutkan di atas pada bagian alkaloid indol dimer, penentuan tion composi- unsur dari molekul utuh dan semua
fragmen daripadanya melalui pengukuran massa tepat menjadi alat tant impor- di awal tahun 1960-an. Kami memilih model CEC
21-110, karena didasarkan pada geometri Mat- Tauch-Herzog, yang memungkinkan untuk taneous simul- fokus dari seluruh
spektrum. Dengan menempatkan 340 50 mm pelat fotografi ke bidang fokus, orang bisa merekam spektrum resolusi tinggi
lengkap selama waktu pemaparan kurang dari satu menit. Dengan
Gambar 9. Bagian dari rekaman osilograf di massa yang tinggi. Kebanyakan jejak sensitif di atas, paling tidak sensitif di bagian
bawah.
1 mm Slot tinggi dalam topeng depan bidang fokus, orang bisa menumpuk hingga 30 spektrum ke satu piring sebelum harus
diganti melalui kunci vakum (Gambar 10). Pengolahan sejumlah besar data yang diwakili oleh masing-masing paparan
diperlukan sejumlah langkah: Measur- ing posisi yang tepat dari masing-masing seringkali lebih dari seratus garis sempit di
sepanjang piring dengan menggunakan densitometer mikro (juga disebut pembanding); konversi posisi untuk massa,
berdasarkan posisi baris dari perfluorokerosene selalu ditambahkan sebagai standar massa internal; dan perhitungan dari semua
kemungkinan posisi com- unsur yang akan cocok dalam batas yang ditentukan (misalnya, 0,003 u). Prinsip-prinsip ini dikenal
dari percikan-sumber spektrometri massa, digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif dari logam, paduan dll Dalam
aplikasi tersebut hanya beberapa baris yang hadir dan bahkan lebih sedikit perlu diukur, yang dapat dengan mudah dicapai secara
manual. Dalam kasus kami, tangan KASIH ukur yang dan perhitungan cukup untuk memberikan nuansa untuk akurasi yang
dicapai, tetapi tidak untuk penggunaan umum.
komputer
Untungnya, MIT mulai membuat pusat komputer-nya IBM 709 yang tersedia untuk penelitian di KASIH departemen-departemen
lain, selama yang disediakan program FORTRAN untuk tugas dan data yang akan diproses, semuanya menekan ke kartu IBM.
Hasil bisa dijemput keesokan harinya, dicetak pada rim kertas serta menekan pada kartu untuk digunakan lebih lanjut. Meninju
jarak diukur ke kartu tanpa kesalahan segera menjadi terlalu membosankan dan kami mulai untuk mengotomatisasi seluruh
proses. Sebuah kecepatan motor variabel menggantikan
Gambar 10. Penulis (berdiri kiri) membahas piring fotografi dengan Walter McMurray dan Peter Bommer (duduk) di depan panel
operator CEC 21-110 spektrometer massa resolusi tinggi (foto ca. 1982/1983).
1
engkol tangan dari komparator, posisi encoder numerik dipasang pada sekrup presisi dan satu lagi pada output photomultiplier.
Kedua sinyal yang dimasukkan ke dalam pukulan kartu dioperasikan dalam modus kontinyu. Untuk menghindari merekam data
tidak berguna (95%) dari baseline antara garis dari satu massa nominal ke depan, operator melambat kecepatan scanning ketika
garis (atau multiplet garis) mendekati dan menekan sebuah tombol untuk mengaktifkan pukulan kartu . Itu adalah bagian dari
algoritma pengolahan data untuk menemukan-abad ter (s) dari garis (s) dari profil direkam.
Sistem ini bekerja dengan baik untuk sementara waktu, namun jumlah kotak kartu IBM yang harus dipindahkan bolak-balik
terus meningkat dan pusat komputer MIT mulai membebankan biaya pengguna yang lebih tinggi. Ketika, pada tahun 1964, NIH
meminta saya (ya, pada waktu itu mereka kadang-kadang diminta) untuk mengajukan permohonan salah satu National Research
Facility hibah yang baru dibuat (sekarang NCRR) untuk membuat resolusi tinggi spektrometri massa tersedia untuk nity tual
biomedis, dan juga untuk hibah pelatihan di daerah yang sama, kesempatan itu datang untuk mengatur sistem komputer saya
sendiri. Sekali lagi, pilihan itu sangat terbatas: Satu-satunya sistem kemudian di pasar dan mampu merekam data kontinu on the
fly adalah IBM 1800. Tujuan aslinya adalah untuk melayani sebagai monitor proses untuk tanaman industri. Untuk
memasukkannya ke dalam perspektif dengan prosesor data MS hari ini, yang selain juga mengontrol banyak operasi spektrometer
massa dan tersembunyi dalam kabinet instrumen, 1800 berdiri sekitar 6 kaki tinggi. The central processing unit (CPU) yang
dioperasikan dengan memori inti dari 32.767 kata 16-bit, dari data yang dapat dibuang di salah satu dari tiga disk magnetik
(12.000 kata masing-masing) bertempat di kabinet tingkat sepa- (Gambar 11). Dengan demikian, total ruang untuk bekerja
dengan adalah 135.534 byte, kurang dari sepersepuluh kapasitas salah satu dari 3 1/2 inci floppy disk hari ini! penyimpanan akhir
adalah pada tape digital. Seluruh sistem ini pertama kali disewa untuk $ 50k per tahun, dibeli untuk $ 250k dua tahun kemudian,
ketika kegunaannya telah didirikan. 767 kata-kata 16-bit, dari data yang dapat dibuang di salah satu dari tiga disk magnetik
ketika kegunaannya telah didirikan. 767 kata-kata 16-bit, dari data yang dapat dibuang di salah satu dari tiga disk magnetik
ketika kegunaannya telah didirikan.
Interfacing baru, pembanding yang dirancang khusus (D. Mann, Burlington, MA) dengan IBM 1800 sistem mengurus semua
data yang dihasilkan oleh spektrometer massa resolusi tinggi, yang kita memiliki dua oleh 1965. Hal ini juga memberikan kita
dengan kesempatan untuk mengembangkan metodologi untuk mengeksplorasi dan memanfaatkan sejumlah besar informasi yang
dihasilkan dengan terus memindai spektrometer massa resolusi rendah, terutama ketika antar dihadapkan dengan kromatografi
gas (GCMS) (lihat bagian berikutnya). Kami sudah mulai pekerjaan ini dengan mencatat data pada kaset analog dan digital, tapi
instalasi dari IBM 1800 memungkinkan untuk mencapai hal ini untuk pertama kalinya on-line. Proses ini dimulai dengan
digitalisasi output multiplier elektron dari komputer-con dikendalikan, terus memindai (3 s / memindai, m / z 40-600)
spektrometer massa Hitachi RMU-6D, mendefinisikan semua pusat puncak, menugaskan / nilai z m dan menyimpan semua
spektrum massa yang dihasilkan pada disk. Untuk diproses lebih lanjut konsep lainnya, terutama massa kromatogram, auto
dikawinkan identifikasi oleh pencarian perpustakaan, dll yang
dikembangkan [24]. Untuk memudahkan pemeriksaan dan tafsiran dari seluruh kumpulan data off-line ( multi-tasking dari
CPU itu tidak mungkin pada waktu itu) setiap data set GCMS (semua spektrum dan semua kromatogram massa) itu auto
matically dimasukkan pada gulungan mikrofilm dengan menggunakan 16 mm kamera film Bolex terfokus pada layar CRT, yang
secara otomatis ditampilkan satu spektrum dan satu kromatogram massa demi satu. penyidik kemudian bisa melihat data santai di
salah satu dari pembaca film yang kami punya di sekitar laboratorium kami.
