Introduccin:

La determinacin de la estructura de doble hlice del ADN (Premio Nobel de medicina en

1962 James Watson y Francis Crick).
La Informacin gentica es traducida a protenas, catalizadores Naturales de las distintas
funciones biolgicas.
A comienzo de los aos 70
Endonucleasas de restriccin, ADN ligasas, ADN polimerasa
Tecnologa del ADN recombinante

Que son las protenas recombinantes?

Protenas producidas artificialmente a partir de genes clonados
Aislamiento de la secuencia gnica (ARNm) y traduccin de la protena blanco.
Introduccin en un organismo (Procariota / Eucariota).
Expresin y purificacin de la protena blanco.

Para qu sirven?

Se usa en reas bsicas como:

Biologa, Cristalografa
Biofsica, Bioqumica,
Microbiologa, etc.

reas aplicadas

Salud: Insulina humana recombinante (EEUU en 1982)

Biotecnologa Anticuerpos Recombinantes (Rituzimab, Scott 1998)
Agricultura, etc. Resistencia a plagas y herbicidas. (Alcalde et al 2000)

Expresin de protenas recombinantes

Amplificacin por PCR del gen de inters

Obtencin del vector de clonado
Digestin de ambos productos con enzimas de restriccin
Ligacin y transformacin en el sistema elegido
Seleccin clonal del organismo con el vector recombinante
Cultivo del clon e induccin de la expresin proteica

Optimizacin De Los Vectores De Expresin

Capaz de transportar dos o ms secuencia de ADN recombinante -----> Co-expresin.

Posibilidad de utilizar promotores fuertes o dbiles (T7 o T5) -----> No saturar la maquinaria
traduccional bacteriana.
Capacidad de exportar la protena al espacio periplasmico ------> Puentes disulfuros.
Distintos orgenes de replicacin -----> Elevado nmero de copias.

Con protenas de fusin ------> Ayudar al plegado de la protena blanco.

Con distintos tags -------> Ayudar a la purificacin de la protena blanco.

Optimizacin de la cepa husped

Enzimas implicadas en el sistema redox; Generar puentes di-sulfuros en el citosol.

Cepas deficientes en proteasas; Estabilidad de la protena (BL21 D3, Novagen)
recombinante.
Permeasas mutadas (lac permeasa); Sensibles a distintas concentraciones del inductor.
Suplementadas con codones raros; Expresin de protenas heterlogas.

La recombinacin de genes humanos en el ADN de bacterias es una de las posibilidades que ofrece
la biotecnologa, y que posibilita obtener protenas humanas con fines teraputicos. Por ejemplo,
insulina humana obtenida a partir de la bacteria Escherichia coli. Esta tcnica es de gran valor porque
las bacterias se reproducen rpidamente y pueden duplicar su nmero cada 20 minutos. De esta
forma se pueden obtener en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el ADN
bacteriano, y producir grandes cantidades de protenas recombinantes.

A escala industrial, la produccin de protenas recombinantes involucra las siguientes etapas:

Fermentacin: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que contienen un
medio de cultivo nutritivo.

Extraccin: las clulas son centrifugadas para recuperar las protenas de su interior.

Purificacin: se separa la protena recombinante de las otras protenas bacterianas.

Formulacin: la protena recombinante es modificada para conseguir una forma estable y estril
que puede administrarse teraputicamente.
Cada una de las fases de la elaboracin implica un manejo muy cuidadoso de los materiales y un
estricto control de calidad para optimizar la extraccin, la pureza, la actividad y la estabilidad del
frmaco.
Dependiendo del producto y del tipo de clula utilizada, la produccin de protenas recombinantes
puede ser un proceso simple o ms complejo. Aunque la complejidad del proceso aumentara el
costo final del producto, el valor nunca sobrepasar al gasto de aislar el compuesto desde su fuente
original (por ejemplo, obtencin de insulina a partir de pncreas de porcinos o bovinos) para llegar
a cantidades medicinales.
La ingeniera gentica permite que numerosas protenas potencialmente teraputicas, que antes se
producan solo en pequeas cantidades, puedan elaborarse en grandes cantidades.
En la actualidad existen ms de 30 protenas aprobadas para su uso clnico, y cientos de genes de
protenas teraputicas que se han expresado a nivel de laboratorio y que estn intentando
demostrar su adecuacin clnica.
La insulina: estructura y funcin

La insulina es una hormona producida por el pncreas. Tiene una estructura proteica y su funcin
consiste en regular la concentracin de glucosa en la sangre. Sin la insulina, la glucosa se acumula
en la sangre hasta que alcanza niveles elevados y puede causar diferentes complicaciones en el
funcionamiento del organismo. Esta es la enfermedad conocida como diabetes mellitus. Cuando la
diabetes es causada por una escasa o nula produccin de insulina, se puede regular el nivel de
glucosa en la sangre (glucemia) mediante la administracin exgena de insulina.

En 1921, los fisilogos canadienses Frederick G. Banting y Charles H. Best extrajeron por primera vez
la insulina del tejido pancretico de perros, y en 1923 la insulina estaba comercialmente disponible
en los Estados Unidos. Luego, la insulina para diabticos se obtuvo a partir de pncreas de cerdos o
vacas, que aunque es biolgicamente activa en humanos, no es idntica a la humana, de modo que
se pueden producir algunos problemas de reacciones inmunes adversas.

La insulina es una hormona proteica constituida por 51 aminocidos. La sntesis de insulina atraviesa
diferentes etapas: se fabrica como pre-proinsulina que luego se transforma en proinsulina al
cortarse sus extremos. La mayora de la proinsulina se separa en dos partes: el pptido C"
(conector) y la insulina, que est constituida por dos cadenas polipeptdicas, una de 21 aminocidos
y otra de 30, unidas por dos puentes disulfuro.

