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Marcadores moleculares de ADN y su aplicacin en frutales.

Autores: Juliette Valdes-Infante Herrero y Narciso N. Rodrguez.
Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical.

Introduccin:

Los marcadores genticos han sido ampliamente empleados para asistir en el manejo y el
mejoramiento de los cultivos agrcolas. La primera fuente de marcadores fueron las variantes
morfolgicas, que tienen patrones Mendelianos simples de herencia. En los inicios del siglo 20, la
transmisin de los marcadores morfolgicos fue usada para monitorear la pureza de la semilla y
para establecer grado de parentesco en cruces particulares. Desgraciadamente, estos marcadores
tienen varias desventajas significativas. Primero, muy pocos estn disponibles para asistir el
mejoramiento de la mayora de las cosechas. Segundo, muchos confieren algunas desventajas
fenotpicas y su transmisin en los cultivares puede ser no deseada. Finalmente, la mayora son
recesivos, lo cual limita grandemente su utilidad (Clegg y colaboradores, 1999).
En los 60, la invencin de la tcnica de isoenzimas proporcion una nueva y rica fuente de
marcadores genticos. Las isoenzimas presentan varias ventajas para los genetistas de las cosechas:
primero, son marcadores codominantes y por tanto proporcionan mucha ms informacin acerca de
los patrones de transmisin gentica; segundo, las diferentes variantes aloenzimticas (formas
allicas de las isoenzimas) no parecen conferir ninguna propiedad desventajosa en la planta de
cultivo y tercero, es posible desarrollar desde 10 hasta 20 marcadores isoenzimticos para la
mayora de las especies cultivables sin gran dificultad. No obstante estas ventajas, este mtodo est
limitado por un nmero relativamente pequeo de loci marcadores potenciales y por niveles
modestos de polimorfismo.
En los inicios de los 80, la rpida elaboracin de la Biologa Molecular comenz a producir nuevas
fuentes de marcadores genticos. La primera fuente fueron los polimorfismos de longitud de
fragmentos de restriccin (FRLPs), seguido por los ADNs polimrficos amplificados
aleatoriamente (RAPD), seguido por los microsatlites secuencias simples repetidas (SSR) y por
los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP). Cada uno de estos mtodos
represent una mejora sobre los anteriores. Todas estas tcnicas basadas en el ADN pueden
producir un nmero virtualmente ilimitado de loci marcadores y es esto lo que los hace tan
poderosos (Clegg y colaboradores, 1999 ).
Las principals diferencias entre estos mtodos son si este es basado en la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR), como es el caso de los RAPD, SSR y AFLP basado en transferencias Southern
(RFLP) (Clegg et al.,1999; Valadez y Kahl, 2000); si son codominantes (RFLP, SSR, AFLP) o
recesivos (RAPD ) y en el costo de desarrollar los reactivos de los marcadores (por ejemplo, los
cebadores para los SSR, los fragmentos clonados para los RFLP, etc).
Estos marcadores permiten visualizar diferencias tangibles entre las secuencias homlogas del ADN
de los organismos. Esas diferencias resultan de cambios o rearreglos entre los pares de bases que
conforman este tipo de molcula, tales como: translocaciones, inversiones, inserciones o deleciones
en regiones homlogas. Detectan variaciones directas a nivel del ADN y tienen ventajas tales como
el hecho de ser dominantes o codominantes, de desarrollarse de manera estable, de carecer de
efectos pleiotrpicos y sobre todo, de no estar sujetos al ambiente en donde se desarrolla el
organismo en estudio, principalmente. Las propiedades mencionadas hacen que estos sean
extremadamente tiles, comparados con los anlisis a escala morfolgica o de protenas (del tipo de
las isoenzimas).
Para obtener marcadores de ADN se usan diferentes mtodos que se pueden agrupar de manera
convencional en tres categoras. La primera categora se basa en la tcnica conocida como
hibridacin tipo Southern. Esta tcnica tiene el propsito de explorar las variaciones en la
longitud de los fragmentos de ADN, ocasionados por la restriccin del genoma con alguna
endonucleasa particular. En esta categora se incluye a los RFLP y los VNTR (Restriction Fragment
Length Polymorphism y Variable Number of Tandem Repeats).
La segunda categora agrupa las metodologas basadas en la tecnologa de la Reaccin de
Polimerizacin en Cadena o PCR (Polymerase Chain Reaction). Esta tecnologa utiliza secuencias
de oligonucletidos que inician la sntesis in vitro de fragmentos de ADN de longitudes variables.
Estas secuencias iniciadoras pueden ser aleatorias, semialeatorias o especficas, con las cuales ha
sido posible caracterizar genomas de diferentes organismos, detectar y aislar genes, e incluso,
diferenciar organismos relacionados genticamente. Para esta tecnologa ,se pueden citar por
ejemplo, las metodologas que generan los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AP-
PCR (Arbitrarily Primed PCR), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AFLP(Amplified
Fragment Length Polymorphism), entre otras.
La tercera categora involucra metodologas que combinan la PCR o sus productos de ADN ms la
hibridacin tipo Southern. Por ejemplo la tcnica de RAHM (Random Amplified Hybridization
Microsatellites) o llamada tambin RAMPO(Random Amplified Microsatellite Polymorphism),
requiere de la sntesis previa de ADN con cualquiera de las metodologas de la PCR y la posterior
hibridacin con alguna sonda que detecte microsatlites (Valadez y Kahl, 2000).
Para cualquier problema bajo investigacin, es la naturaleza de ste la que debe determinar el
mtodo de anlisis. No siempre el ms moderno es el mejor o la forma ms efectiva para tratar el
problema.
Marcadores Genticos de ADN

Marcadores basados en la hibridacin tipo Southern.

Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP).

Los marcadores de ADN son secuencias genmicas localizadas en un mismo locus pero que
difieren en su secuencia de bases nitrogenadas. Esas variaciones, como ya se mencion, son
consecuencia de varios eventos de mutaciones que se manifiestan en los genomas que se comparan.
Par detectar algunas de estas mutaciones se utiliza la tcnica denominada RFLP. Esta tecnologa
expresa diferencias en sitios especficos del ADN que fueron reconocidos por enzimas de
restriccin particulares (endonucleasas).
Cada una de las numerosas endonucleasas, cuyo origen es bacteriano, reconocen y cortan solamente
una secuencia especfica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando estas no estn
protegidas (metiladas); pero si la adenina o la citocina en esas secuencias estuvieran metiladas,
entonces el corte no podra realizarse por la enzima involucrada.
Considerando lo anterior, cualquier otro ADN que no estuviera metilado, podra ser reconocido y
cortado en fragmentos de longitud definida; y cualquier mutacin dentro de esos sitios, podra
cambiar el patrn del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al comparar dos o ms genomas
(Valadez y Kahl, 2000).
Para la deteccin de los RFLPs, en primer lugar, es necesario aislar el ADN del organismo de
inters, purificarlo y cortarlo con una o ms endonucleasas de restriccin. Los fragmentos
resultantes se separan en un gel de agarosa por elctroforesis y se transfieren a una menbrana que
puede ser de nailon o de nitrocelulosa (Southern blotting). La subsecuente hibridacin con alguna
sonda marcada y deteccin con autorradiografa, luminografa o quimioluminiscencia (dependiendo
del tipo de marcaje) har visible un fragmento de ADN especfico, que puede ser comparado con el
fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma forma.
Las sondas que se utilizan para RFLPs se obtienen de fragmentos de ADN nuclear, de organelos, o
bien de secuencias transcriptas como es el caso de ADN complementario (ADNc).
El grado de polimorfismo detectado con RFLPs, difiere ampliamente entre las especies de plantas
dependiendo de la sonda utilizada. Por ejemplo las sondas de copia nica revelan un amplio grado
de polimorfismo en maz y col, mientras que en especies como el cacahuete, frijol, chcharo y
meln, no se detecta una variabilidad amplia.
Entre las caractersticas de los RFLPs se encuentran su omnipresencia debido a que puede estar en
todos los tejidos, su naturaleza codominante, que presentan una herencia mendeliana simple, el
nivel de polimorfismo que detectan es alto ya que son capaces de detectar variantes allicas. El
nmero de loci que detectan es de 1-3, presentan una dificultad tcnica intermedia, laconfiabilidad
es alta. Otro elemento a destacar es que requieren DNA relativamente puro en concentraciones de 2-
10g y utilizan radioistopos (Waugh y Powell, 1992).
Generalmente, los RFLPs sirven como marcadores moleculares que se han utilizado para construir
mapas genticos con seleccin asistida por marcadores, para la clonacin de genes basados en
mapas para la identificacin de cultivares, o para ayudar a resolver problemas de ndole taxonmica
o filogentica.
Los RFLPs brindan patrones altamente reproducibles pero las variaciones en las longitudes de los
fragmentos entre individuos o especies aparecen, ya sea cuando las mutaciones alteran el sitio de
restriccin o como resultado de una insercin/delecin entre ellos. Sus principales limitaciones
tcnicas son las siguientes: se necesita un buen suministro de sondas; los pasos de hibridacin y
secado son consumidores de tiempo y difciles de automatizar y se requieren cantidades suficientes
de ADN de buena calidad (10g por digestin), por lo que no son aplicables donde se dispone de
una cantidad muy limitada de fuente de material o tejido preservado (Karp y colaboradores, 1996).
Adems solamente se detecta una fraccin de la variabilidad de secuencias existentes en el genoma;
es decir, su informacin es limitada (Valadez y Kahl, 2000).
Sin embargo, los RFLPs clsicos que aqu se describen estn actualmente fuera de moda, debido a
que su deteccin es muy laboriosa y costosa. En su lugar los reemplazan otras tcnicas que tambin
estn basadas en la variacin de la secuencia de los sitios de reconocimiento de las endonucleasas
de restriccin. Una de esas tcnicas explora, por ejemplo, la presencia de cantidades considerables
de DNA repetidas y distribudas en el genoma de los eucariontes, usando sondas de microsatlites.
Este tipo de oligonucletido revela un alto grado de polimorfismo en un amplio espectro de plantas,
incluyendo aquellas en las que la deteccin es pobre con el uso de sondas de copias nicas; e
incluso es posible distinguir diferencias individuales, por lo que pueden utilizarse para estudios de
huellas genmicas.
La complejidad tcnica de la ejecucin del anlisis FRLP unido al amplio uso de radioistopos de
corta vida en el mtodo de deteccin, ha puntializado un debate acerca de si es factible la aplicacin
rutinaria de los FRLPs en programas de mejoramiento de las cosechas a gran escala (Waugh y
Powell, 1992).
La tcnica RFLP ha sido utilizada, por ejemplo, en el mejoramiento del aguacatero. La aplicacin
de una batera de sondas RFLP a las preparaciones de 3 lneas tolerantes a la pudricin de las races
causada por Phytophthora cinnamomi, permiti la diferenciacin entre estas, ya que cada lnea pudo
ser identificada con un nico genotipo (Clegg y colaboradores, 1999); poniendo de manifiesto la
utilidad de esta tcnica para la identificacin de individuos como se coment anteriormente. Se ha
demostrado tambin su importancia en la identificacin de cultivares de mango, donde se
obtuvieron patrones especficos para cada cultivar, al ser el ADN genmico digerido con Hind III o
Dra I (Adato y colaboradores, 1995).
Este mtodo es tambin aplicable a estudios sobre relaciones genealgicas del cultivo del aguacate,
donde se obtuvieron se pudo distinguir entre todos los cultivares estudiados y al hacer un anlisis
de agrupamiento con estos datos, se obtuvieron 3 grupos correspondientes con las 3 clases
botnicas del aguacate ms dos grupos adicionales que parecen representar los cultivares con un
origen hbrido intervarietal (Clegg y colaboradores, 1999).
Dentro de esta misma lnea existen reportes sobre su uso en la taxonoma y la filogenia del
germoplasma de las especies del gnero Musa (pltano)(Crouch y colaboradores, 1998); as como la
variacin cloroplstica dentro del gnero (Crouch y colaboradores, 1998). Asimismo, est tambin
su empleo para estudios evolutivos y taxonmicos en Citrus y otras especies (Deqiu y
colaboradores, 1998) y en el establecimiento de las relaciones filogenticas entre 13 especies de
Mangifera con 20 endonucleasas de restriccin, de las cuales solo 4 revelaron 8 sitios informativos
de mutacin que permitieron clasificar las especies en dos grupos.
Las especies pertenecientes al mismo grupo son monomrficas para la digestin con todas las
enzimas probadas. El estudio permiti conocer la baja diversidad en la regin amplificada de
ADNcp entre las especies analizadas (Eiadthong y colaboradores, 1999).
Es importante destacar tambin su utilidad en estudios de diversidad molecular, como por ejemplo,
en el caso de la pia (Ananas comosus (L.) Merr), donde se analizaron un grupo de accesiones y los
resultados obtenidos mostraron que la variacin dentro del gnero Ananas parece ser continua y se
da fundamentalmente a nivel intraespecfico. Adems, se evidenci la existencia de flujo de genes
(Duval y colaboradores, 2001). Tambin est el caso de su uso, con este mismo objetivo, en el
germoplasma dentro y entre E.oleifera , con accesiones que son representaciones del rea geogrfica
de distribucin de sta. Los resultados mostraron una fuerte estructura relacionada con el origen
geogrfico. Este estudio permiti poner de manifiesto la confiabilidad de esta tcnica ya que los
resultados obtenidos tuvieron un alto grado de correspondencia con los revelados por la tcnica
novel de AFLP (Barcelos y colaboradores, 1998).
Esta correspondencia de resultados tambin se observ en el anlisis de las relaciones filogenticas
dentro del gnero Citrus, pero esta vez con la tcnica RAPD, donde los resultados fueron similares
en su gran mayora (Deqiu y colaboradores, 1998).
No obstante, no siempre los resultados son satisfactorios, como en la determinacin de la
variabilidad gentica de accesiones trifoliadas (Poncirus trifoliata), donde tanto las isoenzimas
como los RFLPs detectaron un polimorfismo muy bajo, mientras que con otra tcnica adicional
(ISSR) mostraron un polimorfismo mayor (Deqiu y colaboradores, 1997). Por esto, en ocasiones,
cuando pueda existir alguna duda, es necesario la aplicacin de varias tcnicas para corroborar los
resultados y que estos sean, por tanto, confiables.