Sementara sistem ini tidak pernah diduplikasi di tempat lain, produsen alat mulai menggabungkan konsep ke dalam produk
mereka sebagai teknologi komputer cepat maju. Ukuran dan biaya prosesor menurun sementara memori, kecepatan dan kapasitas
penyimpanan meningkat hampir secara eksponensial. Dalam retrospeksi, uang NIH tangan-somely membayar dividen untuk
kepentingan masyarakat biomed- ical (dan kimia).
Kromatografi gas
Pada pertengahan tahun 1950-an Profesor ERH Jones, University of Manchester, UK, menghabiskan musim panas di MIT dan,
hampir tidak sengaja, memberitahu kami tentang kegunaan chro- gas matography, yang baru saja ditemukan oleh James dan
Martin [25]. Sebagai suatu metode analisis, itu tidak segera menarik perhatian ahli kimia organik, tetapi contoh Profesor Jones'
dari penggunaannya dalam laboratorium sintesis organik dari Imperial Chemical Industries (ICI) di Inggris membuat kami sadar
akan bersifat signifikan unik ini metodologi. Sebagai akibatnya, toko mesin kami memutar keluar bagian yang diperlukan
sehingga setiap laboratorium bisa disatukan persiapannya tive GC sendiri cocok tidak hanya untuk analisis kuantitatif
campuran reaksi, tetapi juga untuk isolasi komponen mereka.
Dibandingkan dengan gas chromatographs hari ini, traption con- sangat sederhana, salah satu mungkin mengatakan primitif:
Ini digunakan tabung gelas berbentuk U dikemas dengan batu bata tahan api ditumbuk halus (kolom kapiler diciptakan jauh
kemudian) dilapisi dengan Apiezon (a umum tersedia dimurnikan kunci pipa minyak ). Helium (sekitar 30 mL / menit) melewati
pertama atas thermistor, maka melalui kolom dan lagi lebih thermistor lain untuk keluar. Kedua
1264
adalah bagian dari rangkaian jembatan Wheatstone dan perbedaan saat ini (mewakili perbedaan ther- mal konduktivitas dari
campuran gas) yang ditampilkan pada perekam strip-chart, satu-satunya bagian yang mahal dari alat itu. Kolom disimpan pada
suhu konstan (mudah dilaksanakan, dibandingkan dengan pemrograman suhu yang digunakan jauh kemudian).
kolom dikemas diperlukan, tetapi juga bisa mengakomodir date, besar (miligram) sampel, keuntungan bagi ahli kimia
organik. suhu konstan berarti bahwa komponen volatil dielusi cepat di awal dan yang kurang stabil turun sebagai puncak luas
(lihat Gambar 4). Tapi, jika perlu, campuran bisa disuntikkan pada dua temperatur kolom yang berbeda untuk mengoptimalkan
resolusi. Yang paling penting, detektor adalah non-destruktif, yaitu, limbah bisa dikumpulkan dan digunakan untuk eksperimen
lebih lanjut (rekor spektrum massa atau data lainnya) atau re-disuntikkan untuk resolusi yang lebih baik.
Mengumpulkan fraksi itu membosankan dan kita, serta yang lain, pikir untuk mengatasi langkah oleh interfacing port keluar
dari kromatografi gas langsung ke sumber ion dari spektrometer massa. Masalah ini akhirnya diselesaikan dengan cara yang
praktis secara bersamaan oleh Ragnar Ryhage [26] dan di laboratorium kami [27]. Mantan digunakan prinsip difusi, sebuah
lubang jet di depan sebuah aperture (model setelah proses sebelumnya digunakan untuk pemisahan isotop uranium sebagai
wahana hexafluo- mereka), sementara kami menggunakan efusi lebih cepat dari molekul kecil (helium) lebih molekul besar
melalui dinding tabung kaca fritted. Karena Ryhage separator telah dipatenkan, itu hanya bisa dibeli bersama dengan seluruh
sistem LKB GCMS, sedangkan Watson-Biemann pemisah (tidak dipatenkan) yang bebas digunakan oleh produsen alat lain
dan dengan- keluar royalti. Ini pemisah gas pembawa yang diperlukan karena tingkat aliran tinggi yang diperlukan oleh kolom
dikemas dan kapasitas pemompaan terbatas pompa difusi merkuri dari eters spectrom- massa sebelumnya. Mereka menjadi usang
dengan munculnya kolom kapiler, penggunaan komersial yang tertunda di Amerika Serikat (dibandingkan dengan Eropa) dengan
paten yang dipegang oleh Perkin Elmer Corp difusi minyak Efisien pompa juga bisa dengan mudah menangani laju aliran gas
yang lebih rendah dari kolom ini.
Peptida dan Protein

Butuh waktu sedikit lebih lama untuk meyakinkan ahli biokimia dan biologi dari kegunaan spektrometri massa al- meskipun
kertas pertama saya diterbitkan di bidang ini pada tahun 1959 diuraikan strategi untuk penentuan urutan asam amino dari peptida
kecil [28]. ogies Methodol- untuk peptida sequencing masih berada di badan-infan- mereka. pelabelan N-terminal fred Sanger
dari eptides di- dan perjalanan-dengan kelompok dinitrofenil, diikuti oleh jumlah hidrolisis dan identifikasi unla- label dan belled
asam amino (s) dengan kromatografi kertas, memungkinkan dia untuk membangun struktur pertama protein , insulin pada tahun
1953 [29]. Pada waktu yang sama Pehr Edman mulai
Gambar 11. The IBM 1800 komputer. Kiri: The CPU kabinet; tepi lampu memberitahu operator (di sini Ed Ruiz) status
pengolahan. Kanan: Kabinet memegang tiga disk.
mengembangkan degradasi bertahap protein dari mereka N-terminus [30].
Aku telah merencanakan untuk mengembangkan pendekatan kimia untuk pelabelan C-terminus peptida kecil, untuk
komplemen metode ment Sanger, tapi seperti diuraikan sebelumnya [3] sekali meninggalkan gagasan bahwa dalam mendukung
spektrometri massa. Saya real- ized bahwa peptida harus cocok untuk metodologi ini karena mereka mewakili molekul linear dari
unit berulang backbone diganti dengan seperangkat terbatas rantai samping, yang semuanya berbeda dalam massa dengan
pengecualian dari pasangan leusin isomerik dan isoleusin, dan glutamin isobarik dan lisin. The cle obsta- utama adalah, tentu
saja, involatility mengucapkan molekul rionic zwitte- ini, yang mencegah penguapan mereka sangat diperlukan untuk ionisasi
elektron. Di sini sekali lagi, pelatihan dalam kimia organik datang berguna, karena saya tahu bahwa ini bisa diatasi dengan asilasi
dari gugus amino (s) dan esterifikasi gugus karboksil (s). Lebih jauh, kelompok amido kutub dapat dikonversi ke amina sekunder
jauh lebih sedikit polar (langkah pertama dari Skema
1
Gambar 12. Spektrum massa dari produk pengurangan N-asetil-isoleucyl-Alanyl-proline metil ester (dari Referensi [31], hak
cipta 1960, Elsevier Science [USA], direproduksi dengan izin).
skema 3
3). Reaksi ini juga menyebabkan rantai samping yang dimodifikasi glutamin dan lisin berbeda dalam massa. Penggunaan lithium
aluminium deuteride bukan hidrida dihindari rantai samping asam aspartat untuk menjadi identik dalam massa dengan yang
treonin. Seperti yang saya punya predict- ed-atau setidaknya berharap-spektrum massa ucts-produk, alkohol etil-
oligoethylenediamino yang mantan-tremely sederhana karena pembelahan spesifik mereka di. . . NHTMCHR ... obligasi,
sehingga fragmen spesifik urutan (Gambar 12).
