1) De qu molculas est compuesto el reactivo de Biuret?

Con qu elemento del

pptido reacciona el Cu+2 del reactivo de Biuret para dar la coloracin prpura
caracterstica?

El reactivo de biuret est compuesto por:

- Sulfato cprico (CuSO4)

- Tartrato sdico potsico (KNaC4H4O64H2O)
- Ioduro de potasio (KI)
- Hidrxido de sodio (NaOH)

Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una solucin de
protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de
una coloracin violeta-prpura, bajo condiciones alcalinas.

Permite la determinacin de protenas totales y albmina srica. El fraccionamiento salino

separa la albmina de las globulinas.

2) Describa otros mtodos existentes para la determinacin y cuantificacin de

protenas}

1. Mtodo de Lowry mtodo colorimtrico

Este mtodo consta de dos etapas:
a) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un
color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional
de la protena, exponindose los residuos fenlicos de Tyr que van a participar en la
segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su
complejo con tartrato.
b) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenlicos de los residuos de Tyr, presentes en la mayora de las protenas, actuando el
cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el
cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos
fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso. El color azuloso desarrollado es
 ledo a 750 nm (alta sensibilidad para una concentracin proteica baja) o a 500 nm (alta
sensibilidad para una concentracin proteica alta).

2. Precipitacin de protenas por adicin de aniones y cationes mtodo cualitativo

Toda protena, si se encuentra en una solucin a un pH por debajo de su punto
isoelctrico, tiene carga positiva y reacciona con aniones de cidos. La ovoalbmina
tiene un pinto isoelctrico alrededor de 4,7. Si a una solucin de esta protena se le
agrega un cido, como el pcrico o el tricloroactico, el pH disminuye y los aniones (el
pricrato o el tricoloroacetato) reaccionan con la ovoalbmina, el producto es insoluble
en la solucin y precipita.
Por el contrario, si la protena se encuentra en una solucin a un pH mayor de su punto
isoelctrico, tiene carga negativa y, en este caso, reacciona con cationes de metales, el
producto (un proteinato del catin) tambin precipita.

3. Mtodo de Kjeldahl
Fue creado por Johann Kjeldahl en 1883. Tiene como objetivo determinar la cantidad de
nitrgeno en ciertos compuestos orgnicos. Permite la determinacin de protenas
totales y albmina srica. Consta de tres pasos:
a) Digestin. Se realiza con H2SO4 mediante adicin de permanganato para completar la
oxidacin y conversin del nitrgeno a sulfato de amonio. Este se forma por la reaccin
del nitrgeno y del cido sulfrico. Durante la digestin se libera el nitrgeno proteico
para formar iones de amonio. El cido sulfrico oxida la materia orgnica y se combina
con el amonio formado.
b) Neutralizacin y destilacin. La muestra digerida se diluye con agua. Se aade el lcali
que contiene tiosulfato de sodio para neutralizar al cido sulfrico. El amonaco formado
se destila en una solucin de cido brico que contiene los indicadores azul de metileno
y rojo de metilo.
c) Titulacin. El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) se titula con HCl
estandarizado.
4. Precipitacin de protenas por adicin de sales
Se basa en la solubilidad o insolubilidad de las protenas en una solucin de sulfato de
amonio. La sal extrae el agua unida a las protenas y, por tanto, estas precipitan al perder
solubilidad.

La albumina presente en el plasma, en la clara de huevo y en muchos fluidos biolgicos

puede ser separada de las otras protenas (globulinas) ya que la albumina precipita
nicamente si la solucin en la que se encuentra es saturada con sulfato de amonio,
mientras que las globulinas precipitan cuando la solucin se encuentra en un 50% (m/V)
de concentracin en sulfato de amonio.

5. Determinacion cuantitativa de protenas por medio del ndice de formol

El formaldehdo concentrado concentrado sustituye a uno o a los dos H del grupo NH
para formar derivados monos o dimetilados. El bloqueo de la funcin amina permite
una titulacin con lcali de las funciones cidas as creadas.

6. Mtodo de electroforesis
La gran mayora de los polmeros biolgicos presentan cargas elctricas; dentro de ellos
estn las protenas, por lo que pueden ser consideradas como polianfolitos dbiles. Las
cargas derivan de los aminocidos con grupos laterales ionizables. Estos son: los
residuos bsicos de asparagina (Asn, N), lisina (Lys, K) e histidina (His, H) y los residuos
cidos del cido glutmico (Glu, E) y asprtico (Asp, D). Las cadenas laterales de tirosina
tambin contribuyen a la carga total de la protena. Debido a que estos grupos
presentan diferentes grados de ionizacin, la carga neta de las protenas es muy
dependiente del pH del medio. Las modificaciones postraduccionales, como
fosforilacin y glicosilacin, tambin le aportan carga a las protenas.
Al someter molculas cargadas a un campo elctrico, estas migran a favor de un
gradiente elctrico en la solucin cuando se aplica un flujo electromagntico dentro de
esta. Ese fenmeno se conoce como electroforesis.