Repeticiones en Tandem de Nmero Variable (VNTR)

Otra tcnica poderosa para el estudio de la diversidad utiliza regiones hipervariables del genoma
que comprenden secuencias simples repetidas en tandem. Estas repeticiones varan en el nmero (y
por tanto en su longitud) y son generalmente llamadas VNTR, aunque es utilizado el trmino
microsatlite (SSR) minisatlites cuando la unidad bsica repetida est alrededor de las 2-8 pares
de bases (pb) de longitud o mayor respectivamente. Los minisatlites se caracterizan adems, por
contener regiones ricas en GC, que con frecuencia hibridan entre especies diferentes (Valadez y
Kahl, 2000). Ambas categoras de DNA pueden estar presentes en cualquier sitio en el genoma
(Karp y colaboradores, 1996; Valadez y Kahl, 2000).
Cuando se hibridiza al DNA sondas de oligonucle tidos sintticos que contienen estas repeticiones,
se producen usualmente perfiles multibandas. Estas huellas VNTR son altamente discriminativas
generalmente y son utilizadas a menudo para distinguir variedades o incluso individuos y revelan
parentesco e identidad.
Aunque los VNTR pueden estar en varios sitios del genoma, las secuencias flanqueadoras en estos
sitios pueden ser nicas. Si un VNTR individual es clonado, se pueden obtener cebadores de estas
regiones flanqueadoras, convirtindose entonces el VNTR en un sitio de secuencia marcada (SSR).
Los minisatlites son ms difciles de utilizar en este sentido debido a su tamao (Karp y
colaboradores, 1996).

Las repeticiones de secuencias simples microsatlites, son intervalos de ADN con unidades penta,
tetra, tri, di o mononucleotdicas repetidas en tandem (Crouch y colaboradores, 1998; Powell y
colaboradores, 1996), que estn dispuestas en todo el genoma de la mayora de las especies
eucariticas.
La frecuencia relativamente baja de stos en el genoma de las plantas (una repeticin mayor que los
20pb ocurre cada 33Kb en el genoma nuclear de las plantas comparado con cada 6Kb en los
mamferos), presenta problemas tcnicos para el aislamiento de los SSR a gran escala.
Adicionalmente, los dinucletidos A-T, los cuales son el tipo de SSR ms abundante en las plantas,
son difciles de aislar de las libreras debido a que son polindrmicos (la secuencia es la misma
cuando una cadena es leda de izquierda a derecha o la otra de derecha a izquierda).
Weber y May (1989) desarrollaron una aproximacin general para la deteccin de microsatlites
polimrficos: el polimorfismo es revelado por amplificacin del ADN genmico, usando dos nicos
cebadores que flanqueen, y por tanto definan el locus microsatlite. Los productos amplificados
sern revelados en geles.
Los mtodos estndar para el aislamiento de los SSR involucran: la creacin de una pequea
librera genmica; el escreaning de la librera por hibridacin; la secuenciacin de los clones
positivos; designacin del cebador y anlisis de la PCR locus especfica e identificacin de los
polimorfismos (Powell et al., 1996; Crouch y colaboradores, 1998).
Los mtodos de enriquecimiento preclonaje involucran la fragmentacin del ADN genmico por
sonicacin o digestin con endonucleasas y la creacin de fragmentos de ADN con secuencias
definidas en ambos extremos. Esto puede lograrse por ligazn de adaptadores con el uso de
cebadores no especficos y anlisis de la PCR. Los fragmentos que contienen microsatlites son
enriquecidos por hibridacin a un SSR de corta longitud biotinilado y una seleccin subsecuente
enbolitas magnticas cubiertas con estreptovidina (Powell y colaboradores, 1996).
El aislamiento de los SSR a pasado a ser una tcnica ms rutinaria con la disponibilidad de
facilidades de secuenciacin del ADN automatizadas y las mejoras en las tcnicas para la
construccin de libreras genmicas enriquecidas con SSR y en las del escreening de los clones
apropiados (Crouch y colaboradores, 1998).
La variaci n en los SSRs resulta de diferencias en el nmero de unidades repetidas. Se piensa que
estas diferencias son causadas por errores en la replicacin del DNA (Crouch y colaboradores,
1998), o sea, la DNA polimerasa se desliza cuando est copiando la regin repetida, cambiando el
nmero de repeticiones (Jarne y Lagoda,1996). Es probable que los cambios grandes en el nmero
de repeticiones son producto de procesos tales como una recombinacin desigual (Strand y
colaboradores, 1993). Tales diferencias son detectadas en geles de poliacrilamida, donde migran
diferentes distancias de acuerdo a su tamao.
Los SSrs han pasado a ser marcadores muy atractivos en el mejoramiento molecular y la valoracin
de la diversidad (Rivera y colaboradores, 1999).
La primera aplicacin de los SSRs en las plantas ha sido en la identificacin de los cultivares, donde
estos han sido empleados para genotipar inequvocamente, material tan diverso como uva y soja
(Powell y colaboradores, 1996).
Otra aplicacin es en la determinacin del hibridismo. Para este propsito, la naturaleza
codominante de los SSR es particularmente importante y brinda la contribucin allica de cada
parental para ser detectada en hbridos somticos o sexuales (Powell y colaboradores, 1996).
Una de las principales razones par desarrollar microsatlites es su uso potencial como marcadores
diagnstico para caracteres importantes en programas de mejoramiento de plantas. Se ha publicado
recientemente el primer ejemplo de un SSR ligado a un gen de resistencia a enfermeda des en
plantas (35). Una repeticin (A-T)13, localizada dentro del gen que codifica para una protena de
shock trmico de la soja, est a 0.5 centimorgan (cM) de Rsv, el cual es el gen que confiere
resistencia al virus del mosaico de la soja.
Se ha pensado que los SSRs son las nuevas aloenzimas, ya que detectan variacin al nivel de loci.
Por esto muchos de sus usos han sido donde anteriormente se han empleado aloenzimas. Dentro de
los ejemplos estn los estudios de diversidad (Rosetto y colaboradores, 1999), flujo de genes y
sistemas de cruzamientos (Chase y colaboradores, 1996) y anlisis de paternidad (Streiff y
colaboradores, 1999). Rosetto y colaboradores(1999) estudi el fraccionamiento de la variacin
dentro y entre las poblaciones de Melaleuca alternifolia (Myrtaceae) para facilitar la identificacin
de recursos genticos y para asistir en la conservacin de la diversidad gentica.
Muchos estudios de SSRs parecen ser extensiones de grupos que han sido estudiados usando
marcadores bioqumicos o moleculares. El estudio de Rosetto y colaboradores (1999) sobre la
estructura gentica en Melaleuca alternifolia , es una extensin del estudio con aloenzimas de
Butcher y colaboradores(1992), aunque Rosetto y colaboradores(1999) usaron un nmero mayor de
individuos y poblaciones. Otros estudios han sacado partido de la alta variabilidad de los SSRs para
reestudiar especies en las cuales otros mtodos han encontrado poca o ninguna variacin.
Muchos estudios iniciales con SSRs han sido confinados a un nico taxa, o sea, al taxon por el cual
fueron desarrollados. La razn de esto parece ser debido a la conocida incapacidad de los cebadores
SSRs de amplificar DNA en especies diferentes a la cual ellos fueron diseados; lo cual puede ser la
causa de por qu se ha publicado tan pocos estudios de sistemtica usando SSRs. La capacidad de
usar el mismo cebador SSR en diferentes especies de plantas depender de cun conservado est el
sitio flanqueador del SSR entre las taxas relacionadas y la estabilidad de los SSR en el tiempo.
Algunos estudios han indicado que los cebadores SSRs pueden amplificar la misma regin SSR en
taxas relacionadas muy estrechamente (Powell y colaboradores, 1996). Por ejemplo, White y
Powell (1997) examinaron Meliaceae usando cebadores designados para Swietenia humulis (White
y Powell, 1997b). Ellos fueron capaces de amplificar DNA en 7 de los 11 loci microsatlites en
otras especies de Swietenia, 6 loci en otros gneros de la misma raza y 4 de 6 loci en especies de la
misma familia. Esto ha estim ulado el desarrollo de algunos estudios filogenticos. Por ejemplo,
Mhameed y colaboradores(1997) estudiaron las relaciones entre el aguacate (Persea americana
Mill) y especies de Persea silvestres y present un rbol filogentico usando el mtodo de
parsimonia.
El valor de los microsatlites se desprende de su naturaleza multiallica, debido a la alta
probabilidad de mutacin que estos loci presentan (Karp y colaboradores, 1996; Morgante y
Olivieri, 1993); transmisin codominante, fcil deteccin por la PCR, relativa abundancia,
cobertura extensiva del genoma y requerimiento de solo una pequea cantidad de ADN iniciador
(Powell y colaboradores, 1996) Adems brindan perfiles altamente reproducibles (Karp y
colaboradores, 1996) y confiables (Powell y colaboradores, 1996).
Como los AFLPs, la mayor ventaja de los SSRs es el gran nmero de polimorfismo que revelan
(Morgante y Olivieri, 1993; Powell y colaboradores, 1996). Adems, la capacidad del mtodo de
diferenciar individuos cuando se examina una combinacin de loci, hace que la tcnica sea muy til
para experimentos de flujo de genes, identificacin de cultivares y anlisis de paternidad (Hokanson
y colaboradores, 1998). Debido a que solo examinan un loci por vez, no son directamente
comparables con los AFLPs. La comparacin debe ser con marcadores a nivel de loci como RFLPs
e isoenzimas. Por ejemplo, Rosetto y colaboradores(1999) encontr uhn valor de heterocigosidad
observada mucho mayor utilizando SSRs en Melaleuca alternifolia que el obtenido con aloenzimas
(Butcher y colaboradores, 1992). McCouch y colaboradores(1997) compar el nmero de alelos
revelado por RFLPs y por loci SSR en arroz (Oryza sp) y encontr de 2 a 25 alelos por loci SSR
comparado con de 2 a 4 por loci RFLP.
Distinto a los AFLPs, los SSRs son codominantes, por lo que el heterocigoto puede ser identificado
confiablemente. Esta caracterstica incrementa la eficiencia y la exactitud de las medidas de la
gentica poblacional comparado con otros marcadores como AFLP y RAPD. Adems, la identidad
de los heterocigotos en la generacin F1 hace ms simples los anlisis de flujo de genes, hibridacin
y paternidad (Schltterer y Pemberton, 1994). Otra de las ventajas es que se puede utilizar material
de hoja seca.
Entre sus desventajas ms importantes cabe sealar la necesidad del uso de la clonacin y la
secuenciacin, as como de geles de alta resolucin (Powell y colaboradores, 1996).
Los problemas que se pueden presentar con esta tcnica se pueden dividir en tres categoras:
prcticos (a), de datos (b) y de anlisis (c).
(a)
.1 Escreening para los SSRs.
A menos que se hayan diseado cebadores tiles en estudios anteriores, es necesario escrinear un
organismo en busca de los SSRs. Existen muchas formas diferentes de hacerlo. Todas son
complejas en lo referente a la manipulacin y caras, y pueden producir solo un pequeo nmero de
loci SSR potenciales.