La insulina recombinante
La insulina es el primer caso de protena producida por ingeniera gentica aprobada para uso en
humanos, desde 1982. En la actualidad, varios laboratorios farmacuticos producen insulina
humana, tanto a partir de bacterias como de levaduras, y sin ningn riesgo para la salud.
La obtencin de insulina a partir de pncreas de vacas o cerdos, y la obtencin mediante ingeniera
gentica.
Si bien estos son los pasos a seguir para la obtencin de insulina recombinante, si se inserta en el
plsmido bacteriano el gen entero de la insulina, se obtendra como resultado la preproinsulina.
Para evitar estas dificultades se sintetizan qumicamente la secuencia de ADN correspondiente a las
cadenas polipeptdicas A y B que se insertan separadamente en un gen bacteriano. Los plsmidos
recombinantes se introducen en bacterias E. coli, donde se multiplican. Una vez purificadas las dos
cadenas, se unen mediante una reaccin que forma puentes disulfuro (de azufre) y se obtiene
insulina humana pura. El producto final, la insulina humana biosinttica, es idntica en todos los
aspectos a la insulina purificada del pncreas humano.

Escherichia coli.: Esta tcnica es de gran valor porque las bacterias se reproducen rpidamente y
pueden duplicar su nmero cada 20 minutos. De esta forma se pueden obtener en poco tiempo
muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano, y producir grandes cantidades de
protenas recombinantes. (Guerra, 2012)
A escala industrial, la produccin de enzimas y protenas recombinantes involucra las siguientes
etapas:
Fermentacin: Las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que
contienen un medio de cultivo nutritivo.
Extraccin: Las clulas son centrifugadas para recuperar las enzimas de su interior.
Purificacin: Se separa la enzima recombinante de las otras protenas bacterianas.
Formulacin: La enzima recombinante es modificada para conseguir una forma estable y
estril que puede administrarse teraputicamente. (Garca, 2013)
Tambin es el caso de la empresa textil Levis, en la cual es utilizado un tinte llamado ndigo para la
coloracin de las prendas vaqueras, sin embargo por razones comerciales, una vez teidas, se les da
un aspecto envejecido mediante la extraccin del ndigo del interior de la fibra de algodn, a esta
etapa se le conoce como lavado a la piedra, ya que se realizaba mediante la abrasin mecnica
con piedra volcnica en grandes lavadoras, donde se introducan 100 Kg de piedra por 100 Kg de
pantalones vaqueros, lo cual produci a baja rentabilidad de las lavadoras, degradacin del tejido y
100 Kg de piedra triturada de desecho. Debido a lo anterior surgi la necesidad de desarrollar
tecnologas que pudieran disminuir estas desventajas en el proceso, logrndose a travs de la
biotecnologa la sustitucin de la piedra por la enzima celulasa, obtenida del hongo Trichoderma
reesei, obteniendo el mismo efecto percibido del lavado a la piedra sin daar el tejido por
abrasin. Es, sin duda, uno de los ms importantes procesos enzimticos en la industria textil, ya
que en lugar de introducir 100 mil gramos de piedra en las lavadoras slo se introducen 75 gramos
de preparado enzimtico por cada 100 kilos de jeans, lo cual ha posibilitado aumentar el
rendimiento de las lavadoras, adems de que los residuos enzimticos son biodegradables y por
tanto mucho menos contaminantes.

Referencias y Bibliografa.

Association of Manufaturers and Formulators of Enzyme Products (Amfep). 2007. List of

commercial Enzymes. Disponible en: http://www.amfep.org/list.html
Biesgen, C.; Hillebrand, H.; Herbers, K. (2002). Technical enzymes produced in transgenic
plants. Phytochemistry Reviews 1, 79-85.
Genoma Espaa / CIAA-PCM. 2005. Biotecnologa en el sector alimentario. Documento de
Divulgacin. Genoma Espaa, Espaa. pp 6-16.
Madigan, M.; Martinko, J.; Parker, J. 2003. Brock: Biologa de los microorganismos. Prentice
Hall, 10 Ed. Madrid, Espaa. pp 956-961.
Robinson, C. 2003. Alimentos y Tecnologa de modificacin gentica: Salud y seguridad en
el consumidor. ILSI Europe. pp 27-31.
BANDA, J. V. (20 de 11 de 2013). Recuperado el 29 de 11 de 2016, de https://prezi.com
/atlrs7a5x73c/la-tecnologia-enzimatica/
Garibay, M. G. (2004). Biotecnologa alimentaria. Recuperado el 30 de 11 de 2016, de
https://books.google.com.ec/books?id=2ctdvBnTa18C&lpg=PA17&ots=_qE25hwDyl&dq=t
ecnolog%C3%ADa%20enzim%C3%A1tica%20y%20sus%20diferentes%20t%C3%A9cnicas%
20de%20producci%C3%B3n&pg=PA17#v=onepage&q=tecnolog%C3%ADa%20enzim%C3%
A1tica%20y%20sus%20diferentes%20t%C
Miguel Arroyo, C. A. (14 de 07 de 2014). BIOTECNOLOGA ESPAOLA / SPANISH
BIOTECHNOLOGY. Obtenido de http://arbor.revistas.csic.es/index.php/arbor/article
/viewArticle/1958/2290
Aehle, W. (ed.) (2007). Enzymes in industry. Production and applications. Weinheim:
WileyVCH. http://dx.doi.org/10.1002/9783527617098