La velocidad de migracin depende de la carga, tamao y forma de las partculas. Esto

permite separar componentes de una mezcla compleja, siempre y cuando presenten
velocidades de migracin lo suficientemente diferentes. Puede ser sobre papel,
almidn, silogel, agar, acrilamida. A pH isoelctrico permite la determinacin del peso y
pureza de las enzimas.

En la realidad, la separacin de macromolculas ocurre en soluciones acuosas que

contienen, adems de la macromolcula de inters, los iones constituyentes de las
soluciones tampones y sales. En este caso, no se estudia la macromolcula sola sino en
presencia de otras especies cargadas que influenciarn el campo local, adems de
interaccionar con la macromolcula, lo que genera una capa de contraiones y se dificulta
su anlisis.
En consecuencia, la definicin de movilidad electrofortica, para el caso ideal de una
partcula cargada, en una solucin diluida de un solvente no conductor, es solo una
aproximacin al comportamiento de una macromolcula en condiciones reales. A pesar
de los esfuerzos realizados para introducir correcciones a esta ecuacin solo se han
logrado aproximaciones.
Las tcnicas electroforticas son utilizadas para separaciones efectivas y resolucin de
mezclas de protenas para su posterior anlisis y caracterizacin, as como para
controles de pureza.
Las protenas individuales, con excepcin de la albmina, generalmente no se miden;
sin embargo, s se miden las fracciones o grupos de protenas. Los niveles de las
fracciones se pueden calcular, aproximadamente, mediante las mediciones de la
protena srica total y multiplicada por el porcentaje relativo de cada fraccin de la
protena del componente.

Mediante esta tcnica las protenas son separadas en bandas de distinta migracin. Este
fraccionamiento proteico es medible acoplando la electroforesis a un densitmetro,
obteniendo de esta forma el proteinograma que permite la cuantificacin de cada una
de las protenas especficas del plasma.
En su desarrollo influirn la carga elctrica neta de cada molcula, su tamao y forma,
la fuerza del campo elctrico, las propiedades del medio, as como la fuerza inica que
determina el radio de la nube en torno a la molcula y la temperatura de la prueba. Una
vez separadas, las bandas se tien con colorantes (azul de bromofenol o azul de
Coomassie).
Normalmente, las protenas plasmticas se separan en cinco bandas: albmina, a1, a2, b
y g globulinas.
Las a1-globulinas: a1-antitripsina, a1-lipoprotena, a1-glicoprotena.
Las a2-globulinas: a2-macroglobulina, a2-lipoprotena, haptoglobina y ceruplasmina.
Las b-globulinas: b-lipoprotena, transferrina, plasmingeno, protenas del
complemento.
Las g-globulinas: que son los llamados anticuerpos; sirven para la defensa especfica
(IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).
Los intervalos de referencia de las protenas plasmticas en un proteinograma se
muestran en la tabla siguiente:
 Proteinograma normal del suero

3) Cmo funciona el reactivo de Bradford?

Esta unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del
colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul
Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul.
La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente
se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).

Estructura qumica del colorante Coomassie brilliant blue G-250.

Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo

La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y aromticos.

 El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas.
La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo permanece
estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso
muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la
automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como potasio y
carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los
agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la utilizacin de buffers).
Los nicos componentes encontrados que dan una excesiva interferencia en el color del
ensayo, son altas concentraciones de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.
REFERENCIAS

- DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS METODO DE BIURET

https://es.slideshare.net/melitoc1/determinacion-de-proteinas-por-el-metodo-de-
biuret-2?qid=8e7a6e1b-bbe4-4e1d-a890-881fa8d591d7&v=&b=&from_search=1
- Total protein - inserto. Linear Chemicals
http://www.linear.es/ficheros/archivos/66_1153005C.pdf
- Mtodos para el anlisis de protenas
http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA3PROTEINASalumno.pdf
- Valoracin de protenas por el mtodo de Lowry
http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf
- Quesada Mora, S. Manual de experimentos de laboratorio para Bioqumica, Editorial
EUNED, pp. 26 34.
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