.2 Deslizamiento.
Esto puede ser un problema significativo cuando se analizan repeticiones mono y dinucleotdicos
(Ciofi y colaboradores, 1998). Durante el proceso de amplificacin, la termopolimerasa puede
deslizarse, conllevando a la formacin de productos de tamao diferentes (Ciofi y colaboradores,
1998) que difieren de 1 a 5 unidades repetitivas aproximadamente del producto esperado. Tales
productos son usualmente menos intensos que el producto deseado, de forma tal que en la prctica
puede ser desestimado generalmente. Sin embargo, si el producto de un individuo heterocigoto se
solapa, entonces algunas veces es difcil diferenciar el producto verdadero y el deslizado (Ciofi y
colaboradores, 1998)

.3 Problemas prcticos adicionales.

La identificacin inexacta de un alelo puede ser causada por la tendencia de la Taq polimerasa de
adicionar un nucletido de adenosina al extremo 3 del producto amplificado (Ciofi y
colaboradores, 1998). La adicin se determina por un mtodo templado-especfico o marcador
especfico, lo cual puede no ser un problema si el nucletido extra est adicionado siempre o nunca.
Sin embargo, pueden aparecer errores en la determinacin del tamao si este nucletido es
adicionado solo ocasionalmente.

(b)
.1 Homologa.
Este es el mayor problema que enfrenta el uso de los SSR en los anlisis de filogenia. Los SSRs
asumen que los fragmentos co-migrantes son homlogos, existiendo solo unas pocas razones a
priori para asumir esto.Adems, la no-homologa puede dividirse en aquellas que ocurren dentro de
las regiones flanqueadoras de los SSRs y las de las regiones SSR repetidas.
Varios estudios han secuenciado SSRs amplificados para probar la homologa y los mecanismos de
mutacin SSR (Blanquer-Maumont y Crouau-Roy, 1995; Grimaldi y Croau-Roy, 1997; Buteler y
colaboradores, 1999). Blanquer-Maumont y Croau-Roy (1995) secuenciaron los SSRs que
amplificaron en humanos y en contraron variaciones en las regiones flanqueadoras no repetidas. La
variacin const tanto de mutaciones puntuales como de indels. Las primeras no cambian la
longitud del producto de SSR pero las segundas s, causando probablemente malinterpretaciones.
Por ejemplo, Grimaldi y Crouau-Roy (1997) secuenciaron todos los alelos de la repeticin (CA)n en
humanos y encontraron ambas cosas en la regin flanqueadora del SSR. Ellos encontraron una
insercin de 6pb en esa regin. Esta mutacin pudiera posiblemente causar una mala identificacin
de los alelos si solo se mide el tamao de estos, o sea, el alelo (CA)20, que contiene la insercin,
pudiera co-migrar con el alelo (CA)23 que no la tiene (Grimaldi y Crouau-Roy, 1997).
Buteler y colaboradores(1999), en su caracterizacin de papas dulces diploides y poliploides
(Ipomea trifida e I.batatas ), encontr tanto mutaciones como indels en una proporcin mayor que
en los humanos, por lo cual sugiri que se deben tomar precauciones cuando se cuenta
exclusivamente con el tamao de la banda en la interpretacin de los polimorfismos de longitud
SSRs.La inclusin de estos fragmentos no homlogos en el anlisis probablemente provocarn un
sesgo en los resultados y rompern con las suposiciones del anlisis filogentico.
Ujino y colaboradores(1998) sealaron otro problema con la homologa que se presenta cuando se
analizan repeticiones compuestas. Si se considera un SSR con secuencia 5-(CT)10CA(CT)8-3 y
un segundo alelo es 2pb mayor y no est secuenciado; es imposible decir cul repeticin increment
en tamao (5-(CT)11CA(CT)8-3 5-(CT)10CA(CT)9-3). Uno pudiera esperar un porcentaje
mayor de fragmentos no homlogos si la repeticin analizada es compuesta. Esto fue reconocido
cuando Ujino y colaboradores(1998) recomendaron que deben usarse repeticiones simples
solamente, con el objetivo de limitar errores en la identificacin de los genotipos.
La tercera y ms problemtica incertidumbre en la homologa es dentro de la unidad repetida. Esto
es, si dos fragmentos que co-migran son idnticos por descendencia o por estado. Asumiendo que el
modelo de mutacin paso a paso (SSM) es una forma buena de describir la evolucin de los SSRs.
Consideremos el caso de dos alelos (CA)6. El alelo (CA)6 puede provenir ya sea de un alelo
(CA)7 o de uno (CA)5. Se asume que todas las accesiones con alelo (CA)6 son idnticas por
descendencia, pero existen pocas razones para asumir esto. Seis posibles mutaciones incrementarn
al alelo (CA)5 a (CA)6, ms 7 mutaciones adicionales que pudieran disminuir el alelo (CA)7 a
(CA)6.
El problema de la homologa depende de la probabilidad de mutacin de las repeticiones. Si esta es
baja, entonces la probabilidad de que una mutacin sea nica y de que alelos similares sean
idnticos por descendencia es alta y viceversa, si el rango de mutacin es alto entonces incrementa
la probabilidad de que dos alelos co-migrantes sean idnticos en estado y no homlogos.
El inconveniente del uso de los SSR en la sistemtica es debido probablemente al gran nmero de
alelos co-migrantes. La incidencia de la no homologa puede sesgar las medidas de similitud y
frecuencia, as como las medidas basadas en caracteres (Swofford y colaboradores, 1997).

.2 Alelos nulos.
Las mutaciones en la regin de unin de uno o de los dos cebadores SSR puede n inhibir el
annealing, lo cual puede provocar la reduccin prdida del producto de PCR(Callen y
colaboradores, 1993). Tales productos son llamados alelos nulos y son comparables, por sus
efectos, a los identificados por las aloenzimas.
Los alelos nulos pueden manifestarse como un menor nmero de heterocigotos que el esperado en
una poblacin con cruzamientos al azar o por la aparicin de lneas vacas (Morgatce y
colaboradores, 1998). Esto quiere decir que si en un heterocigoto con dos alelos SSR diferentes, uno
de estos alelos no puede ser amplificado debido a dificultades en el annealing de los cebadores,;
entonces el fenotipo (en el gel de SSR) aparecer como un homocigoto de una sola banda.
Son tambin responsables de desigualdades entre el par parental-descendencia (la descendencia no
amplifica un alelo que est presente en los parentales. Por ejemplo, Rosetto y colaboradores(1999)
encontraron una menor heterocigosidad observada para Melaleuca alternifolia que la esperada y
adems un exceso significativo de homocigotos, lo cual sugiere que puede ser resultado de alelos
nulos. Este mismo colectivo de autores argumentaron que debido a que los cebadores utilizados
estaban basados en cebadores homlogos para esta especie, era menos probable la aparicin de
alelos nulos. Sin embargo, Callen y colaboradores(1993) identificaron alelos nulos utilizando
cebadores homlogos. El uso de cebadores heterlogos probablemente incrementa la incidencia de
deteccin de estos alelos.
Dowling y colaboradores(1997) sugieren que estos alelos pueden sesgar la estimacin del genotipo
y las frecuencias allicas, mientras Lamboy (1994) ha mostrado que pueden sesgar la estimacin de
las medidas de distancia y de similitud.

(c)
La variacin SSR puede ser analizada filogenticamente en dos formas: i) presencia o ausencia de
alelos como carcter, calculando distancias o usando medidas de carcter y ii) frecuencia allica al
nivel de loci como caracteres, calculando medidas de distancia.
El uso de los SSR para anlisis filogentico no est garantizado. El problema potencial de la no-
homologa de los alelos co-migrantes, la presencia de alelos nulos y la falta de un mtodo riguroso
de anlisis de los datos resultantes evita su uso en estudios de sistemtica, excepto para grupos
separados por no ms de unas pocas miles de generaciones (Jarne y Lagoda, 1996).
La tcnica SSR permite demostrar que puede existir una correlacin entre los resultados obtenidos
por mediacin de tcnicas moleculares y la carcterizacin morfolgica de las varidades, como lo
evidencia el estudio realizado para establecer las relaciones filogenticas entre los diferentes
cultivares de aguacate (Persea americana Mill) y las especies de Persea. En el trabajo se realiz lqa
caracterizacin morfolgica en base a 6 caracteres y los cultivares analizadso fueron ubicadso en su
respectiva clase atendiendo a esto. Posteriormente, se realiz un anlisis SSR con estos cultivares,
obtenindose como resultado que los patrones SSR corroboraron la clasificacin de 8 de los 9
cultivares determinados morfolgicamente como mejicanos; 5 de los 6 clasificados
morfolgicamente como antillanos y otro tanto con 6 de los 8 asignados a la clase guatemalteca
(Mhameed y colaboradores, 1997).
Tambin los SSR son tiles en la identificacin de cultivares, como es el caso del estudio de Lavi y
colaboradores(1994) en el aguacate, donde las combinaciones de SSRs analizadas pudieron
distinguir entre 12 cultivares excepto para el Hass y el Gwen; lo cual no es sorprendente ya que
Hass es el parental femenino de Gwen. No obstante los buenos resultados, no se detect ningn
patrn de clase, debido quizs a que el nmero de representantes de cada clase era muy pequeo (de
2 a 3). Sin embargo, se demostr la naturaleza codominante de estos marcadores, ya que 24 de 26
descendientes de un cruce entre 2 cultivares especficos mostraron ser hbridos verdaderos al
presentar una banda de cada parental.
Siguiendo esta misma lnea est el trabajo de Dror y colaboradores(1992) con Carica papaya y
otras especies del gnero Carica. Las sondas empleadas en el estudio mostraron un patrn
polimrfico diferente entre las especies de Carica y entre los cultivares de C.papaya. El alto grado
de polimorfismo detectado por este mtodo permiti analizar las relaciones genticas dentro de
Caricaceae basado en el compartimiento de bandas, posibilitando seleccionar los pares de especies
relacionados ms estrechamente y los menos relacionados.
En el caso de la uva (Vitis vinifera L.), han permitido identificar todas las accesiones analizadas en
el estudio de Ulanowsky y colaboradores(2000), existiendo una corcondancia general entre estos
resultados y los obtenidos por RAPDs con estas mismas accesiones. Tambin ha sido posible
corregir identificaciones errneas para este cultivo con esta tcnica e incluso, determinar que su
estructura gentica ha sido influenciada por una fuente seleccin artificial guiada por el hombre.
Con esta tcnica se puede detectar un alto nivel de polimorfismo, como lo muestra el estudio
preliminar con muestras de coco de Filipinas, en el cual, de todos los SSRs analizados, solo 3 no
fueron polimrficos y el nmero de alelos detectados fue de 2-9 para cada uno.
Al chequear los resultados obtenidos por esta tcnica respecto a lo ya conocido sobre el
germoplasma de coco se comprob, como se esperaba, la separacin clara entre los cultivares altos
y los enanos; poniendo de manifiesto la confiabilidad de esta tcnica.
Un resultado ms sorprendente fue la deteccin de loci heterocigotos a muy alta frecuencia en
algunos de los cultivares enanos, lo cual pude sugerir que quizs hubo una polinizacin cruzada en
el origen de estos cultivares (Rivera y colaboradores, 1999).
Tambin est el trabajo de Crouch y colaboradores con individuos de las poblaciones mejoradas del
gnero Musa (pltano), donde los SSR fueron capaces de detectar un alto nivel de polimorfismo. Se
han reportado varios cientos de marcadores para este gnero en los trabajos de Jarret y
colaboradores, Lagoda y colaboradores, Kaemmer y colaboradores y Crouch y colaboradores
(Crouch y colaboradores, 1998).
Su aplicacin tambin puede ser llevada a la gentica poblacional par la diferenciacin entre
poblaciones y el anlisis del nivel de diversidad que hay entre stas. Con esta finalidad, Perera y
colaboradores(1999), estudi las poblaciones de coco de Sri Lanka empleando formas
pertenecientes a las 3 variedades reportadas para este pas(tpica(tipo alto), nana(tipo enano) y
aurantiaca(intermedio entre enano y alto)). Los resultados mostraron que los cocos altos exhiben
niveles de diversidad mayores que los enanos y los intermedios y que estos ltimos son ms
similares a los enanos que a los altos. Aqu se pone nuevamente de manifiesto la confiabilidad de
esta tcnica, ya que se obtuvieron iguales resultados usando AFLP en el mismo grupo de genotipos
en un estudio previo realizado por Perera y colaboradores (Perera y colaboradores, 1999).

