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El microscopio

El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son


demasiado pequeos para ser observados a simple vista. El tipo ms comn y
el primero que se invent es el microscopio ptico.

A) ocular, B) objetivo, C)
portador del objeto, D) lentes
de la iluminacin, E) sujecin
del objeto, F) espejo de la
iluminacin.

Partes del microscopio ptico y sus funciones


Ocular: El ocular de un microscopio es,
junto con el objetivo, uno de los
elementos esenciales del sistema ptico.
La funcin del ocular es magnificar la
imagen de la muestra que ha sido
previamente aumentada por el objetivo.
Es a travs del ocular que el usuario
puede finalmente observar la muestra.

El ocular se encuentra acoplado al tubo, que es la pieza que conduce los rayos
de luz provenientes de la muestra desde el objetivo hacia el ocular.
Habitualmente es un elemento intercambiable, de modo que pueden utilizarse
oculares con distinto aumento para modificar el aumento total del
microscopio. En los microscopios profesionales su posicin puede ajustarse
con un anillo giratorio para corregir los defectos de visin del usuario.

Aumento microscopio = Aumento objetivo Aumento ocular

El aumento del ocular es en general inferior al del objetivo. Los aumentos ms


habituales son 5x, 10x, 15x y 20x. El aumento proporcionado por un ocular
suele estar inscrito en su parte lateral.

Mediante las lentes del ocular, la imagen real que ha sido generada con el
objetivo es otra vez aumentada dando as lugar a la imagen virtual que es
observada por el usuario del microscopio. Este principio de funcionamiento
est representado esquemticamente en la siguiente imagen.

Aumento y resolucin de un ocular

El aumento total del microscopio se obtiene multiplicando el aumento del


ocular por el aumento del objetivo. Sin embargo, no todas las combinaciones
de ocular y objetivo que resultan en el mismo aumento alcanzan la misma
resolucin.

Esto es debido al hecho que la resolucin depende de la apertura numrica del


objetivo y no directamente de su aumento. Por ejemplo, un objetivo de 40x
(con apertura numrica igual a 0.65) combinado con un ocular de 10x alcanza
el mismo aumento que un objetivo de 20x (con apertura numrica igual a 0.4)
combinado con un ocular 20x. En los dos casos el aumento total es de 400x.
Sin embargo, el objetivo de la primera opcin tiene mayor apertura numrica.
Esto implica que la resolucin de imagen ser mejor en la primera opcin que
en la segunda.

Tipos de oculares

Los elementos bsicos dentro de un ocular son como mnimo dos lentes y un
diafragma. Las dos lentes son necesarias ya que con una sola lente sera
imposible corregir la aberracin cromtica. La lente situada en la parte
superior, es decir, cerca del ojo, se denomina lente ocular. La lente situada en
la parte inferior se denomina lente colectora o de campo.

El diafragma est situado en el plano focal del ocular y su funcin es


minimizar las reflexiones de luz producidas por la misma superficie del
ocular.

En funcin de la disposicin de estos tres elementos en el interior del ocular


puede distinguirse entre dos tipos de oculares: oculares positivos y oculares
negativos.

Oculares positivos: El diafragma est situado debajo de las dos lentes.


El ocular ms comn con esta disposicin es el ocular de Ramsden.
Oculares negativos: El diafragma est situado entre las dos lentes. El
ocular ms comn con esta disposicin es el ocular de Huygens.
Otros tipos de oculares cuyo uso es habitual son el ocular Kellner, el ocular
Plssl o simtrico y el ocular ortoscpico de Abbe.

La diferencia entre los distintos oculares radica en la tcnica utilizada para


corregir las aberraciones pticas. Muchas veces, el tipo de ocular utilizado
debe elegirse en funcin del objetivo del microscopio. Por este motivo, los
microscopios de alta calidad tienen objetivos y oculares diseados para que su
combinacin minimice las aberraciones introducidas.

En los microscopios de luz transmitida se suele ver la


muestra como imagen homognea. La contemplacin de
esa imagen se realiza a travs de unos oculares. Los
microscopios ms antiguos o ms sencillos suelen
disponer de un solo ocular (monocular). Sin embargo,
existen modelos binoculares que disponen de dos oculares
para poder observar la muestra con ambos ojos. La
imagen del preparado se divide en dos recorridos pticos
idnticos, por lo que la contemplacin es, al igual que con
el monocular, bidimensional. No se trata de un
microscopio estreo que permite contemplar una imagen
en 3 dimensiones. Los microscopios trinoculares se usan
cuando es necesario visualizar la imagen en una pantalla. La ventaja es que
puede colocar la unidad electrnica en un tercer tubo, sin que tenga que
prescindir de visualizar la imagen con ambos ojos.