Itu jelas dari awal bahwa metode ing sequenc- layak harus berlaku untuk campuran peptida kompleks yang dihasilkan dari
bahan kimia atau degradasi enzimatik dari protein yang struktur akan ditentukan. kromatografi gas tampaknya menjadi metode
pilihan. Dibandingkan dengan kromatografi kertas, itu unggul menyelesaikan daya dan kapasitas loading, tetapi membuatnya
bahkan lebih penting untuk menggunakan derivatif yang bisa menguap pada tekanan atmosfer, tidak hanya di vakum dari
spektrometer massa. Percobaan awal telah menunjukkan [31] bahwa quences se- lima peptida dapat ditentukan dengan
spektrometri massa setelah konversi dari campuran untuk amino alkohol, pemisahan dengan GC, dan koleksi komponen yang
diganti karena mereka dielusi (mirip dengan kami studi alkaloid yang dijelaskan di atas) (Gambar 13).
Pengembangan metode spektrometri massa untuk peptida dan protein kimia telah dicatat secara lebih rinci di tempat lain [32].
Butuh waktu lebih dari 15 tahun dari percobaan asli sampai sekuensing pertama dari protein kecil, subunit I (panjang 44 asam
amino) dari monellin, dicapai dengan spektrometri massa [33]. Untuk pekerjaan itu, protein yang harus dikenakan hidrolisis asam
parsial untuk menghasilkan campuran kompleks banyak di- tumpang tindih untuk hexapeptides. Pada saat itu kami telah terus
ditingkatkan metodologi melalui penggantian asetilasi dengan trifluoroacetylation
[34] (langkah kedua dari Skema 3) dan O-trimethylsilylation [35] untuk meningkatkan volatilitas, yang diperpanjang penerapan
untuk peptida yang lebih besar. kopling langsung dari kromatografi gas dengan spektrometer massa [27] memungkinkan untuk
mengidentifikasi 61 peptida dalam hidrolisat dari monellin-I dalam percobaan tunggal.
Selama tahun 1960-an bertahap degradasi Edman telah dasarnya otomatis dan telah menjadi andalan sequencing protein.
Kekurangan utama, ketidakmampuan untuk bekerja pada diblokir asam amino N-terminal, yang disediakan ceruk untuk
spektrometri massa yang pada peptida kecil individu tidak bisa hanya menyimpulkan urut mereka, tetapi juga mengidentifikasi
kelompok blocking. Pasca translationally dimodifikasi asam amino yang tidak setuju dengan prosedur Edman, seperti -carboxy-
asam glutamat, dapat diidentifikasi oleh Metry spectro- massa. Osteocalcin, protein pengikatan kalsium yang kaya dalam
komponen ini, dengan demikian bisa berhasil diurutkan oleh GCMS [36].
Selanjutnya, membentang dari asam amino hidrofobik, terutama ke arah C-terminus, menyebabkan kerugian tinggi dari bahan
dari bejana reaksi dari Edman appara- tus karena mencuci-out. Ini telah menjadi salah satu kesulitan dalam Edman urutan
monellin [37], yang memiliki urutan C-terminal sangat hidrofobik -Gly-Pro-Val-Pro-Pro-Pro.
Ekstrim hidrofobik juga istic karakter-umum protein trans-membran seperti dopsin bacteriorho-, urutan asam amino yang
hanya bisa ditentukan dengan benar oleh simbiosis Edman degra- dation dan GCMS [38a, 38b]. Protein ini, yang ternyata
menjadi 248 asam amino panjang, sangat tahan terhadap pembelahan enzimatik karena tdk dpt dalam air. Dalam suspensi berair
itu perlahan-lahan diserang di sebuah ikatan tunggal oleh kimotripsin, memproduksi dua peptida besar, C-1 dan C-2. Ini pada
gilirannya hanya bisa dilarutkan dalam 70% asam format, media di mana cyanogen bromide (CNBr) memotong di metionin,
yang diubah menjadi homoserine dalam proses. C-2, yang berisi lima methionine mengakibatkan enam peptida, CNBr-1 melalui
CNBr-5a dan b. Sekitar dua-pertiga dari urutan CNBr-1 untuk CNBr-4 dapat ditentukan oleh auto yang dikawinkan degradasi
Edman, tapi washout berlebihan pra cluded mencapai C-termini. CNBr-5a dan b yang terlalu pendek untuk metode ini.
Gambar 13. Gas kromatogram dari produk pengurangan campuran lima peptida (dari Referensi [31], hak cipta 1960, Elsevier
Science [USA], direproduksi dengan izin).
1266
Percobaan GCMS dilakukan secara paralel tidak hanya dikonfirmasi data Edman (Gambar 14), tetapi juga memberikan
informasi yang diperlukan untuk merakit urutan lengkap C-2: (1) Menetapkan urutan C-terminal yang hilang; (2) urut peptida
pendek CNBr-5a dan b; (3) mengidentifikasi diblokir N-terminus dari CNBr-2 itu; dan (4), yang paling penting, memungkinkan
keselarasan dari enam peptida untuk urutan tunggal. Untuk ini, asam amino yang berdekatan dengan masing-masing lima
methionine dari C-2 harus ditentukan. Hal ini dilakukan dengan hidrolisis asam parsial dari C-2, convert- ing campuran kompleks
peptida ke O-TMS derivatif poliaminokarboksilat alkohol dan menyuntikkan ke dalam GCMS. Seluruh set 250 scan kemudian
mencari ion khusus untuk urutan A-Met. . . (Di mana A adalah setiap asam amino), urutan minimum untuk peptida
mendefinisikan tumpang tindih. Menggunakan prinsip bertepatan kromatogram massa [24], spektrum massa dari semua turunan
thionine mengandung saya- dapat diekstraksi dari massa data dan urutan mereka ditentukan [38a]. Strategi yang sama kemudian
berhasil diterapkan pada lebih besar C-1, sehingga menyelesaikan struktur dopsin bacteriorho- [38b].
Pada tahun 1980 itu telah menjadi mungkin untuk urutan coding gen untuk protein. Namun, membaca dari gel masih
dilanda dengan kesalahan. Kombinasi dengan pendekatan yang berbeda digunakan secara bersamaan tampaknya menjadi strategi
yang paling efisien. Karena sensitivitas tinggi, metodologi GCMS kami untuk peptida se quencing digunakan untuk membantu
dalam penentuan urutan asam amino dari protein yang sangat besar (beberapa dekat dengan asam amino 1000 panjang), seperti
aminoasil-tRNA sintetase [39]. Dengan mencocokkan, sekuens asam amino pendek acak diperoleh dengan GCMS terus menerus
untuk data DNA mereka diperoleh, itu langsung mungkin untuk melihat apakah kedua yang benar. Sebuah nukleotida yang
hilang atau keliru dimasukkan menyebabkan frame shift, yang kemudian diterjemahkan ke dalam quence asam amino fiktif se-
yang tidak akan muncul dalam data GCMS dihasilkan dari produk gen yang nyata, protein. Bahwa
Gambar 14. amino acid dari cyanogen bromide pasang pep- dari C-2 dari bacteriorhodopsin (CNBr-1 melalui 5a, b spond corre-
ke urutan elusi dari kromatografi cair). Panah menunjukkan data yang Edman, menggarisbawahi menunjukkan urutan ditentukan
oleh GCMS.