Los inter-SSR son una variante de la tcnica RAPD, aunque probablemente son ms rigurosos que
sta debido a la alta temperatura de annealing (Robinson y Harris, 2000) La amplificacin ISSR es
una tcnica que puede diferenciar rpidamente individuos relacionados estrechamente. Involucran
la amplificacin por la PCR del ADN usando un nico cebador compuesto de una secue ncia de
microsatlite anclado al extremo 3 5 por 2 - 4 nucletidos arbitrarios y a menudo degenerados.
Acoplado con la separacin de los productos de amplificacin en geles de poliacrilamida, la
amplificacin ISSR puede revelar muchos ms fragmentos por cebador que los RAPDs (Deqiu y
colaboradores, 1998).
Los marcadores ISSR tiene varias ventajas: generan grandes cantidades de bandas, por lo cual
pueden distinguir accesiones relacionadas muy estrechamente ms confiablemente que otras
tcnicas y son menos caros que RFLP RAPD (Deqiu y colaboradores, 1997).
Han sido utilizados, por ejemplo, para el genotipaje de ms de 1200 vides, permitiendo la
diferenciacin clonal de los cultivares en correspondencia con los resultados obtenidos por RAPD
(Regner y colaboradores, 2000).
Tambin son tiles para el estudio de relaciones filogenticas, como es el caso de accesiones del
gnero Citrus representando a 35 especies de ste. Con pocos cebadores se obtuvo un nmero alto
de fragmentos IISR polimrficos que permitieron clasificar las accesiones en 5 grupos principales.
Las relaciones filogenticas reveladas por esta tcnica tuvieron gran correspondencia con
clasificaciones taxonmicas previas (Deqiu y colaboradores, 1998).
Otro de sus usos ha sido en la determinacin de variabilidad gentica. Dentro de esta lnea est el
trabajo de Deqiu y colaboradores(1997) para la caracterizacin de accesiones trifoliadas (Poncirus
trifoliata ), donde tanto las enzimas como los RFLPs detectaron un bajo polimorfismo y la
aplicacin de los inter-SSR permiti la caracterizacin de las mismas y su divisin en 4 grupos
principales.

Se ha reportado recientemente la aparicin de repeticiones mononucleotdicas polimrficas en el

genoma cloroplstico de las plantas superiores, lo cual provee de alternativas para detectar
polimorfismo cloroplstico intraespecfico (Powell y colaboradores, 1996).

Marcadores basados en la reaccin de polimerizacin en cadena (PCR).

El anlisis de los RFLPs mediante la hibridacin tipo Southern, como ya se mencion, presenta
ciertos problemas como tcnica de rutina en las prcticas de mejoramiento de plantas.
Para resolver estos problemas, se ha generado una metodologa que utiliza el ADN a investigar
como plantilla, para sintetizar convenientemente fragmentos discretos de ADN. Esta tecnologa
conocida como PCR tiene la finalidad de detectar una secuencia o gen de inters en el genoma de
un individuo.
Presenta varios requerimientos, entre los cuales es indispensable un molde de ADN, molculas
inic iadoras llamadas cebadores, una enzima ADN polimerasa resistente a fluctuaciones de
temperatura, un amortiguador apropiado y un equipo llamado termociclador que tiene la capacidad
de cambiar las temperaturas dependiendo del ciclaje programado.
La PCR consiste de tres pasos principales: el primero es la desnaturalizacin y sirve para separar
mediante temperatura (94C) la molcula doble de ADN a cadenas sencillas, que servirn como
molde para la sntesis del (o los) fragmento respectivo. En el segundo paso, la temperatura se reduce
para el alineamiento(o reconocimiento) de las molculas iniciadoras a la secuencia blanco del ADN
molde. En el tercero, se lleva a cabo el alargamiento o extensin de la molcula iniciadora
mediante la enzima ADN polimerasa a 72C. Estos 3 pasos (ciclos) se repiten en el termociclador,
permitiendo obtener de manera exponencial el fragmento o los fragmentos discretos sintetizados a
partir del molde de ADN (Valadez y Kahl, 2000).
La tcnica de PCR puede ser aplicada, incluso, a ADNs complejos como es el caso del genmico.
Las pequeas muestras del ADN duplicado (fragmentos) pueden compararse directamente por su
polimorfismo al separarlas en geles de agarosa y teirlas con bromuro de etidio.
Existen muchas metodologas basadas en la PCR que se utilizan para diferentes propsito.

v Tecnologa de la PCR con iniciadores arbitrarios (APT).

La amplificacin de la secuencia blanco (amplicn) necesita dos oligonucletidos iniciadores, cada
uno de los cuales es especficamente diseado para reconocer nicamente a la secuencia
complementaria en el extremo 5 de la cadena de ADN. Este absoluto requerimiento para la
sepecificidad de la secuencia haba limitado el uso de la PCR. Sin embargo, desde 1990 se
desarroll una nueva tecnologa que considera mltiples secuencias blanco, sitios annimos en el
genoma y usa iniciadores de secuencias aleatorias. Esta tecnologa con iniciadores aleatorios
denominada APT (Arbitrary Primer Technology) consiste de tres modalidades diferentes, pero a la
vez similares y ha sido ampliamente aplicada a problemas biolgicos para resolver taxonoma o
mejoramiento molecular (Valadez y Kahl, 2000).

Amplificacin aleatoria de marcadores del ADN polimrfico (RAPD).

Existen marcadores que presentan ciertas limitaciones en el sentido de que se requiere, al menos,
una mnima cantidad de datos acerca de la secuencia genmica del loci de inters, que permita el
diseo de los iniciadores apropiados. Estas limitaciones se han superado con el uso de iniciadores
de tipo aleatorio en la PCR, que se utilizan en la metodologa llamada Amplificacin aleatoria del
ADN polimrfico (RAPD), que permite la sntesis de diferentes fragmentos pequeos del ADN
(Valadez y Kahl, 2000).
La modificacin de la tcnica bsica de PCR que permite que se produzcan los RAPDs , es muy
simple. En lugar de usar un par de cebadores cuidadosamente designados para amplificar una
secuencia determinada, se utiliza un nico cebador corto, el cual se une a muchos loci.
Tericamente, el nmero de fragmentos amplificados depende de la longitud del cebador y del
tamao del genoma blanco, y est basado en la probabilidad de que una secuencia de ADN
complementaria a la del cebador est presente en el genoma, en cadenas opuestas del ADN, en
orientacin opuesta y en una distancia que sea realmente amplificable por la polimerasa. Los
cebadores son de secuencia aleatoria generalmente, con un contenido de al menos un 50% de Gs y
Cs y carecen de repeticiones internas invertidas. Los productos son separados fcilmente por
tcnicas de electroforesis estandars y visualizados por iluminacin con luz ultravioleta de los
geles teidos con bromuro de etidio (Waugh y Powell, 1992).
Este procedimiento es relativamente rpido, puesto que solamente se utilizan pequeas cantidades
de cido nucleico y no involucra transferencia tipo Southern, ni el uso de radioactividad (Valadez
y Kalh, 2000; Waugh y Powell, 1992). Usualmente esta tcnica provee marcadores dominantes, ya
que los polimorfismos se detectan mediante la presencia o ausencia de bandas que resultan de
inserciones o deleciones en las regiones amplificadas, o a partir de cambios de base en el ADN
que alteran la unin del iniciador(Valadez y Kalh, 2000; Waugh y Powell, 1992).
Entre sus caractersticas est su omnipresencia, su naturale za dominante, que presentan herencia
mendeliana simple, que detectan un nivel de polimorfismo alto aunque no variantes allicas. Son
capaces de detectar de 1-10 loci. Estn presentes en todos los tejidos. El nivel de dificultad tcnico
es bajo y su confiabilidad es de intermedia a alta (aunque existe un gran debate acerca de esto). La
calidad de ADN que requieren es baja (bruto) y la cantidad necesaria de 10-50ng. No utilizan
radioistopos (Waugh y Powell, 1992).
Mientras los RAPDs pueden ser explotados como marcadores que segregan en una forma
mendeliana, la identificacin de genes tiles ligados usando esta tcnica, es un proceso laborioso y
consumidor de tiempo.
La combinacin del uso de los RAPDs y las lneas isognicas cercanas (NILs) provee de una ruta
para la identificacin rpida de marcadores ligados a caracteres de inters. Los NILs son
generadas por retrocruces repetidos con seleccin para el carcter deseado en cada ronda de
cruzamiento. Este procedimiento resulta en la produccin de genotipos que son esencialmente
idnticos en todos los loci con excepcin de la regin que rodea el gen bajo seleccin. La alta
probabilidad de que cualquier polimorfismo generado est en el ADN que rodea al gen
introducido, provee de un medio poderoso para id entificar marcadores ligados al caracter de
inters (Waugh y Powell, 1992).
El uso combinado de los RAPDs con un anlisis de segregacin mltiple (BSA), ha probado ser
una estrategia altamente eficiente para la identificacin de marcadores moleculares ilgados a
genes que controlan caracteres de inters (Moretzsohn y colaboradores, 2000).
Actualmente los marcadores tipo RAPDs proporcionan un mtodo rpido para generar mapas
genticos y analizar poblaciones. Adems, este tipo de metodologa puede dirigirse a la bsqueda
de regiones monomrficas por marcadores previamente caracterizados y a la captura de regiones o
de genes especficos. Tambin pueden hacer una contribucin significativa a la eficiencia de los
programas de hibridacin somtica a travs de la identificacin de hbridos somticos en estados
tempranos del proceso de regeneracin (Waugh y Powell, 1992).
Los datos derivados de los RAPDs tienen su fuerte en la distincin entre individuos, cultivares o
accesiones, aunque la dificultad de obtener perfiles confiables hace su credibilidad para la
modelacin questionable. La presencia o ausencia de bandas puede anotarse y convertir los datos
en matrices de similitud para el clculo de distancias genticas.
Al utilizar esta tcnica debe tenerse en cuenta que: (a) los marcadores son dominantes por lo que
los heterocigotos no pueden ser detectados; (b) en la ausencia de un anlisis de pedigree, la
identidad de las bandas individuales en los perfiles multibandas no es conocida y puede haber
incertidumbres en la asignacin de los marcadores a loci especficos; (c) la presencia de una banda
de aparentemente igual peso molecular en diferentes individuos no puede ser tomada como
evidencia de que los dos individuos comparten el mismo fragmento homlogo, aunque esto
normalmente se hace; y (d) bandas nicas en el gel pueden estar comprendidas, algunas veces, de
varios productos de amplificacin co-migrantes (Karp y colaboradores, 1996).
Esta tcnica tiene un valor potencial para la caracterizacin de germoplasma y la identificacin de
cultivares, como lo demuestra su uso exitoso dentro del gnero Musa (Crouch y colaboradores,
1998). Adems ha contribuido, junto a otros marcadores, al desarrollo de un mapa de ligamiento
molecular para este gnero. Dentro de esta misma lnea, en Citrus, ha sido utilizada para mapeo e
identificacin de cultivares (Deqiu y colaboradores, 1998), al igual que en papaya, donde fue
utilizada para construir un mapa de ligamiento para su uso en anlisis de loci de caracteres
cuantitativos (QTLs). Fueron escrineados los cultivares Sunrise y C356, detectndose 96
polimorfismos que fueron mapeados en la generacin F2 de estos cruces (Sondur y colaboradores,
1994).
Tambin ha permitido la caracterizacin de accesiones de uva, llegando a al identificacin de
todas las variedades analizadas y a una correspondencia con los resultados obtenidos por SSR en
estas mismas variedades, e incluso a un nivel mayor que esta ltima ya que tambin detect la
variedad intravarietal (Ulanowsky y colaboradores, 2000). Esta correspondencia de resultados
tambin la comparte con los inter-SSR, permitiendo la diferenciacin clonal de ms de 1200 vides
(Regner y colaboradores, 2000).
Otro ejemplo es en la caracterizacin de la diversidad gentica en la palma aceitera, donde
Moretzsohn y colaboradores (2000) detectaron un bajo nivel de polimorfismo debido a la ya
conocida base gentica estrecha de esta especie. La informacin obtenida permiti la construccin
de mapas de ligamiento en Elaeis que resultaron ser especie -especficos. Est adems, el anlisis
 de ecotipos locales de coco tanto en Tanzania como en Filipinas (Rohde y colaboradores,
1999),donde solo 8 cebadores RAPD revelaron 15 marcadores polimrficos, los cuales fueron
suficientes para distinguir entre los ecotipos filipinos. Una reevaluacin de esta tcnica por ISTR
confirm los agrupamientos obtenidos por RAPD.
Otro de sus usos es en el anlisis de relaciones filogenticas, como por ejemplo, dentro del gnero
Citrus, donde permiti diferenciar entre las especies originadas aparentemente por la va de la
hibridacin (las cuales mostraron altos niveles de heterocigosidad) con las que probablemente no
surgieron por esta va (Deqiu y colaboradores, 1998). Es de destacar que estos resultados se
corresponden, en su gran mayora, con los obtenidos por la tan confiable tcnica RFLP.
Dentro de las aplicaciones de esta tcnica est la posible identificacin de marcadores ligados a
genes de inters. Tal es el caso de 2 marcadores ligados al gen Sh + del engrosamiento de la
corteza del fruto en Elaeis guineensis Jacq. (palma aceitera), demostrando la existencia de un gen
principal que controla el tipo de fruto en esta especie (Moretzsohn y colaboradores, 2000). Estos
marcadores fueron obtenidos por la tcnica RAPD. Tambin para la determinacin del sexo en
papaya (Carica papaya)(Somsri, 1999).
Los RAPD pueden intervenir tambin en la determinacin de supuestos hbridos. Con esta
temtica est el estudio de Magdalita y colaboradores (1997) para probar el hibridismo de 120
supuestos hbridos intraespecficos de Carica papaya x C.cauliflora Jacq. Los marcadores
generados por la PCR usando cebadores RAPD revelaron un alto grado de polimorfismo entre
C.papaya y C.cauliflora. De 1-5 cebadores confirmaron confiablemente que las 120 plantas son
hbridos genticos, los cuales contienen al menos una banda del parental macho.
Pueden ser tiles tambin en la identificacin de los cultivares por su origen geogrfico y por el
tipo de embrin, como es el caso del mango (Mangifera indica L.), donde un anlisis de
agrupamiento de 15 cultivares de esta especie produjo 4 bifurcaciones principales que separaron
correctamente los genotipos en 4 grupos de acuerdo a su origen geogrfico. Adems se detect un
marcador RAPD especfico para la poliembriona (Lopz-Valenzuela y colaboradores, 1997)
De sus resultados se pueden hacer inferencias sobre el origen gentico de ciertas espacies, por
ejemplo, el de mango. Ravishnkar y colaboradores (2000) seleccionaron 18 cultivares comerciales
de mango representativos de los 4 puntos cardinales de la India, con el objetivo de determinar las
relaciones genticas entre ellos. Del anlisis de los resultados se desprende que la mayora de los
cultivares de mango se originaron de un pool de genes y fueron domesticados posteriormente.
Dentro de la familia Myrtaceae, una de las especies tratadas con marcadores moleculares ha sido
Feijoa sellowiana. Dettori y Palombi (2000) utilizaron marcadores RAPDs para identificar
accesiones de esta especie y con el objetivo, adems, de conocer la variabilidad disponible dentro
de stas. Como resultado, se obtuvieron 23 patrones de bandas, de los cuales 21 caracterizaron una
nica accesin.
La distribucin de las accesiones dentro del agrupamiento no tuvo una relacin aparente con el
origen geogrfico. Esto, unido al bajo nmero de bandas raras obtenidas, sugiere que la mayora del
material vegetal analizado comparte un ancestro gentico comn.
No siempre es exitoso el uso de estos marcadores. Por ejemplo, Schnell y colaboradores(2001) los
utilizaron para determinar parentesco entre plantas de mango procedentes de semilla de las
variedades Keitt y Kent. El nmero de loci no-segregantes en los cultivares parentales fue
sorprendente alto, lo cual fue inesperado ya que el mango es considerado generalmente como
altamente polimrfico. Se encontraron adems, bandas amplificadas en la progenie que no estaban
presentes en ninguno de los parentales. Estas complicaciones hacen que los marcadores RAPDs
sean menos deseables para este tipo de anlisis que otros marcadores moleculares de ADN en
mango.
Otro caso es sobre su uso en la clasificacin de germoplasma y la identificacin clonal de
Mangifera, donde al analizar los cebadores RAPDs individualmente no produjeron patrones de
bandas nicos par los individuos bajo estudio y solo al tomar en cuenta los datos para cada cebador
en pareja, algunos de ellos mostraron patrones nicos que permitieron identificar los cultivares
analizados (Schnell y colaboradores, 1995).

