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FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD DE CHILE
“Efecto de las macromoléculas organicas de la Valva de
Diplodon chilensis (Bivalvia: Hyriidae)
en la cristalizacion del carbonato de calcio in vitro”
Memoria de Titulo
Entregada ala
Universidad de Chile
en cumplimiento con los requisitos
para optar al Titulo de
Ingeniero en Biotecnologia Molecular
Por
Patricio Andrés Spencer Moya
Enero, 2007
Santiago — Chile
Director de Tesis: Dr. José Luis Arias Dedicado a mi novia Isabel Curilem y mi hijo Nawel Ya
“Un momento una vida”
PD.@DDDDLDDDDDDDDSOS®D
).@.: AO. 0.0: 8:9.0:0.0.20.2:
2. 9.OD.0.00080800008000888
@:@. D:LBG® ®020DLDOL:2.
0.0.0 000¢.0.00
Agradecimientos
Al Centro para Investigacién Interdisciplinaria Avanzada en Ciencias de los
Materiales (CIMAT), por apoyar y entregar la infraestructura necesaria para
el desarrollo de esta tesis.
Al Dr. José Luis Arias por la guia y el apoyo entregado en la conduccién de
esta tesis.
Al Dr. Andrénico Neira-Carrillo por los consejos entregados para el
desarrollo de esta tesis.
A mis abuelos, padres y hermanos por entregar los valores, la confianza y
solidaridad necesaria para la gestacion de este proyecto.
Y en especial a mi novia Isabel por sus hermosas palabras y cAlido apoyo
necesarios para la culminacién de este proceso y el inicio de un gran
proyecto.
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indice de contenido
Dedicatoria... .
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Agradecimientos...
Indice de tablas............
indice de figuras...
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Lista de abreviaturas.
Resumen........... ei
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Abstrar
Introduccién....
1.Bioceramicas.............
2MOlUSCOS...... ce ceecocee teres
2.4.Matriz Organica...
2.1.1.Bivalvos....
3.Carbonato de calcio (CaCOp)....--.-
3.1.Calcita.
3.2.Aragonita.....
B.BVaterttan.ccseeccessscsenseeeeee 4 5
Hipétesis. Z
Objetivos Generales. 8
Objetivos Especificos.. 28
a)
Materiales y Métodos.
1.Andlisis mediante microscopia electronica de barrido (SEM)
2.Caracterizacion espectroscépica de la valva de Diplodon chilensis.
2.1.Espectroscopia Raman...
iv 0. @.0.0:0:0:2:0:0.0.0:8:2: DBD BO: OOD.DDDD:O:90:90008008 0880008 CO888
2.1.1,Descripcién de la preparacién de la valva de Diplodon
chilensis para analisis espectroscépico Raman. 7
2.2, Espectroscopia Infrarroja (FT-IR). a)
2.2.1. Descripcién de la obtencién de fracciones solubles &
insolubles del periostraco y ostraco para caracterizacion
por FT-IR At
3. Analisis mediante electroforesis.... at
3.1. Descripcién de las condiciones electroforéticas... . 12
4, Ensayo de cristalizacién in vitro... 12
5. Determinacién mediante XRD de la presencia de polimorfos cristalinos
obtenidos en los ensayos de cristalizacién de CaCO, in vitro. 14
5.1. Descripcién de las condiciones de las muestras para andlisis por
difraccién de rayos X (XRD)... 15
6. Modelamiento del habito cristalino de carbonato de calcio obtenido en
los ensayos de cristalizacién..... 15
Resultados 16
1.Descripcién morfolégica de la valva de Diplodon chilensis......... 16
2.Caracterizacién morfolégica de las distintas fracciones de la valva de
Diplodon chilensis 2B
3.Caracterizacién de la valva de Diplodon chilensis mediante
espectroscopia Raman, 720)
4.Caracterizacion de las fracciones obtenidas de la matriz orgénica de las
valvas de Diplodon chilensis mediante FTIR y electroforesis
SDS-PAGE... seen ties is 22 2. ODDBLDDODODDDDDDDISHHHHHHHHHOSOOLEE
:
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©.0.0.0.