Informasi memungkinkan untuk mendeteksi kesalahan dan untuk memperbaikinya.
Selama dua dekade ini sejak publikasi pertama kami [28] ada sedikit laboratorium, selain kita, yang dieksplorasi atau
digunakan spektrometri massa untuk peptida sequencing. Terutama di antara mereka adalah kelompok penelitian Howard Morris
(Imperial College, London), yang digunakan N, O-metilasi N-asetil metil ester dari peptida kecil, yang bisa kasar frac- tionated
langsung ke sumber ion dari spec- massa trometer [40]. Agak kemudian DF Hunt digunakan derivatif yang sama untuk ionisasi
kimia dan spektrometer massa ple triple-quadru- dalam hubungannya dengan kromatografi cair kinerja tinggi untuk urutan
membangun struktur mix- peptida [41]. Semua strategi ini diperlukan keahlian yang akan digunakan pada sensitivitas yang
diperlukan dan dengan demikian dipraktekkan hampir secara eksklusif di laboratorium di mana mereka telah dikembangkan.
Tapi,
Situasi mulai berubah secara dramatis pada awal 1980-an. Almarhum Michael Barber telah menemukan ionisasi relatif besar,
molekul polar dengan pemboman atom cepat (FAB) [42]. Spektrum dari undecapeptide ([Met-Lys] -bradykinin) dari mol. wt.
1318 membuka jalan untuk strategi baru dalam peptida dan protein karakterisasi. Sekarang menjadi mungkin untuk menggunakan
enzim proteolitik kekhususan struktural yang sangat tinggi, yang oleh kebutuhan diproduksi peptida relatif besar. Sementara
metodologi GCMS kami menjadi al- yang langsung usang, kita bisa cepat beradaptasi sumber ion bidang desorpsi MAT kami
731 jenis Mattauch- Herzog resolusi tinggi spektrometer massa untuk FAB dengan memasang senapan argon [43].
Sebagai kimia metode ionisasi FAB dihasilkan ion molekul terprotonasi berlimpah energi internal yang rendah dan
kecenderungan demikian rendah untuk fragmen. Meskipun tidak memberikan banyak informasi urutan, itu memungkinkan
pengukuran yang dapat diandalkan berat molekul semua komponen yang diganti dari campuran peptida relatif besar dengan-
keluar pemisahan sebelum dan pada tingkat nanomol. Jadi FAB-MS dibuat sekarang mungkin untuk memecahkan banyak
masalah dengan cepat, seperti identifikasi protein mutan, deteksi dan koreksi kesalahan di urutan sebelumnya nyarankan- gested,
atau sebaliknya, identifikasi protein urutan yang dikenal (Ulasan di [44]).
Kurangnya informasi urutan, yang disebabkan oleh kecenderungan rendah dari molekul terprotonasi dihasilkan oleh FAB
untuk fragmen, diatasi dengan disosiasi collisionally diinduksi mereka (CID) di empat sektor magnetik atau triple-quadrupole
spektrometer massa tandem. Mantan diizinkan tabrakan energi tinggi memproduksi sim- ple, urutan spesifik fragmentasi [45].
Kami menggunakan pendekatan ini untuk pertama kalinya dalam urutan dari sejumlah glutaredoxins [46] dan thioredoxins [47],
protein sekitar 100-110 asam amino panjang. Dalam perjalanan dari karya ini, algoritma komputer untuk
1
interpretasi energi tinggi CID spektrum peptida (SEQPEP) dikembangkan [48].
teknik ionisasi Novel terus Revolusi-spektrometri massa ize pada umumnya dan protein kimia pada khususnya. John Fenn
telah menunjukkan bahwa expo- yakin tetesan halus dari solusi untuk medan listrik yang tinggi membangkitkan sangat
bermuatan ion dari ecules mol bahkan sangat besar. Tidak banyak perhatian dibayar untuk karyanya sampai ia melaporkan
ionisasi sukses protein utuh pada konferensi 1988 ASMS di San Francisco [49]. Kemudian orang-orang memperhatikan dan
pengukuran berat molekul dengan spektrometri massa menjadi biasa. Salah satu keuntungan utama dari metode ini adalah
kompatibilitas dengan spektrometer massa quadrupole kemudian di mana-mana, karena keadaan biaya tinggi dari molekul
multiprotonated dibuat massal terbatas berkisar tidak masalah. Sebagai analit harus dalam larutan air,
Pada tahun yang sama, Hillenkamp dan Karas dikembangkan matriks dibantu laser yang desorpsi ionisasi (MALDI), juga
mampu pengion protein utuh [50]. Ini bahkan lebih sederhana dan diperlukan material kurang, tapi setidaknya pada waktu itu,
hanya bisa diterapkan pada spektrometer massa waktu-of-penerbangan (TOF). Seperti disebutkan dalam bagian Instrumentasi
atas, instrumen yang flour- nan sebentar di awal 1960-an, tetapi belum mampu bersaing dengan kinerja yang terus membaik dari
spektrometer massa netic Mag- dan quadrupoles yang diikuti.
Kesederhanaan MALDI dan potensinya membuat kami tertarik dalam penerapannya pada penentuan struktur protein.
Hillenkamp dan Karas telah melakukan percobaan mereka dengan memodifikasi alat TOF dirancang untuk laser ionisasi bahan
anorganik. Daripada menduplikasi itu, kami kontrak dengan Vestec Corporation (Houston, TX) untuk membangun sebuah
spektrometer massa MALDI-TOF (mengikuti desain dari Brian Chait di Rockefeller University) lebih cocok untuk peptida dan
protein. Instrumen tersebut disampaikan pada bulan Oktober 1990. Prototipe ini (yang ditunjuk Model 2000) berevolusi, setelah
akuisisi Vestec oleh PerSeptive Biosystems (kemudian oleh Perkin-Elmer yang sekarang Apelera Corp) ke Voyager Elite.
Ketersediaan komersial seperti strument di- kuat dan metodologi pada harga yang wajar en- abled banyak laboratorium lain
untuk memasuki bidang ini penelitian. Pengukuran berat molekul protein, seperti mioglobin, untuk lebih dari 1 Da [51] atau
Bubarnya pola (homogen) dari cosylation gly- di 13 situs di invertase dari ragi [52] hanya beberapa contoh dari pekerjaan kita
sendiri disamping itu banyak orang lain. Pengembangan teknik komputer yang kuat untuk identifikasi urutan protein yang
diketahui atau DNA yang berasal awalnya dipahami oleh Hen- zel et al. di Genentech [53] dan diperluas oleh orang lain beberapa
tahun kemudian adalah sangat penting.
Karena kesederhanaannya, sensitivitas tinggi, dan kemudahan
over-semua operasi MALDI-MS menjadi sine qua non kimia protein. Jumlah besar data yang sangat spesifik dan akurat yang
dapat diproduksi dalam percobaan tunggal, hanya membutuhkan jumlah menit protein (seperti yang hadir di tempat pada gel 2-D)
membuka dimensi baru dalam penelitian biologi. Kebetulan perkembangan ini dengan dua lain-ledakan teknologi komputer yang
memungkinkan penggunaan basis data yang besar pada komputer desktop dan Bubarnya urutan genom manusia -LED ke bidang
baru, proteomik. Sisanya sekarang sejarah. Hal ini tidak bisa dibayangkan lebih dari empat puluh tahun yang lalu, ketika kami
pertama kali menunjukkan kelayakan sekuensing peptida kecil dengan spektrometri massa!
heparin
Untuk meminimalkan ambiguitas ketika menggunakan berat molekul MALDI yang diturunkan dari peptida yang dihasilkan oleh
enzimatik atau pencernaan kimia serta orang-orang dari protein, itu penting untuk membuat pengukuran ini seakurat mungkin.