Objetivo: El objetivo es el elemento ms importante y complejo del


microscopio ptico. Es importante porque en el objetivo es donde se produce
la mayor parte del aumento aportado por el microscopio. Su complejidad
radica en el hecho de que para cumplir con su funcin necesita distintas lentes
de alta calidad y precisin.
La imagen obtenida una vez los rayos de luz han atravesado el objetivo se
denomina imagen real. Estos rayos de luz atraviesan a continuacin el ocular,
dando lugar a una imagen virtual que es observada por el usuario del
microscopio.

Habitualmente los microscopios vienen equipados con 3 o 4 objetivos, cada


uno con un aumento distinto y que se puede seleccionar gracias al revlver.
Los microscopios utilizados en mbitos profesionales pueden llegar a tener 5 o
6 objetivos en un solo revlver.

Caractersticas de un objetivo

Los objetivos de un microscopio se pueden caracterizar mediante su nmero


de aumento y su apertura numrica. El aumento de un objetivo es la relacin
entre el tamao de la imagen real y el tamao del objeto observado en
realidad. Estas dos magnitudes pueden observarse en la siguiente imagen.
El aumento de un objetivo suele variar entre 4x y 100x, si bien es cierto que
existen objetivos de alta calidad que pueden llegar a 250x. Al multiplicar este
aumento con el aumento aportado por el ocular se obtiene el aumento total del
microscopio.

El otro parmetro importante es la apertura numrica. Este parmetro se puede


entender como el tamao del cono a travs del cual llega luz al objetivo. Es
decir, los objetivos con una apertura numrica baja tienen un cono de entrada
de luz ms pequeo que los objetivos con una apertura numrica alta.

Objetivo de baja apertura numrica Objetivo de alta apertura numrica

La definicin exacta de la apertura numrica tiene en cuenta el tamao del


cono previamente descrito, as como el ndice de refraccin del medio a travs
del cual se observa la muestra. Sin embargo, el motivo por el cual la apertura
numrica es importante es porque est directamente relacionada con la
resolucin obtenida por el objetivo.

La resolucin de un objetivo depende de la longitud de onda de la luz y de la


apertura numrica del objetivo. La relacin exacta entre estos parmetros es la
siguiente:
Aplicando esta frmula se puede deducir que mediante un objetivo de alta
apertura numrica se pueden apreciar ms detalles que con un objetivo de baja
apertura numrica.

Diferencia entre objetivos secos y objetivos de inmersin

Existen dos tipos bsicos de objetivos: los objetivos secos y los objetivos de
inmersin. Estos dos tipos de objetivos se diferencian en funcin del medio
situado entre la muestra y la lente del objetivo. En el caso de los objetivos
secos, no hay ningn medio entre la muestra y el objetivo aparte del aire. Los
objetivos de inmersin, en cambio, estn diseados para observar la muestra a
travs de una capa de medio de inmersin que normalmente consiste en aceite.
Esto significa que es necesario colocar la cantidad justa de aceite entre el
cubreobjetos que protege la muestra y la lente del objetivo.

La ventaja principal de utilizar objetivos de inmersin es que la luz que llega


al objetivo no necesita atravesar el aire. Esto se traduce en un aumento en la
calidad de imagen ya que reduce la refraccin de la luz incidente. En
consecuencia, los objetivos de inmersin son utilizados en aplicaciones donde
se requiere un gran poder de aumento y alta resolucin.

Objetivo seco Objetivo de inmersin

Los objetivos secos tienen una apertura numrica baja. El mximo valor de
apertura numrica que tericamente puede alcanzar un objetivo seco es 1.0.
Sin embargo, debido a limitaciones prcticas no es posible fabricar un objetivo
seco con una apertura numrica superior a 0.95.

Con la ayuda de los aceites de inmersin es posible alcanzar una apertura


numrica alrededor de 1.4. Esto supone una mejora sustancial en trminos de
resolucin obtenida. Los mximos aumentos que alcanza el microscopio
ptico se obtienen, por lo tanto, mediante objetivos de inmersin.

Nomenclatura de los objetivos

Las caractersticas del objetivo estn siempre inscritas en su lateral. En


general, los fabricantes de objetivos de microscopio siguen un formato
estndar para indicar estas caractersticas. Esto permite reconocer
inmediatamente cualquier parmetro del objetivo independientemente del
fabricante.

Nomenclatura estndar del objetivo (Zeiss Microscopy)

Empezando desde arriba, las indicaciones inscritas en el objetivo son las


siguientes:

Nombre del fabricante: Zeiss, Olympus, Leica, Nikon, etc.