Amplificacin de huellas del ADN (DAF).

Una tcnica muy similar, aunque no idntica para identificar polimorfismos genmicos es la
tcnica de DAF (DNA Amplification Fingerprinting). Este mtodo se caracteriza por que en la
PCR se utilizan molculas iniciadoras pequea s (5-15 nucletidos) pero a concentraciones altas
(de 3-30M), respecto a las otras metodologas reportadas en donde la concentracin es de
alrededor de 0.3-3M. La concentracin de ADN molde es muy baja (alrededor de 2ng por
reaccin), as como la temperatura de alineamiento (para permitir la unin no perfectamente
homloga al sitio blanco) (Valadez y Kahl, 2000).
Los productos de amplificacin son analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida y son
detectados por tincin sensitiva con plata. La alta resolucin del gel de poliacrilamida y la alta
sensibilidad de la tincin con plata, producen ms bandas que la tcnica RAPD y, dependiendo de
la especie, permite detectar ms polimorfismos.
Un ejemplo del uso de esta tcnica en los frutales tropicales es en la determinacin del sexo de
papaya. Se compararon los resultados obtenidos por RAPD como por DAF. Esta ltima produjp,
al menos 5 veces, ms bandas que las reacciones RAPD, lo cual permiti un escreening ms
eficiente; adems de que parece ser una tcnica ms confiable. Con la utilizacin de un anlisis de
segregacin mltiple, se definieron un gran nmero de marcadores DAF que estaban presentes
solamente en pooles de ADN macho o hermafrodita. Un anlisis preliminar para asociaciones de
ligamiento indic que estos marcadores estaban estrechamente ligados a los alelos determinantes
del sexo (Somsri, 1999).

PCR iniciada con mirosatlites (MP -PCR).

La tcnica MP-PCR (Micrsatellite Primer-PCR) involucra iniciadores de secuencias

complementarias a microsatlites especficos, adems de los reactantes necesarios para la PCR
mencionados anteriormente. Los productos obtenidos son utilizados tambin para la diferenciacin
de individuos. El esquema general se muestra en la figura 12 (Valadez y Kahl, 2000).
Para el caso del cultivo del garbanzo, los patrones generados por MP -PCR son muy estables y
altamente reproducibles, pero muestran pocos polimorfismos con respecto a las huellas generadas
con microsatlites como sondas. Dado que la informacin de los patrones depende fuertemente de
las especies y del iniciador, la tcnica debe considerarse como un mtodo complementario a la
tcnica RAPD.

PCR iniciada con microsatlites anclados (AMP -PCR).

Esta tcnica es una variante derivada de MP -PCR que emplea iniciadores con anclas en sus
extremos 3 5.
Esta clase de iniciadores consiste de una, dos o tres bases adicionales al microsatlite y sirven para
seleccionar aquellas islas de microsatlites en el genoma que estn flanqueados con el
complemento de bases especficas; por lo que se incrementa su especificidad.
Generalmente la tcnica AMP-PCR (Anchored Microsatellite Primer-PCR) es ms eficiente que la
de MP-PCR o RAPDs, ya que ha demostrado detectar ms variabilidad gentica, especficamente
si sus productos son separados en geles de poliacrilamida de alta resolucin. La cantidad de
secuencias iniciadoras de AMP disponibles son potencialmente altas, de manera que es posible
hacer uso de ellas para anlisis de genomas.
El nmero de productos amplificados esperados depende de la longitud y tipo del iniciador con
ancla; as como del bajo nmero de amplicones y viceversa. El uso de un ancla de secuencia
degenerada, es decir, con una secuencia de bases nitrogenadas no del todo complementaria,
generalmente incrementa la complejidad de los patrones de bandeado.
Los patrones de bandeado de AMP -PCR son muy estables y reproducibles y exhiben ms
polimorfismo que los obtenidos con MP-PCR.
Al igual que RAPDs y MP -PCR, la tcnica de AMP -PCR pertenece a las tcnicas para
caracterizacin de genomas, que generan informacin valiosa acerca de la estructura de stos- y
asisten para la generacin de marcadores genticos dominantes- que pueden ser empleados
exitosamente para detectar polimorfismos en la diversidad gentica, taxono ma molecular y
estudios filogenticos moleculares (Valadez y Kahl, 2000).

Polimorfismo de marcadores de secuencias especficas vecinas a microsatlites (STMS).

Los STMS (Sequence-Tagged Microsatellite Site), llamados marcadores de segunda generacin,

permiten definir la identidad entre dos bandas iguales y la discriminacin entre un estado homo u
heterocigoto de un posible locus.
Este tipo de marcadores puede abarcar tanto la especificidad de alelos como la de microsatlites
que se generan mediante la amplificacin especfica de un locus, donde est presente un
microsatlite particular.
El desarrollo de marcadores STMS es demasiado costoso y laborioso por la serie de pasos que
lleva (Valadez y Kahl, 2000).
Secuencia de eventos para la obtencin de secuencias especficas vecinas de microsatlites para la
obtencin de alelos marcadores:

1. Establecimiento de una biblioteca genmica de longitud especfica.

El ADN genmico de las plantas se asla primeramente y se corta con dos enzimas de restriccin.
Los fragmentos resultantes se separan con electroforesis y se seleccionan aquellos que tengan una
longitud entre 200-800 pb. Todos los fragmentos de este tamao se clonan en un vector plasmdico
y se transforma a E.coli con ellos. En esta forma queda establecida la biblioteca genmica, cuyas
longitudes de insertos van de 0.2-0.8 kb.

2. Aislamiento de clones que contienen microsatlites a partir de la biblioteca establecida.

La biblioteca es sembrada en placas Petri. Una vez que se forman las colonias bacterianas se
transfiere parte de las bacterias de cada colonia a una membrana de nailon. Las colonias
transferidas se lisan, se desnaturaliza el ADN y se hibridan con una sonda de microsatlite
marcada (en este caso (AT)n). Las colonias que contienen AT son detectadas por autorradiografa
por rayos X.

3. Diseo de iniciadores flanqueantes de regiones microsatlites.

Los clones positivos se crecen en medio lquido, se purifica el ADN plasmdico y los insertos son
removidos y secuenciados. Usando un programa de computadora, se disean los iniciadores de
alrededor de 20 pb a partir de las regiones flanqueantes de los microsatlites. Estos iniciadores
permitirn posteriormente la amplificacin de alelos especficos de microsatlites, ya que el
iniciador se uni a sitios que son nicos.

4. Deteccin de polimorfismos allicos en diferentes individuos.

 Los alelos se visualizan mediante tincin con plata, autorradiografa o fluorescencia con bromuro
de etidio despus de la respectiva electroforesis de geles de poliacrilamida de alta resolucin.

Estos procedimientos extravagantes, permiten producir pares de iniciadores que amplifican

especficamente microsatlites individuales. La separacin de los amplicones despus de la
amplificacin en geles de poliacrilamida de alta resolucin detectan solo una banda (estado
homocigoto) o dos bandas (estado heterocigoto).
Las principales ventajas que ofrecen los marcadores STMS son:

(a) Su manifestacin codominante y especfica de locus. Los diferentes alelos difieren uno del
otro en el nmero de secuencias de microsatlites, creando un nmero variable de
polimorfismos de repeticiones seriadas (VNTR).
(b) Su alto contenido de informacin, por ejemplo el nmero y frecuencia de alelos detectados
(Fig 21).
(c) La relativa facilidad de su deteccin. Comparativamente se requieren pocos materiales
biolgicos, es una tcnica rpida, sensible y el ADN parcialmente degradado es tolerable por
la PCR para hacer la reaccin.

Entre sus principales desventajas estn:

(a) El costo de produccin es extremadamente alto.

(b) Su especificidad. La generacin de marcadores STMS para una especie puede normalmente no
ser transferido a otra especie relacionada, incluso a especies cercanamente relacionadas.

Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP)

Los AFLPs son fragmentos de DNA que proceden de la restriccin del DNA genmico digerido y
son amplificados usando cebadores dirigidos (Matthes y colaboradores, 1998; Karp y
colaboradores, 1997; Vos y colaboradores, 1995).
Vos y colaboradores (1995) argumentaron que la confiabilidad de la tcnica RFLP est combinada
con el poder de la tcnica de PCR. Powell y colaboradores (1996) sugirieron que los AFLPs
proporcionan altos niveles de resolucin para permitir un bosquejo de estructuras genticas
complejas.
Su basamento consiste en cortar el DNA con enzimas de restriccin y ligando posteriormente
adaptadores de doble cadena (de 25 a 30 pb a cada lado del fragmento de restriccin y con una
pequea cola 5) (Valadez y Kahl, 2000) al extremo final de los fragmentos de DNA generados,
con el objetivo de obtener un DNA modelo para la amplificacin. La secuencia de los adaptadores
y el sitio de restriccin adyacente sirven como sitios de unin al cebador para poder lograr la
amplificacin.
La designacin del cebador AFLP est principalmente determinada por la designacin de los
adaptadores, los cuales estn ligados a los fragmentos de restriccin. Una caracterstica importante
de estos cebadores es que todos comienzan con un residuo de guanina (G) en el extremo 5. Se ha
encontrado que este residuo en los cebadores no marcados es crucial para prevenir el fenmeno de
doble banda.
La selectividad del cebador es relativa y tambin depende del nmero de fragmentos amplificados
en una sola reaccin, las condiciones de la PCR y la de signacin del cebador. Siempre puede ocurrir
cierto nivel de amplificacin errada, pero las condiciones de la reaccin pueden prevenir que estas
bandas erradas lleguen al nivel de deteccin (Vos y colaboradores, 1995).
Al extremo 3 de los cebadores se le incluirn nucletidos selectivos, con el objetivo de promover
solamente la sntesis de DNA de un subgrupo de sitios de restriccin. Por tanto, solo los fragmentos
de restriccin, cuyos nucletidos que flanquean el sitio de restriccin enlazan con los nucle tidos
selectivos, sern amplificados(Fig 22)(Vos y colaboradores, 1995). El uso de nucletidos selectivos
es importante ya que si todos los fargmentos Mse I-EcoRI se amplificaran, el nmero de productos
podra ser muy grande y los patrones de bandas sera n muy complejos (Valadez y Kahl, 2000).
Los fragmentos de restriccin para la amplificacin son generados por 2 enzimas de restriccin (una
cortadora frecuente y una rara), lo cual resulta en una amplificacin predominante de aquellos
fragmentos que tenga n una secuencia cortadora rara en un extremo y una secuencia cortadora
frecuente en el otro (Vos y colaboradores, 1995; Valdez y Kahl, 2000).
Entre las enzimas cortadoras frecuentes ms utilizadas est la Mse I, debido a que como la mayora
de los DNAs eucariticos son ricos en AT y la secuencia de reconocimiento de esta enzima es
TTAA, corta muy frecuentemente, rindiendo fragmentos que estn en el rango de tamao ptimo
tanto para la amplificacin de la PCR como para la separacin en los geles desnaturalizantes de
poliacrilamida.
Otras enzimas raras trabajan igual que la EcoRI. Sin embargo, esta es preferida debido a que es
confiable y de bajo costo, lo cual limita los problemas asociados con una restriccin parcial (Vos y
colaboradores, 1995).
Una restriccin incompleta del DNA cusar problemas en los patrones de bandas, debido a que se
pueden generar fragmentos parciales, los cuales sern detectados por el procedimiento AFLP.
Cuando se comparan varias muestras de DNA por AFLP, una restriccin incompleta resultar en la
deteccin de diferencias en los patrones de bandas, lo cual no refleja un verdadero polimorfismo.
Las razones para el uso de 2 enzimas de restriccin son las siguientes: (i) la cortadora frecuente
generar fragmentos de DNA pequeos, los cuales amplificarn bien y estn en el rango de tamao
ptimo para la separacin en geles desnaturalizantes; (ii) el nmero de fragmentos para ser
amplificados est reducido usando la cortadora rara, ya que solo los fragmentos cortadora
rara/cortadora frecuente se amplificarn; (iii) el uso de 2 enzimas hace posible el marcaje de una de
las cadenas de los productos de doble cadena de PCR, lo cual previene la aparicin de dobletes en el
gel debido a una mobilidad desigual de las 2 cadenas de los fragmentos amplificados; (iv) el uso de
las 2 enzimas brinda la mayor flexibilidad en la sincronizacin del nmero de fragmentos a ser
amplificados y (v) pueden generarse un gran nmero de huellas de DNA usando varias
combinaciones de un nmero bajo de cebadores (Vos y colaboradores, 1995).
Experimentos con DNA de plantas (Arabidopsis sp, tomate y maz) y en humanos han mostrado la
necesidad de una estrategia de amplificacin en 2 pasos (Fig 22). El primero es llamado de
preamplificacin y en este el DNA genmico es amp lificado con cebadores que tienen un solo
nucletido selectivo. Este producto de PCR es diludo y utilizado como modelo para una segunda
reaccin usando cebadores con 3 bases selectivas (Valadez y Kahl, 2000).Esta estrategia reduce el
smear en los patrones de huellas de DNA y adems provee de una cantidad virtualmente ilimitada
de DNA modelo para las reacciones AFLP (Vos y colaboradores, 1995).
Normalmente uno de los dos iniciadores de AFLP se marca radioactivamente y los fragmentos
amplificados pueden ser detectados despus de su separacin en geles de secuenciacin de alta
resolucin con autorradiografa (Valadez y Kahl, 2000).
Una caracterstica a resaltar en la reaccin de AFLP es que el cebador marcado es consumido
completamente casi siempre (el no marcado est en exceso) y por tanto la reaccin de amplificacin
se detiene cuando ste se acaba.
Se ha comprobado que ciclos trmicos adicionales no afectan el patrn de bandas una vez que es
consumido el cebador marcado. Esta caracterstica es elegantemente utilizada en el protocolo de
AFLP, para el cual un exceso de ciclos de PCR resulta en patrones de igual intensidad no obstante
las variaciones en la concentracin del templado. A su vez estos patrones tienden a no ser
confiables por debajo de determinada concentracin (aproximadamente 1pg), sin considerar la
complejidad del DNA.
La correlacin casi linear entre el nmero de fragmentos amplificados y el tamao del genoma se
pierde en el genoma complejo de las plantas superiores, el cual contiene un alto nmero de
secuencias repetidas y, por tanto, de fragmentos de restriccin multicopia. Los patrones de bandas
de estos DNAs consisten predominantemente de fragmentos AFLP nicos, pero estn
caracterizados por la presencia de un nmero pequeo de fragmentos repetidos ms intensos (Vos y
colaboradores, 1995).
El uso de los marcadores AFLP para el mapeo genmico puede enlazar la brecha que existe entre
los mapas fsicos y los genticos (Vos y colaboradores, 1995). Desde que se consider esta
hiptesis, muchas investigaciones han aplicado esta tcnica a estudios de mapeo (Xu y
colaboradores, 1999). Xu y colaboradores (1999) sugirieron que el uso de los AFLPs es la forma
ms eficiente de generar un gran nmero de marcadores ligados a genes blanco. Sin embargo, el
alto polimorfismo revelado por estos marcadores ha interesado a investigadores de otros campos;
por lo que su uso se ha ampliado a la gentica de las poblaciones, anlisis de filogenia e
identificacin cultivar/accesin.
La ventaja principal que tienen es el gran nmero de polimorfismo que generan. Por ejemplo,
Barker y colaboradores (1999) encontraron mayor cantidad de bandas polimrficas usando una
cantidad mucho menor de cebadores AFLP comparado con los RAPD , en un estudio de diversidad
gentica en Salicaceae. Por otra parte, Nakajima y colaboradores(1998) encontraron que el mtodo
AFLP produjo un promedio de 4 veces muchas ms bandas por reaccin comparado con los RAPD
en un anlisis de diversidad de Apicaceae. Similarmente, Maughan y colaboradores (1998)
encontraron que los AFLPs produjeron muchos ms loci polimrficos por cebador que los RFLPs,
SSRs RAPDs en un estudio de diversidad de la soja (Leguminoseae).
Otras caractersticas ventajosas son: no se requiere ninguna informacin sobre la secuencia
analizada; la tcnica de PCR es rpida y es posible una relacin multciple alta (Rafalski y
colaboradores, 1996).
Esta caracterstica de no necesitar una informacin previa de la secuencia analizada es compartida
con los RAPDs, contrario a los RFLPs y los SSRs que necesitan un alto grado de caracterizacin del
genoma en estudio.
La relacin multciple es el nmero de loci genticos diferentes que pueden ser analizados
simultneamente por experimento (Rafalski y colaboradores, 1996). Debido a que los marcadores
AFLPs estn distribudos en todo el genoma, ellos tienen esta relacin alta, o sea, cada banda es
asumida como que proviene de un rea diferente del genoma de la planta. En contraste, los SSRs
tienen un gran nmero de alelos por locus y por tanto su relacin es igual a 1 (Harris, 1999). Se
considera ms apropiado tener una relacin alta, ya que esto sugiere que est siendo muestreado
todo el genoma en vez de un segmento de este.
Krauss y Peakall (1998) sugieren que despus del perodo de escreening inicial, pudieran ser
analizados 100 individuos por cada 100 loci polimrficos por semana, lo cual hace que esta tcnica
sea ideal para estudios poblacionales a gran escala. Adems, se puede utilizar material seco para el
anlisis, debido a que el mtodo es basado en el DNA. Esto permite el anlisis de especies que
pudieran ser difciles de colectar ex situ.
Los problemas asociados con esta tcnica pueden dividirse en tres tipos: prcticos (a), de datos (b) y
de anlisis (c). Muchos de estos proble mas no son nicos para los AFLPs, sino que se aplican a la
mayora de los sistemas de marcadores moleculares.

(a) Muchos de estos problemas, a diferencia de los que se presentan con los RAPDs, pueden ser
superados, aunque los manipuladores deben ser expertos en muchas habilidades prcticas.

.1 Costo.
Este parmetro depende del punto de vista del intreresado y de la cantidad de recursos de que ste
dispone. Por ejemplo, los RAPDs son bastante baratos pero en trmino de calidad de los datos se
requiere de bastante dinero. Existen varios componentes caros en el AFLP: las sondas biotiniladas y
las bolitas magnticas de estreptovidina, los cebadores y los adaptadores, el sistema de deteccin
(Huang y Sun, 1999).
.2 Enzimas.
La eleccin de cul enzima o cebador utilizar puede afectar el nmero de polimorfismos AFLPs
detectados. Por ejemplo, para el caso de las enzimas, se detect mayor polimorfismo con la
combinacin Pst I / Mse I que con EcoR1 / Mse I en cebada (Ridout y Domini, 1999). Para el uso
de los cebadores por ejemplo, Hart y Seefelder (1998) evaluaron 60 combinaciones de estos y solo
8 de stas proporcionaron patrones de bandas confiables. En otros casos se pueden presentar
patrones ms densos que hacen imposible un conteo confiable. As, la seleccin del cebador puede
influir en el nmero de bandas amplificadas y el nivel de polimorfismo encontrado. En general, el
genoma de las plantas es rico en A-T, por lo que el uso de cebadores pobres en A-T puede reducir la
complejidad del patrn de bandas (Qi y Lindhout, 1997).
Si no se realiza un escreening preliminar de las combinaciones de cebadores, entonces la seleccin
del cebador es esencialmente aleatoria y existe por tanto el riesgo de que brinden datos insuficientes
para el anlisis. A menudo el costo de la tcnica AFLP es tal, que solo se puede analizar un nmero
limitado de combinaciones de cebadores.

.3 Reproducibilidad.
Los AFLPs son proclamados generalmente por esta caracterstica, lo cual sita a la tcnica aparte de
los RAPDs. Esto fue probado en una red de laboratorios europeos a travs de un control riguroso
de todas las variables que fueran capaces de mostrar que es posible reproducir un patrn de bandas
AFLP.
Otro aspecto de la reproducibilidad es la consistencia de la reaccin, o sea, si una accesin y una
combinacin de cebadores brinda el mismo resultado siempre. Winfield y colaboradores (1998)
corrieron muestras duplicadas de 5 rboles, obteniendo el mismo patrn de bandas para 3 de los
duplicados y para los otros 2 un porciento de similitud mayor del 95% en un estudio de diversidad
gentica del lamo negro (Populus nigra subsp.betulifolia).
La digestin parcial puede ser otro factor que afecte la reproducubilidad y parece ser la fuente ms
comn de falso polimorfismo en los anlisis de AFLP (Lin y Kuo, 1995) y puede ser causada por un
nmero de factores que incluyen la contaminacin o la metilacin del DNA (Dowling y
colaboradores, 1997).
El conteo de los fragmentos AFLP, como el de los RAPDs, est sujeto a la interpretacin dada por
cada investigador. Hay quienes detectan todas las bandas mono y polimrficas a ojo (Travis y
colaboradores, 1996). Otros utilizan deteccin fluorescente, considerando slo los picos de alta
intensidad (Escaravage y colaboradores, 1998). Tambin estn los que incluyen solamente los
fragmentos distintivos, reproducibles y bien separados (Aggarwal y colaboradores, 1999). Lo que es
interesante destacar es que en ningn artculo se define lo que constituye una banda distintiva,
reproducible y bien separada; por lo que cada investigador lo hace desde su punto de vista, lo cual
tambin afecta la reproducibilidad cuando se comparan trabajos similares realizados por diferentes
personas. Referente a esto, Krauss y Peakall (1998) sugirieron que la deteccin por computadora
(Como parte del mtodo de deteccin fluorescente) de los fragmentos es ms eficiente y exacta que
el conteo de bandas por autorradiogramas.