Dalam upaya untuk mengoptimalkan parameter eksperimental menggunakan serangkaian peptida didefinisikan dengan baik
sebagai standar internal, Peter Juhasz di laboratorium kami satu hari mengambil teroksidasi A-rantai insulin sapi (A
lembu
) Sebagai standar dan sapi insulin sebagai tidak diketahui.
Anehnya, tidak ada sinyal sama sekali pada m / z 2552,7 untuk (MH) ion standar, tapi puncak yang sangat besar pada m / z
8264,9 di samping satu diharapkan pada m / z 5734,5 untuk (MH) ion insulin. Bingung pada awalnya kami segera menyadari
bahwa sinyal pada massa yang tinggi repre- sented kompleks terprotonasi dari dua komponen campuran, (M
AOX
M
ins
H), dihitung 8266,3, yang disebabkan oleh keasaman tinggi dari A
lembu
, Yang berisi empat kelompok asam sulfonat dalam bentuk asam cysteic. Fenomena
pengompleks ini, diamati secara kebetulan, ternyata menjadi agak umum. Ketika sejumlah senyawa yang sangat asam kami
punya di tangan dicampur dengan peptida, mereka juga terionisasi sebagai kompleks terprotonasi. Tak disangka, peptida yang
lebih mendasar bekerja terbaik.
Yang paling sangat asam rial mate- biologis yang signifikan heparin dan terkait sulfat noglycans glycosami- lainnya (GAG),
seperti sulfat heparan, kondroitin, dll Dari awal, upaya gagal untuk memperoleh spektrum massa dari fragmen heparin pendek
kami masih tersisa sampel dari hexasaccharide dengan delapan asam sulfat
1268
kelompok setengah-ester. Campuran equimolar dari 3 pmol daripadanya dengan tetradodecapeptide dari mol. wt. 2942,41 berisi
tujuh arginines dan dua lysines memberikan spektrum MALDI sangat baik (Gambar 15) [54].
Implikasi dari penelitian ini adalah ing sangat excit- karena membuka kemungkinan untuk mengembangkan strategi untuk
penentuan urutan fragmen heparin-dan akhirnya mungkin heparin sendiri -analogous itu kami telah dikembangkan untuk peptida
dan protein sequencing diuraikan dalam bagian sebelumnya. Fakta bahwa tidak ada yang efisien, sensitif, dan cepat metode yang
ada untuk analisis zat-zat yang sangat asam membuat usaha bahkan lebih penting.
Dari sudut pandang prosedural pandang, analogi dengan sequencing protein yang mencolok: (1) Sementara protein adalah
linear polimer dari serangkaian asam -amino, heparin dan congener yang merupakan polimer linear dari disakarida, yang terdiri
dari satu uronic (glukuronat atau iduronic) asam dan satu glukosamin (Struktur 13); (2) sementara ada 20 asam amino
didefinisikan dengan baik umum ditemukan di teins pro, ada 32 modifikasi yang diketahui berbeda dari disakarida berulang 13
(tergantung pada jumlah dan posisi dari kelompok sulfat atau N-asetilasi), mereka semua berbeda dalam massal oleh setidaknya 4
Da [55]; dan (3) seperti protein, yang dapat terdegradasi secara khusus oleh enzim litik proteo- atau reaksi kimia, heparin dapat
Gambar spektrum massa 15. MALDI kompleks dari accharide hexas- ditampilkan dan peptida yang mengandung tujuh arginines
dan dua lysines (direproduksi dari Referensi [54], hak cipta 1994, National Academy of Sciences, USA).
dibelah secara enzimatik dengan heparinases, di obligasi cosidic tertentu gly-; ada juga beberapa reaksi oksidatif yang membagi
karbohidrat backbone di obligasi tertentu. Langkah pertama dalam desain seperti strategi sequencing adalah untuk
mengembangkan prosedur eksperimental untuk penentuan diandalkan berat molekul sejati Heparin fragmen ukuran yang
diharapkan dari reaksi pembelahan seperti enzimatik atau kimiawi. Jelas, penghapusan 02:59 SO
3
kelompok dari OSO
3
H untuk OH (lihat Gambar 15) harus dihindari, karena mensimulasikan kehadiran molekul kurang sulfat. Penyebab be- dari jarak
cukup reguler dari kelompok asam sepanjang disakarida backbone linear diharapkan bahwa kompleks dengan peptida panjang
yang sama dan arginines sama spasi (asam amino yang paling dasar) akan paling stabil dan mungkin sehingga tidak fragmen. Ini
ternyata benar ketika kita mulai menggunakan peptida sintetik yang dirancang dengan baik (Arg-Gly)
n
, Di mana n 10. Ini diperpanjang untuk n 15 ketika ditemukan
1
Gambar 16. MALDI spektrum massa hexasaccharide yang sama seperti pada Gambar 15, tapi kompleks dengan (Arg-Gly)
10
(Direproduksi dari Referensi [56], hak cipta 1960, dengan izin dari Elsevier Science).
dengan massa ditunjukkan Gambar 17. octasaccharide MALDI (untuk rincian spektrum melihat teks).
kompleks (Arg-Gly)
15
yang heparinase Aku mencerna dari
bahwa jumlah kelompok kuat dasar dalam peptida harus melebihi jumlah sulfat dalam perjalanan oligosaccha-. Hasil percobaan
optimasi ini, yang juga termasuk evaluasi dari berbagai matriks dan panjang gelombang, ditunjukkan pada Gambar 16. Seperti
yang diharapkan dari data tersebut, berat molekul senyawa ukuran yang berbeda hadir dalam campuran dapat Measures sured
andal. Ia juga mengamati bahwa sinyal relatif menurun dengan menurunnya jumlah kelompok sulfat. Dengan demikian metode
ini lebih sensitif untuk molekul yang lebih besar, arah yang diinginkan untuk kation appli praktis [56].
Dengan demikian, panggung didirikan untuk mengeksplorasi urutan fragmen heparin dengan belahan dada enzimatik mereka
fol- melenguh oleh identifikasi produk dengan MALDI. Heparinase Saya dipilih karena kekhususan enzim ini dikenal: Ini
istimewa memotong di ikatan glikosidik antara glukosamin sulfat pada gugus amino dan 4-hidroksil dari asam iduronic
bagian sulfat di 2-hidroksil. Ini adalah reaksi eliminasi, meninggalkan dua produk, satu dengan cosamine glu- di mengurangi
end, yang lainnya dengan asam uronic -4,5-dehidro di non-mengurangi akhir.
Sebuah octasaccharide itu dicerna dengan saya heparinase dan aliquot dianalisis pada berbagai titik waktu dengan MALDI
setelah penambahan peptida (Arg-Gly)
15
. Spektrum yang diperoleh setelah hanya 2 menit pencernaan (Gambar 17)
menunjukkan bahwa octasaccharide telah hampir sepenuhnya terdegradasi. The tetrasaccharide 5-8 yang dapat dibentuk dari
octasaccharide serta dari produk pertama (3-8) adalah yang paling melimpah karena heparinase saya memotong tetrasakarida
hanya perlahan-lahan. Pada saat ini menunjukkan sinyal untuk fragmen 3-8 dan 1-4 kecil tapi jelas diamati [57].