Correcciones pticas: Indicaciones acerca del tipo de lentes utilizadas en el
objetivo para corregir las aberraciones pticas. Existe una gran variedad de
opciones en este punto, la nomenclatura especfica puede variar en funcin del
fabricante.

Aumento: Capacidad de aumento del objetivo, es decir, relacin entre los


tamaos de la imagen real y el objeto real.

Apertura numrica: Indicacin del tamao del cono de luz incidente al


objetivo.

Longitud del tubo: Este nmero indica la distancia en milmetros que debe
haber entre el objetivo y el ocular para que la imagen se forme correctamente.
El smbolo infinito se utiliza para indicar que los rayos son completamente
paralelos al salir del objetivo.

Espesor del cubreobjetos: Este nmero indica el espesor en milmetros del


cubreobjetos que debe utilizarse para minimizar las aberraciones pticas.

Cdigo de color: Mediante un cdigo de colores suele indicarse el aumento


proporcionado por el objetivo. La mayora de los fabricantes siguen el
estndar incluido en la siguiente seccin de este artculo. Adicionalmente, en
el caso de los objetivos de inmersin, un segundo color indica el medio de
inmersin que debe utilizarse.

Cdigo de colores de los objetivos

El cdigo de colores es muy til para identificar de forma inmediata el


aumento proporcionado por el objetivo. Cada color se corresponde a un
aumento determinado segn est indicado en la siguiente imagen.
En el caso de los objetivos de inmersin existe tambin un cdigo de colores
para indicar el medio de inmersin que debe utilizarse. En este caso existen
solo cuatro opciones incluidas en la siguiente imagen.

Tipos de objetivo Leica

Los objetivos se clasifican en clases de rendimiento segn la transmisin, la


correccin cromtica, la planitud, etc. Desde el punto de vista de la
Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO, International
Organization of Standardization), existen tres grupos de clases de objetivos
que difieren en la calidad de la correccin cromtica.
Profundidad de campo:

Leica Microsystems ha ajustado las tres clases de rendimiento de su gama de


objetivos a las necesidades de sus clientes y los requisitos especficos de una
amplia variedad de aplicaciones, manteniendo una convincente relacin
rendimiento-precio.

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Please contact us for more information on our microscope objectives

Lentes acromticas Leica

Las lentes acromticas Leica son potentes


objetivos para aplicaciones estndar en el rango
visible del espectro que ofrecen una planitud de
campo de hasta 23 mm.

El valor absoluto de las diferencias de foco entre


las longitudes de onda roja y azul (2 colores) es
2xla profundidad de campo del objetivo.
Existen tres clases de lentes acromticas:

Los objetivos HI PLAN cuentan con una buena correccin cromtica en dos
longitudes de onda y planitud en todo el campo visual. Incluso los bordes de la
imagen son ntidos y no es necesario reenfocar. Los objetivos HI PLAN estn
diseados para campos visuales de hasta 20 mm. Hay disponibles versiones
para contraste de fases. Los objetivos HI PLAN de Leica ofrecen buenas
propiedades de correccin y tienen un precio extremadamente razonable.

N PLAN

La clase N PLAN de objetivos comprende acromticos an ms mejorados,


con una adecuada planitud de campo de hasta 22 mm. Los objetivos N PLAN
son idneos para luz transmitida y DIC, y los N PLAN PH, para el contraste
de fases. Hay disponibles objetivos N PLAN EPI para aplicaciones de
episcopa, como contraste interferencial diferencial (DIC, Differential
Interference Contrast). Los N PLAN EPI BD tambin pueden utilizarse como
objetivos para campo oscuro. Los objetivos N PLAN EPI para episcopa
ofrecen un excelente contraste de imagen y una distancia de trabajo segura.

FL PLAN

Los objetivos FL PLAN son objetivos universales modernos con una


excepcional correccin cromtica y planitud de campo de hasta 23 mm. Sus
tcnicas de recubrimiento de ltima generacin consiguen que los objetivos
FL PLAN tengan una alta transmisin en fluorescencia. Todos los mtodos de
contraste son posibles. Los objetivos FL PLAN estn optimizados para
fluorescencia, PH y DIC.

Semiapocromtico Leica

Los semiapocromticos Leica son objetivos para


aplicaciones en el rango del espectro visible con
especificaciones superiores y que ofrecen planitud
de campo hasta 25 mm.

Los valores absolutos de las diferencias de foco


para las longitudes de onda roja y azul a verde (3
colores) son 2,5x la profundidad de campo del objetivo.

Existen dos clases de lentes semiapocromticas:

PL FLUOTAR (PL-FL)

Los PL Fluotar son objetivos universales potentes con una excepcional


correccin cromtica para al menos tres longitudes de onda, lo que los hace
adecuados para la obtencin de imgenes de fluorescencia.