(b)

.1 Dominancia.
Como los marcadores RAPDs, los AFLPs son dominantes, con deteccin de polimorfismo por la
presencia/ausencia de la banda. Los marcadores dominantes no son tan eficientes como los
codominantes para los estudios de la gentica poblacional (Lynch y Milligan, 1994). Lynch y
Milligan (1994) estimaron que se necesitan de 2-10 veces ms individuos muestreados por locus
para los marcadores dominantes que para los codominantes. Krauss y Peakall (1998) sugirieron que
esta desventaja puede ser salvada debido al gran nmero de polimorfismos que se generan (cerca de
100 polimorfismos por lnea).
Se ha sugerido que es posible identificar a los heterocigotos a partir de la intensidad de las bandas o
los picos en los geles de AFLP (Castiglioni y colaboradores, 1999). Esto es, un heterocigoto para
un marcador tendr una banda la mitad de densa del homocigoto para el alelo dominante, basado en
la idea de que habr 2 veces ms marcadores para el homocigoto dominante comparado con el
heterocigoto. Sin embargo, Vos y colaboradores (1995) demostraron que el procedimiento AFLP
es insensible a la concentracin de DNA templado, ya que se observ una intensidad de bandas
similar en un rango de concentraciones analizadas del templado (25ng-25pg).

.2 Homologa.
La homologa es quizs el mayor problema en el anlisis AFLP. Se asume a menudo que 2 bandas
co-migrantes son homlogas, aunque no existe una razn a priori para aceptarlo. Kardolous y
colaboradores (1998) argumentaron que la posibilidad de que 2 fragmentos AFLP co-migrantes no
representen alelos idnticos de un mismo locus es pequea, lo cual ellos pensaban que se deba a la
amplificacin altamente selectiva y a la ayuda de la resolucin de los geles de poliacrilamida.
Rieseberg (1996) sugiri que la homologa RAPD es funcin de la distancia taxonmica, o sea,
mientras ms estrechamente relacionadas estn las accesiones comparadas, es mayor la probabilidad
de que sea homloga una banda co-migrante compartida. Esto tambin se puede extender al anlisis
de los AFLPs, debido a que Lercetau y Szmidt (1999) encontraron que los AFLPs reflejaron la
taxonoma clsica de Pinus a niveles taxonmicos bajos, pero en los ms altos los grupos de datos
fueron incongruentes. Un punto de vista conservador pudiera ser que por encima del nivel de
especie, el uso de los AFLPs para la clasificacin y las filogenies no ofrece garantas.

.3 Conteo.
Las mutaciones son contadas como presencia o ausencia de una banda y por tanto, las diferencias en
los patrones son debido a la presencia o ausencia del sitio de restriccin. Existen, por tanto, 3
cambios bsicos en el perfil: la ganancia o la prdida de una banda y el cambio en el tamao de la
banda. No todos estos cambios son igualmente probables, por lo que ocurren a diferentes
frecuencias.
La prdida de un sitio de restriccin es probablemente causada por una mutacin puntual en la
secuencia de reconocimiento de la enzima de restriccin, provocando que sta no sea reconocida
por la enzima y por tanto no se corte. Asimismo, la ganancia de un sitio es causada por una
mutacin puntual que cambia un sitio potencial en un sitio reconocible. Las probabilidades de estos
2 eventos son diferentes, siendo la prdida del sitio de restriccin mucho ms probable que la
ganancia. La prdida o la ganancia de sitios puede ser producida tambin por eventos de insercin,
delecin o duplicacin, adems de cambios en el tamao de la banda que pueden ser
malinterpretados como ganancia o prdida de un sitio de restriccin o de una banda. A menos que
sean investigadas las razones para todos estos cambios entre todos los taxas, sern contados dobles
varios cambios en la matriz de datos.
El nivel de ploida del taxa bajo investigacin puede afectar la cantidad de variacin observada.
Kardolus y colaboradores (1998) registraron el nmero de bandas polimrficas en cada nivel de
ploda (di, tetra y hexaploides) en Solanum, el cual fue diferente para cada uno. Las bandas extra, si
estn correlacionadas con la poliploida, introducen complicaciones en el conteo para la matriz de
datos. Si estas bandas estn solo presentes en los poliploides, entonces no pueden ser contadas
como ausentes (0) en el diploide (y en el tetraploide existen bandas en el hexaploide), por lo que
son anotadas como indeterminadas (). La usencia o presencia de bandas en los diploides no puede
ser determinada debido a que el fragmento que produce la banda no est presente en el diploide.
Esto introduce dificultades cuando se trabaja con diploides y poliploides en el mismo anlisis.

(b) Una vez que los perfiles AFLP han sido convertidos en una matriz de datos, pueden ser
analizados de tres formas diferentes: me diciones de similitud, frecuencia y de caracteres. Las 2
 primeras convierten la matriz binaria en una serie de medidas de distancia entre los taxa. El
tercero utiliza los datos como caracteres en un anlisis. La seleccin entre las medidas de
similitud o frecuencia depende primariamente del nmero de accesiones analizadas y el
objetivo de la investigacin. Hay tendencia a utilizar las medidas de similitud cuando el
nmero de accesiones es pequeo (<50) y el anlisis est enfocado en la variacin entre
indiv iduos (Beisman y colaboradores, 1997; Escaravage y colaboradores, 1998), mientras que
para estudios con un nmero mayor de accesiones y con nfasis en la variacin entre
poblaciones se utilizan generalmente las medidas de frecuencia (Perera y colaboradores, 1998).
Los anlisis de los datos AFLP basados en caracteres son un mtodo inusual de anlisis de los
resultados de esta tcnica, excepto en los estudios con una hiptesis filogentica explcita
(Kardolus y colaboradores, 1998).

.1 Medidas de similitud.
Las utilizadas para los datos AFLP son: (i) el coeficiente de unin simple (SMC), el cual mide la
proporcin de bandas ausentes o presentes compartidas entre 2 perfiles AFLP; (ii) el coeficiente de
Jaccard, el cual mide la proporcin de bandas compartidas; (iii) el coeficiente de Nei y Ly (NL),
el cual mide la probabilidad de que una banda amplificada en una muestra sea amplificada en otra.
El NL tambin tiene una perspectiva bilgica, ya que es un estimado de la proporcin de bandas
compartidas por 2 muestras debido a que estas fueron heredadas de un ancestro comn (Harris,
1999).
Lamboy (1994) sugiri que pueden ser identificados 2 grupos principales de errores para los datos
RAPDs: los falsos positivos (presencia de un producto cuando ste debe estar ausente) y los falsos
negativos (ausencia de un producto cuando debe estar presente). Ambos grupos de errores son
aplicables a los datos AFLP, aunque a un nivel menor debido a lo estricto de la reaccin de la PCR
en el AFLP. La otra fuente de error es la no-homologa entre fragmentos co-migrantes, lo cual
puede ser clasificado como falso positivo. Todas estas fuentes de errores introducen un sesgo en los
estimados de similitud.

2 Medidas de frecuencia.
Como los RAPDs y las aloenzimas, los AFLPs son utilizados para la distribucin de la diversidad
gentica dentro y entre las especies, cultivares y poblaciones. A partir de la frecuencia de los
productos AFLP se pueden calcular los niveles y patrones de diversidad. Los marcadores son
generalmente tratados como independientes y las diversidades son calculadas usando: (i) medidas
de similitud; (ii) medida de Shannon y (iii) anlisis de varianza molecular (AMOVA).
Las fuentes de error son esencialmente las mismas que para las medidas de similitud, pero con la
complicacin adicional de la dominancia de las bandas AFLP. Con los loci dominates, la varianza
de un nico loci se incrementa e introduce un sesgo en la medida de la frecuencia (Lynch y
Milligan, 1994), aunque existen mtodos para superar este problema (Lynch y Milligan, 1994).

.3 Medidas de caracteres.
Esto pudiera ser una forma ideal de anlizar los datos AFLP. Los AFLP son anotados fcilmente
como una matriz de datos binaria discreta, siendo los caracteres las bandas AFLP y sus estados la
presencia o la ausencia. La literatura indica que cambiar este tipo de datos en medidas de similitud o
de frecuencia puede ser no deseable (Swofford y colaboradores, 1997), debido a que las medidas de
caracteres contienen ms informacin que las medidas de distancia.
Swofford y Olsen (1990) sugirieron que para utilizar un dato como carcter, los caracteres deben ser
variables, independientes y homlogos. Los AFLPs son variables, pero algunas bandas no son
homlogas ni independientes. No existe forma de identificar y remover estas bandas de una matriz
de datos. Ambas deficiencias pueden comprometer el anlisis.
Los datos AFLP, si son usados como caracteres, se analizan por los mtodos de parsimonia y de
mxima probabilidad. Este ltimo pudiera modelar el proceso que causa la ganancia o la prdida de
bandas y asigna probabilidades a estos eventos. Se construye entonces el rbol ms probable, donde
puede ser modelado exactamente el proceso involucrado con el cambio nucleotdico (Page y
Holmes, 1998). Tales investigaciones no se han llevado a cabo para los datos AFLP, por lo que el
mtodo no est disponible hasta el presente para el anlisis de estos datos.
Pocos anlisis de los datos AFLP han usado parsimonia. Por ejemplo, Kardolous y colaboradores
(1998) implementaron la parsimonia de Wagner investigando la sistemtica de Solanum; mientras
que Angiolitto y colaboradores (1999) implementaron la de Dollo al investigar la diversidad
gentica en Olea. Swofford y colaboradores(1997) revisaron los diferentes tipos de parsimonia. La
primera, una de las ms simples, asume la reversibilidad libre de los caracteres, lo cual significa,
con 2 caracteres, que la probabilidad de la prdida y la ganancia de una banda AFLP es la misma.
Sin embargo, estos 2 eventos pueden no tener la misma probabilidad. Una alternativa es la segunda
parsimonia, la cual permite las reversiones (prdida de bandas), pero permitir que la ganancia
ocurra una vez en el rbol. Esto es poco realista otra vez, debido a que la probabilidad de una
ganancia independiente de una banda no debe ser desatendida.
(d) Medidas de distancia y reconstruccin filogentica.
El uso de las medidas de distancia para construir un dendograma a partir de los datos AFLP, consta
de 2 pasos: (i) la conversin de la matriz de datos binaria a una matriz de distancia y (ii) el uso de la
matriz de distancia y un programa constructor de rboles para construir el dendograma. El uso de
las matrices de distancia AFLP y la filogenia est centrada en la calidad de los datos que se entran
en los programas constructores de rboles. Como se discuti anteriormente, existen muchas posibles
causas de error en un anlisis AFLP y esto puede causar problemas con el clculo de las distancias
genticas, lo cual aade un nivel de incertidumbre al dendograma resultante.
Se ha encontrado que los mtodos basados en las huellas de fragmentos de ADN genmico por
cebadores aleatorios son susceptibles a la concentracin de ADN molde. Una tcnica de huellas de
ADN debe ser insensible preferiblemente a las variaciones en la concentracin de ADN molde. La
tcnica AFLP es insensible a la concentracin del ADN molde, lo cual fue corroborado por un
estudio en el cual se variaron las cantidades de ADN de 2.5pg-25ng y se obtuvo un patrn de
bandas similar al resto con la menor concentracin (Vos y colaboradores, 1995).
La tcnica AFLP parece ser tan reproducible como los RFLP, pero necesita una mayor demanda
tcnica y requieren ms ADN (1g por reaccin) que los RAPDs. Comparte muchas de las
limitaciones de los RAPDs en lo referente a la homologa de bandas y las identidades (Karp y
colaboradores, 1996).
Esta tcnica ha sido aplicada exitosamente en una variedad de sistemas. Un anlisis preliminar en
poblaciones mejoradas del gnero musa sugiere que este mtodo puede ser una herramienta
poderosa en el mejoramiento molecular del pltano y la banana (Van Gysel, datos no publicados).
Los AFLPs han sido utilizados en la identificacin de cultivares, como es el caso del genotipaje de
ms de 1200 vides (Regner y colaboradores, 2000) y el anlisis de la diversidad gentica en
accesiones italianas de uva (Sensi y colaboradores, 1996). Los resultados obtenidos fueron casi
idnticos a los revelados por ISTR, aunque esta ltima detect ms diversidad entre las varias
accesiones de uno de los cultivares de uva. Un estudio similar se realiz con 14 poblaciones de coco
procedentes de toda el rea geogrfica. De forma general hubo una buena separacin de las
poblaciones y las relaciones fenticas estuvieron en correspondencia con las obtenidas previamente
por RFLP, poniendo de manifiesto la confiabilidad de esta tcnica. Esta correspondencia de
resultados tambin es compartida con los SSR en un estudio de diversidad gentica en las
poblaciones de coco de Sri Lanka (Perera y colaboradores, 1998).
Otro de sus usos es en el anlisis de las relaciones filogenticas. Por ejemplo, Eiadthong y
colaboradores (2000), con este objetivo, analiz 14 especies de Mangifera. Los resultados
mostraron que la variacin intraespecfica entre los 7 cultivares del mango comn fue mucho menor
que la interespecfica, e incluso fueron clasificados en un solo grupo. Estos resultados y otros
obtenidos implican que el anlisis AFLP es una tcnica eficiente y confiable para generar datos, ya
sea por estudios intra o interespecficos, en el gnero Mangifera.
 Deteccin de secuencias polimrficas mediante iniciadores complementarios a
retrotransposones.