Hasil ini menunjukkan kelayakan se quencing heparin dan heparin seperti wahana polysaccha- sulfat dengan spektrometri
massa. Dalam perjalanan studi sive extension [55, 58] kondisi percobaan yang dioptimalkan menggunakan heparinases I dan II.
Untuk menyederhanakan campuran kadang-kadang kompleks produk, kapiler trophoresis elektroforesis berhasil dieksplorasi.
Karena kadang kali subunit identik dapat terbentuk selama tion diges-, ditemukan berguna untuk massa-label akhir mengurangi
oleh konversi ke semicarbazone a.
Selama waktu itu kami memulai tion kolaboratif yang luas dengan Profesor Ram Sasisekharan dan kelompok riset di MIT,
yang tertarik untuk menjelajahi mekanisme rinci dari pembelahan heparin oleh heparinases. Untuk itu, metode kami isasi
karakter-dan sequencing dari GAG sulfat sangat cocok karena itu cepat, diperlukan bahan sedikit, dan membiarkan berikut
waktu-kursus usia cleav- [59-61]. Dengan pensiun resmi saya pada tahun 1996, wisuda mahasiswa terakhir saya (Andrew
Rhomberg) pada tahun 1998, dan penutupan laboratorium penelitian saya, saya sangat senang untuk mentransfer teknologi,
termasuk spektrometer massa Vestec 2000, kelompok itu. Sangat menyenangkan untuk melihat metodologi baru yang diterapkan
begitu cepat untuk mempelajari proses biologis penting ini.
kesimpulan
Penentuan sukses dari struktur dari sejumlah alkaloid indol mulai pada tahun 1958 membawa spektrometri massa, sampai saat itu
terbatas pada fisika, industri minyak bumi, dan kimia kemudian analitis, menjadi perhatian ahli kimia organik. Akademik dan
penelitian farmasi laboratorium cepat memeluk metodologi ini dan menambahkannya ke gudang metode kal physi- sekarang jadi
diterima secara luas.
Pada saat yang sama kami mulai mengembangkan strategi dan prosedur untuk menentukan urutan peptida kecil di campuran
kompleks yang dihasilkan oleh hidrolisis kimia atau enzimatik protein. Selama sekitar dua cades de-, spektrometri massa muncul
sebagai alternatif untuk degradasi Edman otomatis, yang pula diimbangi dengan kemampuannya untuk menentukan akhir-
kelompok dan urutan peptida N-terminal diblokir, panjang
1270
membentang dari urutan asam amino hidrofobik, serta karakterisasi dan lokasi modifikasi pasca-translasi. Ledakan teknik-teknik
baru dan efisien ionisasi dan perkembangan di tion instrumentasi, dimulai pada akhir 1980-an, membuat spectro- Metry massa
teknologi yang unggul dalam penelitian protein.
Pengamatan bahwa senyawa yang sangat asam, normalisasi mally tidak setuju untuk spektrometri massa, terionisasi seefisien
kompleks terprotonasi dengan peptida dasar yang didefinisikan dengan baik memungkinkan untuk menentukan berat ular molec-
fragmen heparin dan mirip glikosaminoglikan sangat sulfat dengan sensitivitas yang sangat tinggi. Berdasarkan percobaan ini,
strategi untuk ing sequenc- senyawa tersebut dengan belahan dada khusus mereka dengan enzim (heparinases) dikembangkan,
dalam analogi dengan apa yang kita telah begitu berhasil digunakan untuk pasang pep- dan protein. Karya ini membuka jalan
untuk mempelajari struktur, kimia, dan fungsi biologis heparin dan heparin-seperti glikosaminoglikan, lapangan sehingga
terhambat di masa lalu oleh kurangnya ogies methodol- cocok.
Ucapan Terima Kasih

Hal ini tidak mungkin untuk memberikan kredit yang tepat untuk semua orang yang berkontribusi pada pekerjaan dibahas dalam
artikel ini, tapi semua mahasiswa pascasarjana saya dan rekan postdoctoral diberi nama di Referensi [3]. National Institutes of
Health didanai karya dijelaskan selama seluruh periode, dimulai dengan hibah GM 05.472 diberikan pada tahun 1958 dan
berjalan terus-menerus sampai 1998, dan kemudian melalui RR00317 hibah 1966, yang berlangsung dari melalui 1995. awal
kerja alkaloid dan resolusi tinggi massal spektrometer juga didukung oleh dana dari National Science Foundation.
Referensi
1. van Itallie, L .; Steenhauer, AJ Rauwolfia serpentina Benth.
Lengkungan. Pharm. 1932, 270, 313-322. 2. Dorfman, L .; Furlenmeier, A .; Huebner, CF; Lucas, R .; MacPhillamy, HB;
Mueller, JM; Schlittler, E .; Schwyzer, R .; St. Andre, AF Rauwolfia Alkaloid. VIII. Konstitusi reserpin. Helv. Chim. Acta. 1954,
37, 59-75. 3. Biemann, K. Massachusetts Institute of Technology Mass Spectrometry Sekolah. Selai. Soc. Mass Spectrom. 1994,
5, 332-338. 4. Arnold, W .; von Philipsborn, W .; Schmid, H .; Karrer, P. Calabash Alkaloid. XXIII. C-Alkaloid T [sarpagine
metil eter, lochnerine]. Helv. Chim. Acta. 1957, 40, 705-716. 5. Woodward, RB Pengembangan Baru di Kimia
Zat alami. Angew. Chem. 1956, 68, 13-20. 6. Biemann, K. Penentuan Carbom Skeleton dari Sarpagine oleh Mass
Spectrometry. Segi empat. Lett. 1960, 15, 9-13. 7. Bartlett, MF; Dickel, DF; Taylor, WI The Alkaloid dari Tabernanthe iboga.
IV. Struktur dari Ibogamine, Ibogaine, Tabernanthine, dan Voacangine. Selai. Chem. Soc. 1958, 80, 126-136. 8. Hesse, O.
Studien U
ber Argentinische Quebrachodrogen. Liebigs Ann. 1882, 211, 249-282. 9. Witkop, B. Quebrachamine IJ
Am. Chem. Soc. 1957, 79,
3193-3200. 10. Cohen, LA; Daly, JW; Kny, H .; Witkop, B. Nuklir Magnetic Resonance (NMR) Spectra dari Indole. Selai.
Chem. Soc. 1960, 82, 2184-2187.
11. Kny, H .; Witkop, B. Quebrachamine. II. J. Org. Chem. 1960, 25,
635-637. 12. Mills, JFD; Nyburg, SC Struktur Molekul Aspido-
spermine. Tetrahedron Lett. 1959, 11, 1-3. 13. Biemann, K .; Spiteller, G. Struktur Quebrachamine. Tetrahedron Lett. 1961,
9, 299-304; Aplikasi Misa Spec- trometry untuk Struktur Masalah. VIII. Quebrachamine. Selai. Chem. Soc. 1962, 84, 4578-4586.
14. Biemann, K. Aplikasi Mass Spectrometry untuk Struktur Masalah. IV. Sarpagine. Selai. Chem. Soc. 1961, 83, 4801-4805. 15.