La planitud de campo (PL) se calcula para un campo visual de 25 mm. Estn


fabricados con un cristal especial que permite una transmisin mxima. Esto
los convierte en potentes colectores de fotones en la microscopa de
fluorescencia.

El catlogo Fluotar de Leica incluye diversos collares de correccin (CORR)


optimizados para aplicaciones para compensar las influencias externas, como
la temperatura, el grosor del cubreobjetos y los medios de inmersin.

Los objetivos PL S-APO de Leica se acercan mucho a los objetivos de calidad


mxima de la clase PL APO de Leica. Los aumentos entre 1,6x y 63x
permiten una obtencin de imgenes perfecta.

Los objetivos PL S-APO de Leica estn limitados por difraccin (diffraction-


limited) en todo el campo visual.

Su alta transmisin y correccin cromtica los convierten en objetivos de alto


rendimiento para los trabajos de investigacin ms exigentes.

Apocromticos Leica

Los apocromticos Leica son objetivos para


aplicaciones con especificaciones superiores en el
rango del espectro visible y ms all y que ofrecen
una planitud de campo de hasta 25 mm.

Los valores absolutos de las diferencias de foco


para las longitudes de onda roja y azul a verde (3
colores) son 1x la profundidad de campo del objetivo.

Ofrecemos tres clases de apocromticos:

Objetivos PL APO: la clase de los profesionales. Ofrecen una calidad de


imagen que no puede obtenerse con los objetivos convencionales. Los
apocromticos de plano ofrecen una correccin de color axial y lateral
perfecta para aplicaciones que requieren un rpido cambio de color y la
colocalizacin de estructuras. Los objetivos PL APO se caracterizan por una
planitud de imagen perfecta hasta un nmero f = 25. Las excelentes aperturas
numricas definen una potencia de resolucin al lmite de lo fsicamente
posible.

PL IRAPO para obtencin de imgenes multifotnicas y CARS

Mientras que los objetivos PL APO estn corregidos en la gama de longitudes


onda visibles, con los objetivos PL IRAPO se dispone de un nuevo conjunto
de objetivos especializados para la obtencin mejorada de imgenes
multifotnicas (MP). Los objetivos apocromticos IR tienen correccin de
color desde al menos 700 nm y hasta 1.300 nm y son muy transmisivos en las
gamas de longitud de onda visible e infrarrojos, con > 85 % d transmisin
desde 470 1.200 nm. Por tanto, son ideales para la adquisicin no lineal de
imgenes, como la adquisicin de imgenes multifotnicas multicolor,
incluyendo la excitacin con OPO (oscilador paramtrico ptico, optical
parametric oscillator) y CARS (dispersin Raman coherente anti-Stokes,
Coherent Anti-Stokes Raman Scattering).

PL APO CS y CS2 para exploracin confocal

En la clase de objetivos apocromticos, Leica ofrece lentes PL APO


especialmente diseadas para satisfacer las especificaciones de exploracin
confocal (CS) ms exigentes. La ltima serie CS2 de PL APO ha dejado atrs
la serie CS anterior. La correccin cromtica de los nuevos objetivos Leica
CS2 es perfecta en todo el campo visual y permite una colocalizacin precisa
de diferentes fluorforos. Adems, la apertura numrica y la distancia de
trabajo alcanzan nuevos lmites. El diseo de los objetivos Leica CS2 va de la
mano con la innovadora ptica UV del Leica TCS SP8, ofreciendo la
correccin de color UV ms estable. Para obtener imgenes sin aberraciones
en muestras acuosas como clulas vivas, Leica Microsystems ha desarrollado
una serie de excelentes objetivos de inmersin en agua de alta resolucin. Para
obtener los mejores resultados, estos objetivos requieren un collar de
correccin para adaptar la ptica a los diversos grosores de los cubreobjetos,
los cambios de temperatura y la heterogeneidad de las muestras.

El ajuste manual del collar de correccin requiere tiempo y experiencia y es


algo complejo cuando el acceso al objetivo est obstruido por equipo
adicional. El collar de correccin motorizado de los objetivos Leica
motCORRTM simplifica el ajuste del collar de correccin y reduce el esfuerzo
de aprendizaje. El control remoto del Leica motCORRTM ajusta la ptica
rpidamente sin alterar la muestra.

Objetivos especiales

Con frecuencia, se necesitan objetivos especialmente optimizados para


investigacin mediante tcnicas muy especializadas o para muestras
complejas. Leica Microsystems ofrece una amplia variedad de objetivos
especiales para dichas aplicaciones.