Una parte considerable de los genomas de eucariontes consiste de ADN repetitivo. La mayora de
esas secuencias son componentes integrales del genoma y pueden ser expandidas o reducidas en
tamao pero nunca cambian su posicin. Otro tipo de secuencias redundantes son los transpones o
los retrotransposones, que son capaces de moverse de uno a otro locus. Especialmente los
retrotransposones son secuencias que ocurren de manera ms frecuente y se pueden encontrar
prcticamente en todo el genoma, por lo que se les considera buenos candidatos para ser tomados
como marcadores moleculares.

Retrotransposones.
Mientras que un transposn se mueve en el genomas como copias de ADN, los retrotransposones
son primeramente transcritos a copias de ARN y posteriormente convertidas a ADNs mediante la
transcriptas reversa, incorporndose posteriormente a un nuevo sitio genmico. Dos diferentes
clases de retrotransposones pueden ser discernidos:

(1) Retrotransposones LTR, que son secuencias flanqueadas por repeticiones terminales largas
(Long Terminal Repeats) similares a los retrovirus.
(2) Retrotransposones sin LTR, que no contienen secuencias flanqueantes LTR. Estos elementos
fueron primeramente descritos en genomas de mamferos, pero obviamente tambin son
componentes de genomas de hongos, de invertebrados y de plantas.

El mecanismo replicativo de la transposicin da lugar a un retrotransposn original por todas partes

del genoma. Sin embargo, debido a que el paso de la transcripcin introduce muchos errores, la
mayora de las copias transpuestas estn defectuosas y dan lugar a una transposicin inactiva. Por
lo tanto, existe una heterogeneidad extrema de retrotransposones dentro de un genoma (Valadez y
Kahl, 2000).
Los retrotransposones son excelentes herramientas para generar marcadores de ADN polimrfico
debido a que ellos:

Se encuentran de manera ubicua en el reino vegetal.

Estn presentes en un alto nmero de copias en la mayora de los genomas de las plantas.
Poseen un alto grado en diversidad de secuencias.
Generan polimorfismo (s) mediante insercin que permiten discriminar dentro y entre especies.

- Marcadores basados en retrotransposones.

Esta clase de marcadores permite el estudio de la diversidad gentica de individuos y poblaciones.

Adems pueden ser usados para mapeo gentico y clonacin de genes de inters agronmicos
basado en mapas. Las dos tcnicas ms relevantes por esta metodologa se describen brevemente a
continuacin, adems de una tcnica novel basada tambin en los retrotransposones:

1) Polimorfismos amplificados mediante microsatlites-retrotransposones (REMAP).

Es una tcnica que combina la ocurrencia frecuente y varia bilidad de microsatlites con la de los
retrotransposones. Se utilizan iniciadores complementarios a LTR y a microsatlites, para
amplificar regiones genmicas entre dos elementos adyacentes.
Los patrones resultantes de la amplificacin pueden ser complejos, debido a que sta tambin podr
iniciarse desde uno de los microsatlites siguientes y a partir de una secuencia LTR a otra LTR
vecina sin implicar microsatlites. De cualquier manera, todos los productos de amplificacin
pueden ser polimrficos, por lo que la informacin del contenido polimrfico procedente del
anlisis REMAP puede ser alto Valadez y Kahl, 2000).

2) Polimorfismos amplificados entre retrotransposones (IRAP).

Esta tcnia genera polimorfismos que pueden ser detectados despus de la amplificacin de la
regin genmica ubicada entre dos retrotransposones adyacentes.
Se utilizan iniciadores complementarios a las secuencias flanqueantes del retrotransposn; uno de
los cuales se recomienda est marcado, con la finalidad de evidenciar ms fcilmente los
polimorfismos.
Las secuencias polimrficas en la regin del inter-transposn, generalmente, son causadas por
mutaciones (deleciones, inserciones, rearreglos, etc). El nivel de polimorfismo detectado por la
tcnica IRAP puede ser menor que por REMAP, ya que depende solamente de la cantidad de
mutaciones presentes en la regin normal (Valadez y Kahl, 2000).

3) Repeticiones de secuencias inversas marcadas (ISTR).

El ISTR es una tcnica novel basada en la PCR que permite el anlisis del genoma en el reino
vegetal y animal.
Esta tcnica surge del estudio del ADN genmico de coco con la enzima EcoRI, el cual mostr unos
fragmentos de 1.3-1.4 kb , producto del corte con la enzima.
Estos fragmentos ms la regin espaciadora (regin sombreada en la Fig 27 B) fueron secuenciados
y revelaron una alta homologa con parte del elemento copia BARE-1 de cebada.
Basado en la presencia abundante de los elementos copia en el reino vegetal, se examinaron los
ADNs de otras especies de plantas, con el objetivo de demostrar la presencia de estos elementos en
otros cultivo adems del coco. Para esto se disearon cebadores a partir de la secuencia ya conocida
de estos elementos copia, que fueran capaces de copiar la regin entre ellos (de ah el trmino de
secuencia invertida), que es lo que realmente genera polimorfismo. Los resultados obtenidos
mostraron que la secuencia EcoRI de 1.3-1.4 kb completa, puede ser explotada para la sntesis de
cebadores ISTR y la generacin de ADN polimrfico. Adems, estas secuencias copia,
indepe ndientemente de su longitud, estn aparentemente distribuidas entre los genomas eucariticos
tal que, una amplificacin de la PCR con dos cebadores ISTR resulta en patrones de huellas de
ADN distintos y reproducibles (Fig 28).
Estos estudios fueron extendidos al reino animal e incluso a los humanos, obtenindose resultados
satisfactorios pero que precisan de un estudio a escala mayor.
Las tcnicas ISTR y AFLP utilizan el mismo procedimiento analtico (geles de secuencia). El gran
nmero de loci detectados en un nico anlisis ISTR conjuntamente con el alto porcentaje de
fragmentos polimrficos, se compara favorablemente con la recientemente desarrollada tecnologa
AFLP.
Las ventajas del ISTR sobre el AFLP son 4 fundamentalmente: (i) despus del aislamiento del ADN
no son necesarias manipulaciones adicionales en el caso del ISTR; (ii) la restriccin del ADN
genmico por dos enzimas diferentes, la adicin catalizada por la T4 ADN ligasa a los adaptadores
y la preamplificacin como parte del protocolo de la tcnica de AFLP, no solo son consumidoras de
tiempo, sino que adems, en la reaccin de ligazn se requiere ADN muy puro, el cual es
tcnicamente difcil de obtener; (iii) la adicin de nucletidos terminales nicos a los
adaptadores/cebadores AFLP para una amplificacin de la PCR discriminatoria, invoca a un equipo
de PCR confiable y altamente exacto, si se desean obtener resultados reproducibles y (iv) los 3
pasos adicionales (restriccin, ligazn y preamplificacin) encarecen la tcnica AFLP respecto al
ISTR (Rohde, 1995).
Aunque se necesitan estudios ms intensos, la experiencia tambin sugiere que la reproducibilidad
de la tcnica es alta, como lo muestra el estudio con 8 preparaciones individuales de ADN (4 con
material idntico y la otra mitad con diferente material foliar) procedente del mismo cocotero, en el
cual se obtuvieron patrones ISTR idnticos.
El hecho de que los cebadores ISTR marcados con DIG puedan sustituir al marcaje radioactivo,
permite ampliar su uso con un mnimo de equipamiento tcnico y de manipulacin y sin restriccin
por la disponibilidad de la radioactividad o la presencia de laboratorios radioistopos. Los esfuerzos
actuales estn dirigidos hacia el uso de cebadores ISTR marcados fluorescentemente para el
establecimiento de anlisis a gran escala.
Las aplicaciones prcticas del ISTR estn aparentemente centuplicadas y pueden recorrer (en el
campo de las plantas) desde la determinacin general de la biodiversidad, la caracterizacin de
especies silvestres, manejo de banco de genes, estudio sobre la gentica de las poblaciones, huellas
de variedades para su identificacin, siguiendo la introgresin de genes, estudios sistemticos hasta
una posible seleccin asistida por marcadores en el mejoramiento por la identificacin de
marcadores co-segregantes con caracteres deseables. Las posibles aplicaciones en el campo animal
y humano deben ser determinadas todava. Esta tcnica puede ser til para la identificacin de
genotipos, por ejemplo, en el aguacate. Ramirez y colaboradores (2001) evaluaron el polimorfismo
de estas secuencias espaciadoras en un grupo de 18 variedades del germoplasma cubano de
aguacate. El 100% de los genotipos fueron distinguidos usando una nica combinacin de
cebadores, por lo que cada genotipo fue caracterizado por un patrn de bandas especfico. Estos
resultados refuerzan la potencialidad de esta tcnica para este tipo de anlisis.
Otro de sus usos puede ser en el estudio de la biodiversidad gentica. Dentro de esta lnea est el
trabajo de Sensi y colaboradores (1996) con accesiones italianas de uva. Los resultados obtenidos
fueron casi idnticos a los mostrados por la tcnica AFLP en esos mismos genotipos e incluso
tuvieron un valor mayor ya que el ISTR detect ms diversidad gentica entre las varias accesiones
de uno de los cultivares de uva. Esta correspondencia de resultados tambin la comparte con los
RAPDs, donde el anlisis por ISTR del germoplasma del cocotero africano del este (EAT)
procedente de Tanzania y Kenya, mostr resultados de biodiversidad comparables con la tcnica
RAPD. Una reevaluacin de la tcnica RAPD por ISTR confirm los agrupamientos obtenidos por
la primera en 10 ecotipos filipinos (Rohde y colaboradores, 1999).
Entre sus aplicaciones est tambin la caracterizacin de patgenos. Tal es el caso de su utilizacin
en 18 aislados de P.palmivora , uno de los patgenos ms importantes del coco, detectndose un
total de 30 fragmentos de ADN polimrficos, los cuales fueron utilizados en un anlisis de
agrupamiento (Rohde y colaboradores, 1999). El agrupamiento de los aislados fue idntico (con
solo 2 excepciones) al obtenido por un anlisis RAPD (M.Coffey, comunicaciones personales).
El ISTR puede tener un valor potencial para identificar cruces ilegtimos, ya que permite seguir la
introgresin de loci genticos en un material hbrido. Esto lo demuestra el estudio que se realiz a
28 genotipos que representan el material de Africa y sudeste de Asia de Elaeis guineensis (palma
aceitera), tanto como 2 palmas E.oleifera y 2 F1 del cruce entre E.guineensis y E.oleifera. Algunos
de los marcadores polimrficos especficos para E.guineensis y E.oleifera estn representados
claramente en las 2 palmas hbridas (Rohde y colaboradores, 1999).

Marcadores basados en la PCR y la hibridacin tipo Southern.

Amplificacin aleatoria del polimorfismo de microsatlites (RAHM; RAMPO).

La tcnica de RAHM (Random Amplified Hybridization Microsatellite Polymorphisms), permite

optimizar la informacin obtenida con cualquiera de las tcnicas de la PCR, por ejemplo, las huellas
de RAPDs, MP-PCR AMP -PCR. Las huellas de ADN detectadas con estas tcnicas se refieren
como marcadores de primera generacin. La optimizacin consiste en la deteccin, mediante
hibridacin con sondas de huellas de microsatlites presentes en los amplicones sintetizados durante
la PCR.
Los patrones de bandeado RAMPO obtenidos con MP -PCR y AMP-PCR han mostrado una mayor
complejidad respecto a los detectados por RAPDs , sin embargo, son altamente reproducibles;
adems de que todas las diferentes secuencias principales de microsatlites pueden utilizarse como
sondas.
La mayora de las posibilidades de combinaciones de iniciadores de RAPD y sondas de
microsatlites, no son limitantes para hacer de la tcnica RAMPO una fuente rica de marcadores
moleculares. Esta tcnica extiende la informacin contenida en geles de RAPDs MP-PCR al
menos de 5-8 veces y las bandas obtenidas pueden ser clonadas y usadas para sondas de RFLPs o
como puntos de inicio para el aislamiento de marcadores de microsatlite de locus especfico
(Valadez y Kahl, 2000).

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