Biemann, K .; Friedmann-Spiteller, M .; Spiteller, G. Sebuah inves- tigation oleh Mass Spectrometry dari Alkaloid dari Aspido-
sperma quebracho blanco. Segi empat. Lett. 1961, 14, 485-492. 16. Djerassi, C. Steroid Made It Possible. Organik Mass Spectro-
Metry. Org. Mass Spectrom. 1992, 27, 1341-1347. 17. Biemann, K. Mass Spectrometry: Aplikasi Kimia Organik. McGraw-
Hill Book Company, Inc .: New York, 1962 (Reprint- ed 1998 sebagai Vol I ASMS Publikasi Pekerjaan Klasik di Mass
Spectrometry). 18. Biemann, K .; Friedmann-Spiteller, M .; Spiteller, G. permohonanpermohonan tions dari Mass Spectrometry
untuk Struktur Masalah. X. Alka- loids dari Bark dari Aspidosperma quebracho blanco. Selai. Chem. Soc. 1963, 85, 631-638. 19.
Beynon, JH Tinggi Rresolution Mass Spectrometry Bahan Organik. Prosiding Kemajuan dalam Mass Spectrometry Konferensi;
Cambridge, UK, 1959; Volume Tanggal 1958; pp 328-354. 20. Bommer, P .; McMurray, WJ; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass
Spectrometry dari Natural Products. Vinblastin dan De- rivatives. Selai. Chem. Soc. 1964, 86, 1439-1440. 21. Neuss, N .;
Gorman, M .; Hargrove, W .; Cone, NJ; Biemann, K .; Bu chi, G .; Manning, RE Vinca Alkaloid. XXI. Struktur dari Oncolytic
Alkaloid Vinblastine (VLB) dan vincristine (VCR). Selai. Chem. Soc. 1964, 86, 1440-1442. 22. Biemann, K. Mass Spectrometry
Terpilih Produk Natural. Dalam Kemajuan dalam Kimia Organik Natural Products; Zech- meister, L., Ed .; Springer Verlag:
Wina, 1966; pp 1-98. 23. Biemann, K .; McCloskey, JA Aplikasi Misa Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. VI. Nukleosida.
Selai. Chem. Soc. 1962, 84, 2005-2006; Mass Spectra Organik Molekul. II. Asam amino. Ibid., 3192-3193. 24. Hites, RA;
Biemann, K. Massa Sistem Spektrometer-Komputer Terutama Cocok untuk Gas Chromatography dari Communication plex
Campuran. Anal. Chem. 1968, 40, 1217-1221 dan sebelumnya referensi di dalamnya. 25. James, AT; Martin, AJP Gas-Liquid
Partition Chromatog- raphy. Sebuah Teknik Analisis Mineral Volatile. Analis 1952, 77, 915-932. 26. Ryhage, R. Penggunaan
Spektrometer Massa sebagai Detector dan Analyzer untuk Limbah Muncul dari Suhu Tinggi Gas Liquid Chromatography
Kolom. Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27. Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass Spectra dari Senyawa Muncul dari
kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36, 1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .; Seibl, J. Aplikasi Misa Spectro- Metry untuk
Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP
Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30.
Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides melalui Phenyl- Sebuah Teknik Analisis Mineral Volatile. Analis 1952, 77, 915-
932. 26. Ryhage, R. Penggunaan Spektrometer Massa sebagai Detector dan Analyzer untuk Limbah Muncul dari Suhu Tinggi
Gas Liquid Chromatography Kolom. Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27. Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass
Spectra dari Senyawa Muncul dari kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36, 1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .; Seibl, J.
Aplikasi Misa Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-
2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik
Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides melalui Phenyl- Sebuah Teknik
Analisis Mineral Volatile. Analis 1952, 77, 915-932. 26. Ryhage, R. Penggunaan Spektrometer Massa sebagai Detector dan
Analyzer untuk Limbah Muncul dari Suhu Tinggi Gas Liquid Chromatography Kolom. Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27.
Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass Spectra dari Senyawa Muncul dari kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36,
1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .; Seibl, J. Aplikasi Misa Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino
di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai
Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari
Peptides melalui Phenyl- Ryhage, R. Penggunaan Spektrometer Massa sebagai Detector dan Analyzer untuk Limbah Muncul dari
Suhu Tinggi Gas Liquid Chromatography Kolom. Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27. Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi
Mass Spectra dari Senyawa Muncul dari kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36, 1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .;
Seibl, J. Aplikasi Misa Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81,
2274-2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik
Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides melalui Phenyl- Ryhage, R.
Penggunaan Spektrometer Massa sebagai Detector dan Analyzer untuk Limbah Muncul dari Suhu Tinggi Gas Liquid
Chromatography Kolom. Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27. Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass Spectra dari
Senyawa Muncul dari kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36, 1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .; Seibl, J. Aplikasi Misa
Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger,
F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J.
1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides melalui Phenyl- Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27.
Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass Spectra dari Senyawa Muncul dari kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36,
1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .; Seibl, J. Aplikasi Misa Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino
di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai
Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari
Peptides melalui Phenyl- Anal. Chem. 1964, 36, 759- 764. 27. Watson, JT; Biemann, K. Resolusi Tinggi Mass Spectra dari
Senyawa Muncul dari kromatografi gas. Anal. Chem. 1964, 36, 1135-1137. 28. Biemann, K .; GAPP, F .; Seibl, J. Aplikasi Misa
Spectro- Metry untuk Struktur Masalah. I. Urutan Asam Amino di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger,
F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J.
1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides melalui Phenyl- Urutan Asam Amino di Peptides. Selai.
Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II.
Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30. Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides
melalui Phenyl- Urutan Asam Amino di Peptides. Selai. Chem. Soc. 1959, 81, 2274-2275. 29. Sanger, F .; Thompson, EOP
Urutan Asam Amino dalam Glycycl Rantai Insulin. II. Peptida dari zates enzimatik Hydroly-. Biochem. J. 1953, 53, 366-374. 30.
Edman, Pehr. Degradasi bertahap dari Peptides melalui Phenyl-
thiohydantoins. Acta Chem. Scand. 1953, 7, 700-701. 31. Biemann, K .; Vetter, W. Pemisahan Derivatif Peptida oleh Gas
Chromatography Dikombinasikan dengan Misa spektrometri Penentuan Urutan Asam Amino. Biochem. Biophys. Res. Commun.
1960, 3, 578-584.
1
32. Biemann, K. Kedatangan Umur dari Spektrometri Massa di Peptida dan Protein Kimia. Protein Sci. 1995, 4, 1920-1927. 33.
Hudson, G .; Biemann, K. Mass spektrometri Sequencing Protein. Struktur Subunit I Monellin. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1976, 71, 212-220. 34. Nau, H .; Biemann, K. Computer-Assisted Penugasan Indeks tention Re- di Gas
Chromatography-Mass Spectrometry dan Aplikasi untuk Campuran dari Biological Asal. Anal. Chem. 1974, 46, 426-434. 35.
Nau, H .; Forster, H.-J .; Kelly, JA; Biemann, K. polipeptida Sequencing oleh Spectrometer- Sistem Komputer Gas
Chromatograph-Mass. Karakterisasi Campuran Kompleks Oligopeptidases Trimethylsilylated poliaminokarboksilat Alkohol.
Biomed. Mass Spectrom. 1975, 2, 326-339. 36. Carr, SA; Hauschka, PV; Biemann, K. Gas chromatograph grafis Mass
spektrometri Urutan Penetapan osteocalcin: Sebuah -Carboxyglutamic Asam Mengandung Protein dari Chicken Bone. J. Biol.