Algunos ejemplos:

Objetivos TIRF con las mximas aperturas numricas

Objetivos con una alta transmisin de alrededor de 350 nm para


microdiseccin con lser

Objetivos especiales para tcnicas de "patch-clamp" en cortes cerebrales


vivos que permiten la medicin de canales de iones individuales
mediante un objetivo sumergible inerte

Objetivos multifotnicos optimizados para infrarrojos para la


visualizacin de cortes de tejido neuronal profundo

Objetivos de inmersin en agua, glicerina y multiinmersin con el


ndice de refraccin correcto para el medio de la muestra para la
adquisicin de imgenes sin aberraciones de muestras ms gruesas

Suministro automtico de agua para inmersin durante los experimentos


con el microdispensador de inmersin en agua de Leica
Condensador: En un microscopio
ptico compuesto, la luz est
concentrada en el condensador y
centrada a travs de la muestra a
la lente del objetivo, donde se
canaliza en el ocular para la
observacin. Si bien el objetivo es
el factor determinante en cunto
se magnifica la imagen, la
observacin en aumentos ms
altos no es posible sin un
condensador adecuado.
Funcin del condensador

Los microscopios tienen un espejo o una fuente de luz montada en la parte


inferior brillando hacia arriba, hacia la muestra. Un condensador centra esta
luz a travs de la muestra, afinando drsticamente la imagen y permitiendo
que el microscopio mantenga una imagen clara en resoluciones ms altas.

Microscopios sin condensadores

Los lentes de condensador son ms tiles al observar a grandes aumentos de


400 X y ms. Si un aumento mximo del microscopio es mucho menor que
esto, no puede tener un condensador. Algunos espejos de microscopio son
lentes cncavos, diseados para enfocar la luz sobre la muestra sin un
condensador a muy bajos aumentos.

Condensadores especializados

El condensador estndar utilizado hoy en da se llama condensador de Abbe.


Existen dos variedades principales de condensadores especializados que
representan mejoras al condensador de Abbe. El primero es el condensador
aplantico, que corrige las aberraciones esfricas. Las aberraciones esfricas
reducen la capacidad de un condensador para enfocar la luz hacia un punto
especfico. Este tipo de condensador corrige las aberraciones cromticas. Este
tipo de aberraciones evitan que un condensador se enfoque a diferentes
longitudes de onda de luz en el mismo punto.

Condensadores en microscopios electrnicos


Los microscopios electrnicos tambin tienen condensadores similares a los
microscopios de luz. Estos condensadores centran los haces de electrones a
travs de la muestra. Los condensadores forman parte de todos los
microscopios electrnicos de escanografa y transmisin.

Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.


Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Tubo: es la cmara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar
unida al brazo mediante una cremallera para permitir el enfoque.
Revlver: El revlver es una parte del microscopio ptico que
da versatilidad al instrumento y facilita su uso. La funcin del revlver es
permitir cambiar fcilmente el objetivo utilizado para observar la muestra.
Normalmente se pueden montar tres o cuatro objetivos en un revlver de
modo que esta pieza nos permitir observar la muestra con tres o cuatro
aumentos distintos.

Todos los microscopios profesionales vienen equipados con un revlver. Aun


as, es verdad que no es una pieza imprescindible y que existen muchos
microscopios bsicos sin revlver. En estos casos el microscopio est
equipado con un solo objetivo que puede desenroscarse y sustituirse por otro
en caso de que sea necesario cambiar el aumento.

Funcionamiento

Un revlver para microscopio


suele tener entre tres y cuatro
orificios para colocar
objetivos. En cada orificio
puede acoplarse un objetivo
de distinto aumento. El
revlver completo puede girar
en torno a un eje de modo que
permite seleccionar el
objetivo adecuado.

Existen dos tipos principales de revlveres para microscopio, los de objetivo


fijo y los de objetivo intercambiable. En los revlveres de objetivo fijo los
objetivos y el revlver forman una sola pieza. Este es el caso ms habitual en
los microscopios ms bsicos. Estos microscopios permiten utilizar objetivos
de distinto aumento, pero no permiten desenroscar los objetivos para instalar
nuevos objetivos con caractersticas distintas.

Los revlveres de objetivo intercambiable son los ms avanzados. Esta es la


opcin ms adecuada para una mayor versatilidad. Con un revlver de
objetivo intercambiable podemos instalar en l los objetivos que ms nos
convengan para un tipo determinado de muestras. Ya sean objetivos de bajo
aumento, alto aumento o de inmersin.

Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la


platina o el tubo hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico permite
desplazamientos amplios para un enfoque inicial y el micromtrico,
desplazamientos muy cortos, para el enfoque ms preciso. Pueden llevar
incorporado un mando de bloqueo que fija la platina o el tubo a una
determinada altura.
Portaobjetos: El portaobjetos de laboratorio es una pieza clave para observar
una muestra en el microscopio. Un portaobjetos es una lmina rectangular de
vidrio transparente sobre la cual se coloca la muestra que deber ser observada
con el microscopio.

Las dimensiones de un portaobjetos estandarizadas segn la norma DIN ISO


8037-1 son de 76 x 26 mm. Su espesor suele ser de entre 1 y 1.5 mm. An as,
pueden encontrarse portaobjetos con dimensiones distintas para algunas
aplicaciones especficas. Por ejemplo, es frecuente encontrar portaobjetos de
76 x 52 mm o 48 x 28 mm.

Los portaobjetos suelen fabricarse con vidrio sodoclcico o vidrio


borosilicatado.
Tipos de portaobjetos

Existen algunas variaciones en las caractersticas del portaobjetos tradicional


que dan lugar a distintos tipos de portaobjetos.

El tipo ms sencillo de portaobjetos es simplemente rectangular y de vidrio


transparente. A partir de esta versin bsica se fabrican tambin portaobjetos
con las esquinas esmeriladas a 45. Esto facilita su manipulacin y reduce el
riesgo de cortarse. Existen un tipo de platinas que mantienen fijo el
portaobjetos con la ayuda de un muelle. Para este tipo de platinas es adecuado
utilizar portaobjetos con las esquinas esmeriladas.

Tambin existen portaobjetos con banda mate. En estos portaobjetos una parte
del vidrio en un extremo es semisatinado. De este modo puede escribirse con
bolgrafo el nombre de la muestra.

Algunos portaobjetos estn divididos en compartimentos para poder colocar


en ellos ms de una muestra. Estos portaobjetos se utilizan para observar ms
de una muestra en el microscopio sin necesidad de cambiar el portaobjetos.

Existen portaobjetos diseados con una superficie cncava donde se coloca la


muestra. Estos portaobjetos son tiles para observar muestras con un poco de
espesor. Tambin son utilizados para mantener la muestra hidratada con algn
tipo de lquido.
Para mbitos profesionales pueden encontrarse tambin portaobjetos que
tienen grabada una cuadrcula. Esto es til para calibrar y medir fcilmente el
tamao de las muestras observadas.

Cmo utilizar el portaobjetos

Un portaobjetos debe utilizarse conjuntamente con un cubreobjetos. El


cubreobjetos es tambin una lmina de vidrio, pero con mucho menos espesor
y, por lo tanto, mucho ms frgil. Las dimensiones ms habituales del
cubreobjetos son de 18 x 18 mm.

En primer lugar se coloca la muestra sobre el portaobjetos y a continuacin


esta se recubre con el cubreobjetos. Esta disposicin permite que el espesor de
la muestra debajo del cubreobjetos sea uniforme. De esta forma se facilita el
enfoque de la muestra.

Gracias al portaobjetos y al cubreobjetos tambin se protege la muestra de una


posible contaminacin. Tambin se impide daar el objetivo si por error este
se acerca demasiado a la muestra.

En algunos casos es posible sellar el contacto entre el cubreobjetos y el


portaobjetos. Esto se utiliza para guardar la muestra y permitir su observacin
de nuevo en un punto futuro.

Una vez la muestra est preparada en el portaobjetos, este debe colocarse en


la platina de modo que la luz del foco ilumine la muestra. A continuacin,
pueden utilizarse los tornillos macromtrico y micromtrico para ajustar la
posicin de la platina y as enfocar la muestra.

Almacenamiento de portaobjetos

Existen cajas diseadas para guardar portaobjetos, ya sean para preparar


nuevas muestras o para guardar muestras que han sido fijadas en el
portaobjetos.

Gracias a la definicin de unas dimensiones estndar internacionales del


portaobjetos (DIN ISO 8037-1) es posible comprar estas cajas de distintos
fabricantes. Solo hay que vigilar que las cajas hayan sido fabricadas con las
dimensiones estndar.
Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se
coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la
fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el
portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera que permite mover la
preparacin. Puede estar fija o unida al brazo por una cremallera para permitir
el enfoque.
Brazo: Es la estructura que sujeta el tubo, la platina y los tornillos de enfoque
asociados al tubo o a la platina. La unin con la base puede ser articulada o
fija.
Base o pie: La base del microscopio es unos de los elementos del sistema
mecnico cuya funcin es dar estabilidad al microscopio. Para cumplir con
esta funcin la base suele ser la parte ms pesada del microscopio.

La base est conectada estructuralmente al


brazo del microscopio. Adems, sobre la
base suele estar montada tambin la fuente
de luz que ilumina la muestra. Esta fuente
puede ser directamente un foco de luz o bien
un pequeo espejo que refleja la luz
proveniente de otro punto. Es habitual, por
lo tanto, encontrar tambin en la base un
interruptor para encender o apagar la fuente
de luz. Adems, puede encontrarse tambin
una rueda giratoria para regular la cantidad
de luz emitida por la fuente de luz.

En los microscopios actuales la forma ms


habitual de la base es simplemente
rectangular. Sin embargo, a lo largo de la
historia de los microscopios ha habido
distintos tipos de base que han sido
utilizados. Durante mucho tiempo, un diseo muy habitual consista en montar
el microscopio en una base en forma de trpode. Tambin ha habido
microscopios con la base en forma de Y. Otra alternativa muy habitual,
sobretodo en microscopios sencillos de tipo monocular, son las bases en forma
de herradura.

Tipos de microscopio
Microscopio de luz transmitida
Los microscopios de luz transmitida sirven para contemplar preparados
transparentes y muy finos. Cuanto ms fino sea el preparado, con ms
precisin podr observarlo. Sin embargo, puede usar los microscopios de luz
transmitida para ver la superficie de muestras de cuerpos opacos, como, por
ejemplo, granulados o sedimentos. En tales casos, el preparado se observa
como un juego de luz y sombras. En este tipo de microscopios el rayo de luz
suele proyectarse desde abajo, atravesando el preparado, cuando este sea
transparente. Si desea contemplar bien los preparados especiales que se
depositan sobre la platina, es mejor que use un microscopio invertido. En este
tipo de microscopios la iluminacin es de arriba hacia abajo.

Microscopio de luz reflejada (microscopio ptico)

En este tipo de microscopio se ilumina el preparado desde la parte


superior a travs del objetivo o lateralmente. La luz reflejada en el preparado
es captada por el objetivo. Gracias a esta tcnica es posible usar preparados
opacos o espesos. Los microscopios de luz reflejada se usan con frecuencia en
la microscopa de fluorescencia o en la mineraloga.

Microscopio estereoscpico (microscopio ptico)

Los microscopios estereoscpicos son bsicamente microscopios de luz


reflejada. El preparado se suele iluminar desde la parte superior o inferior. La
mayora de los microscopios estereoscpicos permiten iluminar tambin desde
la parte inferior. Los microscopios estereoscpicos se diferencian de otros
microscopios en que disponen de dos entradas de luz separadas, que estn
ordenados en un ngulo determinado. Cada entrada de luz integra su propio
objetivo y ocular. Algunos microscopios estereoscpicos integran una lente de
aumento integrada delante del objetivo.

Microscopio de fluorescencia (microscopio ptico)

Aqu se suele excitar desde un colorante fluorescente en la muestra


mediante una luz con una determinada longitud de onda desde el exterior. El
colorante fluorescente emite la luz. Esa luz tiene una longitud de onda ms
larga que la luz excitada (SokesShift). En la trayectoria del rayo se puede
separar mediante filtros pticos la luz fluorescente de la luz excitada, y
reenviarla al ocular o la cmara. El lmite de resolucin de un microscopio de
fluorescencia puede estar muy por debajo de un microscopio ptico
convencional, lo que permite contemplar con precisin las estructuras de una
clula o los procesos de clulas vivas.

Microscopio confocal

Este tipo de microscopa es una forma particular de la microscopa


ptica o fluorescente. En este caso se escanea secciones pticas muy finas y se
compone una imagen tridimensional. Como cada seccin es una imagen muy
ntida, se consigue una imagen 3D muy bien enfocada.

Microscopio STED (Stimulates Emmision Depletion) (Microscopio de


fluorescencia)

Este tipo de microscopa es un mtodo ms reciente an de la


microscopa de fluorescencia, con la que se puede eludir el lmite de
resolucin definido por Abbe. La ventaja es que en comparacin con un
microscopio ptico convencional, el lmite de reproduccin es muy superior,
lo que permite enfocar con mucha nitidez detalles de estructuras. Con el
microscopio STED consigue una resolucin mejor que con un microscopio
lser convencional. En octubre de 2014, el investigador Stefan Hell fue
galardonado con el premio Nobel de la qumica por sus trabajos de
investigacin con el microscopio STED.

Microscopio Invertido

El microscopio invertido es un microscopio cuya estructura est


invertida en comparacin al microscopio convencional. La fuente de luz est
ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formacin
de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.