Chem. 1981, 256, 9944-9950. 37. Bohak, Zvi; Li, Shoei-Lung. Struktur Monellin dan Hubungan dengan Manisnya Protein
tersebut. Biochim. Biophys. Acta. 1976, 427, 153-170. 38. (a) Gerber, GE; Anderegg, RG; Herlihy, WC; Abu-abu, CP; Niemann,
K .; Khorana, HG parsial Struktur Primer bacteriorhodopsin: Metode Sequencing untuk teins Membran Pro. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA tahun 1979, 76, 227-231. (B) Khorana, HG; Gerber, GE; Herlihy, WC; Abu-abu, CP; Anderegg, RG; Nihei, K .;
Biemann, K. Asam Amino Urutan bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tahun 1979, 76, 5046-5050. 39. Putney, SD;
Royal, NH Neumann; de Vegvar, H .; Herlihy, WC; Biemann, K .; Schimmel, Struktur PR Primer dari Large aminoasil-tRNA
sintetase. Ilmu 1981, 213, 1497- 1501. 40. Morris, Studi HR Menjelang Lengkap Urutan Deter- mination Protein oleh Mass
Spectrometry; sebuah dure cepat-prosedur untuk Permethylation Keberhasilan Histidin Contain- ing Peptides. FEBS Lett. 1972,
22, 257-260. 41. Hunt, DF; Buko, AM; Ballard, JM; Shabanowitz, J .; Giordani, A. Analisis Urutan polipeptida dengan Collision
Activated Pemisahan pada trometer Tiga quadrupole Mass Spec-. Biomed. Mass Spectrom. 1981, 8, 397-408. 42. Barber, M .;
Bordoli, RS; Sedgwick, RD; Tyler, AN Cepat Atom Pemboman Solids (FAB): Sumber Baru Ion untuk Spektrometri Massa. J.
Chem. Soc. Chem. Commun. 1981, 7, 325-327. 43. Biemann, K. Cepat Atom Pemboman Spektrometri Massa di Protein
Sequencing. Proc. Soc Jepang. Med. Mass Spectrom. 1981, 6, 21-32. 44. Biemann, K .; Martin, SA Mass spektrometri Penentuan
Asam Amino Urutan Peptida dan Protein. Mass Spectrom. Rev. 1987, 6, 1-76. 45. Biemann, K. Metode spektrometri massa
untuk Protein Ketahanan
quencing. Anal. Chem. 1986, 58, 1289A-1300A. 46. Papyannopoulos, IA; Gan, Z.-R .; Wells, WW; Biemann, K. A Revisi
Urutan Calf Timus glutaredoxin. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 159, 1448-1454. 47. Johnson, RS; Biemann, K. Struktur
Primer Thiore- doxin dari Chromatium vinosum Ditentukan oleh Mance Tinggi Perfor- Tandem Mass Spectrometry. Biokimia
1987, 26, 1209-1214. 48. Johnson, RS; Biemann, Program Komputer K. (SEQPEP) untuk Membantu dalam Interpretasi Tinggi
Energi Tabrakan Tandem Mass Spectra dari Peptides. Biomed. Mengepung. Mass Spectrom. 1989, 18, 945-957. 49. Meng, CK;
Mann, M .; Fenn, JB electrospray Ionisasi Beberapa polipeptida dan Protein Kecil. Prosiding 36 tersebut
ASMS Konferensi Spektrometri Massa dan Sekutu Topik; San Francisco, CA, 05-10 Juni 1998; pp 771-772. 50. Karas, Michael;
Hillenkamp, Franz. Laser Desorpsi Ioniza- tion Protein dengan Misa Molekuler Melebihi 10.000 Dalton. Anal. Chem. 1988, 60,
2299-2301. 51. Zia, J .; Annan, RS; Biemann, K. Berat Molekul Benar mioglobin, suatu Calibrant umum untuk Mass Spectro-
Metry. Cepat Commun. Mass Spectrom. 1992, 6, 32-36. 52. Zeng, Z .; Biemann, K. Penentuan N-linked Glycosyla- tion dari
Ragi Eksternal invertase oleh MALDI TOF Mass Spec- trometry. J. Mass Spectrom. 1999, 34, 311-329. 53. HenzelW. J.StultsJ.
T.WatanabeC. Pendekatan Novel untuk iDEN- tifying Protein: Molecular Ion Mencari Basis Protein Data. Prosiding 3
Simposium The Protein Masyarakat; Seattle, WA, 1989; p M179. 54. Juhasz, P .; Biemann, K. Massa spektrometri Berat Molekul
Penentuan Senyawa Sangat asam Signifikansi Hayati melalui Kompleks mereka dengan polipeptida Basic. Proc. Natl. Acad. Sci.
Amerika Serikat 1994, 91, 4333-4337. 55. Rhomberg, A .; Biemann, K. Mass spektrometri Analisis Polisakarida sangat asam.
Dalam Sebuah Panduan Laboratorium untuk Glyco- Analisis konjugat; Jackson, B .; Gallagher, JT, Eds .; Birkhauser: Basel,
1997; pp 77-89. 56. Juhasz, P .; Biemann, K. Utility Kompleks Non-kovalen dalam MALDI Mass Spectrometry dari Heparin
yang diturunkan charides Oligosac-. Carbohydr. Res. 1995, 270, 131-147. Dalam Sebuah Panduan Laboratorium untuk Glyco-
Analisis konjugat; Jackson, B .; Gallagher, JT, Eds .; Birkhauser: Basel, 1997; pp 77-89. 56. Juhasz, P .; Biemann, K. Utility
Kompleks Non-kovalen dalam MALDI Mass Spectrometry dari Heparin yang diturunkan charides Oligosac-. Carbohydr. Res.
1995, 270, 131-147. Dalam Sebuah Panduan Laboratorium untuk Glyco- Analisis konjugat; Jackson, B .; Gallagher, JT, Eds .;
Birkhauser: Basel, 1997; pp 77-89. 56. Juhasz, P .; Biemann, K. Utility Kompleks Non-kovalen dalam MALDI Mass
Spectrometry dari Heparin yang diturunkan charides Oligosac-. Carbohydr. Res. 1995, 270, 131-147.
1272
57. Rhomberg, AJ; Wolf, S .; Biemann, K. Mass spektrometri Sequencing dari Heparin dan heparan Sulfat Menggunakan
Pencernaan parsial dengan Heparinases. Prosiding Konferensi ASMS ke-45 pada Mass Spectrometry dan Sekutu Topik; Palm
Springs, CA, Juni 1997, hlm 1026-1027. 58. Rhomberg, AJ Mass spektrometri dan kapiler Electro phoretic Investigasi Heparin,
Heparinases, dan terkait Senyawa. Ph.D. Skripsi, Massachusetts Institute of Technology, 1998. 59. Rhomberg, AJ; Ernst, S .;
Sasisekharan, R .; Biemann, K. Mass spektrometri dan kapiler elektroforesis Investigasi enzimatik Degradasi Heparin-seperti
kaleng Glycosaminogly-. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tahun 1998, 95, 4176-4181.
60. Ernst, S .; Rhomberg, AJ; Biemann, K .; Sasisekharan, R. Bukti langsung untuk Mekanisme Processive Terutama Exolytic
untuk Depolimerisasi dari Heparin-seperti Glycosaminoglycans oleh Heparinase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tahun 1998, 95,
4182-4187.
61. Rhomberg, AJ; Shriver, Z .; Biemann, K .; Sasisekharan, R. Mass spektrometri Bukti untuk Mekanisme enzimatik dari
Depolimerisasi dari Heparin-seperti Glycosaminoglycans oleh Heparinase II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tahun 1998, 95, 12232-
12.237.

Biemann2002.PDF - En.id

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Biemann2002.PDF - En.id

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Empat Dasawarsa Penentuan Struktur oleh Mass

Spectrometry: Dari Alkaloid ke Heparin

The Mass Spectrometer

Peptida dan Protein

Ucapan Terima Kasih

Vous aimerez peut-être aussi