La microscopa invertida se usa con frecuencia en la hidrogeologa,


hidrobiologa y la medicina. Como el tipo de construccin conlleva que la
distancia entre el objeto y el objetivo sea bastante grande, esto hace posible la
contemplacin de preparados ms gruesos.
Microscopio electrnico
Dicho de forma muy sencilla, la microscopa electrnica usa haz de
electrones en vez de luz. Como ya se sabe, estos tienen una longitud de onda
mucho ms corta que la luz visible, por lo que se consigue una resolucin ms
alta en el rango de las estructuras atmicas. Existe una amplia variedad de
electrones. Aqu indicamos slo los tipos ms comunes.

Tipos de microscopa electrnica


Microscopio electrnico de transmisin (TEM)

En este caso un objeto es irradiado por electrones. Los microscopios


TEM (microscopios electrnicos de transmisin) son como los microscopios
de luz transmitida, donde la absorcin juega un papel importante. Actualmente
la resolucin que se consigue es de aprox. 0,05 nm.

Microscopio electrnico de barrido (REM), Scanning Elektron


Mcroscopy (SEM)

Aqu se dirige un haz de electrones finamente concentrado en una


retcula determinada sobre la prueba metalizada. Los electrones secundarios
(contraste) emitidos desde la superficie se miden como seal y se convierten
en una imagen ptica. Para alcanzar un haz de electrones ininterrumpido, la
medicin se realiza en una alto vaco.

Microscopio de fuerza atmica, Atomic Force Microscopy (AFM)

Este mtodo sirve para presentar una presentacin superficial. La


prueba es palpada en una retcula predefinida por una punta afilada sujetada a
un muelle de ballesta. Gracias a la fuerza nuclear, se mantiene constante la
distancia a la superficie. La deformacin del muelle de ballesta es captada por
la reflexin del haz de luz lser por un sensor ptico, y presentado por lneas.
Segn la rugosidad a comprobar, puede detectar diferencias en un rango de 0,1
a 10 nm.

Microscopio de efecto tnel, Scanning Tunnelling Microscopy (STM)


En la microscopa de efecto tnel se presenta la superficie mediante la
medicin del flujo de la corriente entre una punta conductora y la prueba que
es tambin conductora. Las pruebas que no sean conductoras deben ser
metalizadas con oro, grafito o cromo. Tambin en este caso se palpa la
superficie en una retcula predefinida.

Microscopio de rayos X

En la microscopa de rayos X se usan los rayos X como fuente de


radiacin. Gracias a que los rayos X tienen una longitud de onda es ms corta
con relacin a la luz, se obtiene una resolucin ms alta. Tambin puede medir
otras interacciones de la prueba a travs de los rayos X. Una gran ventaja de la
microscopa de rayos X es que las pruebas pueden ser ms gruesas que usando
microscopios electrnicos. Tampoco requiere que la superficie sea conductora,
colorear el material biolgico, usar un sustrato, ni cortar la prueba de forma
muy fina.

Campo de Visin
El campo de visin de un microscopio es la zona circular que se observa al
mirar la preparacin bajo un determinado aumento. El dimetro de este campo
es su medida. Para calcular lo que mide el campo de visin hay que seguir los
siguientes pasos:
1. Recorta un cuadrado de 1 cm de lado de papel milimetrado fotocopiado
en acetato.
2. Ponlo sobre el portaobjetos sin cubrir.
3. Enfoca con el objetivo de menor aumento hasta que se vea con claridad.
4. Mide el campo visual haciendo coincidir una de las lneas del papel
milimetrado con el borde del campo de visin. Cuenta el nmero de
milmetros que se ven y estima aproximadamente la fraccin sobrante,
si la hay. El resultado ser el dimetro del campo visual para ese
aumento (objetivo x ocular).
5. Para calcular el dimetro del campo de visin para aumentos mayores
hay que tener en cuenta que cuanto mayor sea el aumento, el campo
ser menor, es decir, se ver menos de la muestra que estemos
observando. De forma que, si el aumento es el doble, el campo ser la
mitad, si el aumento es el triple, el dimetro ser la tercera parte, etc.
(inversamente proporcionales).

Longitudes
Un microscopio compuesto usa una lente objetivo de longitud focal
muy corta, para formar una imagen
enormemente agrandada. Esta imagen se ve
luego con un ocular de longitud focal corta,
usado como una simple lupa. La imagen debera
formarse en el infinito, para minimizar la tensin
visual.

Lo fundamental es que la longitud del


tubo L sea grande comparada con cualquiera de
fo fe de modo que se mantengan las siguientes
relaciones.

En un microscopio real, la longitud L en el esquema de arriba es mucho mayor


que cualquiera de las longitudes focales de las lentes fo y fe.

Referencias:

https://www.mundomicroscopio.com