4.1. Caracterizaci6n del periostraco, ostraco y fraccién insoluble del
ostraco (fio) mediante FT-IR 22
4.2. Caracterizacién de la fraccién soluble del ostraco (fs0) mediante
FT-IR y electroforesis SDS-PAGE.......-...-+.000 227
5, Influencia de las distintas fracciones de la valva de Diplodon chilensis
(pd, p deldp, fio de, fio de/dp y fso) en la cristalizacién de carbonato de
calcio in vitro. a)
6. Determinacién de polimorfos cristalinos obtenidos en los ensayos de
cristalizacién de CaCOs in vitro con aditivo mediante XRD.......-...-.--
Conclusion
Discusion
1 Periostraco......
4.4, Estructura... eo
4.2. Influencia en la mineralizaci6n del carbonato de calcio
in vitro.. .
2. Ostraco. nol
2.1.Estructura.... .37
2.1.1. Fraccién insoluble del ostraco..... 37
2.1.2, Fraccin soluble del ostraco.
2.2. Influencia en la mineralizaci6n del carbonato de calcio
38
in vitro...
38
2.2.1. Fraccién insoluble del ostraco..
2.2.2, Fraccion soluble del ostraco.
3, Modelo propuesto......
vi 43
45)
AS
vil
Stains-all ....
Bibliografia
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e08e0e008 SOHOOCHSSHHOO OHSS S SHS OOOH SESH OOOO HOOD OOS indice de tablas
Tabla N°1 Resumen de las condiciones experimentales de cristalizacion de
carbonato de calcio (CaCOs) in vitro...... 213,
viii
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$ 1 D.D.D.D 2029800800090 000009
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indice de figuras
Figura 1: Seccién radial de! manto de un bivalvo.......
Figura 2: Polimorfos de carbonato de calcio,
Figura 3: Valva de Diplodon chilensis.
Figura 4: Esquema del método Sitting-Drop usado en ensayos de cristalizacién
in vitro..
Figura 5: Reflexién de un haz de rayos X por los planos (hkl) de un cristal...........14
Figura 6: Morfologia de la vista lateral de la valva de Diplodon chilensis mediante
microscopia electronica de barrido (SEM)... AT
Figura 7: Morfologia de la vista dorsal de la valva de Diplodon chilensis mediante
18
microscopia electronica de barrido (SEM).
Figura 8: Morfologia del periostraco y de la fraccién insoluble del ostraco (fio)
por microscopia electronica de barrido (SEM)....
Figura 9: Espectro Raman de la valva de Diplodon chilensis............--werwee- 2A
Figura10: Espectro Infrarrojo ( FT-IR) de la valva de Diplodon chilensis...........-.23
Figurat1: Espectro Infrarrojo ( FT-IR) de la region periostracal de la vaiva de
Diplodon chilensis.
Figura12: Espectro Infrarrojo (FT-IR) de la region del ostraco de la vaiva de
Diplodon chilensis......
Figura13: Espectro Infrarrojo (FT-IR) de las fracciones descalcificadas y
desproteinizadas del ostraco y periostraco de a valva de Diplodon
CHIENSIS.........oe sos sseeee cess eeseeeeee 26
Figura14: Espectro Infrarrojo (FT-IR) de la fraccién soluble del ostraco
descalcificado (fsode) de Diplodon chilensis.................. cesses 2B Figura: Electroforesis denaturante (SDS-PAGE) de la fraccién soluble de! ostraco
descalcificado (fsodc) de Dipladon chilensis... cere BB
Figura‘6: Cristalizacién de carbonato de calcio in vitro con fraccién soluble del
costraco descalcificado (fsodt).... 29
Figura17: SEM de cristales de carbonato de calcio in vitro usando los substratos del
periostraco (p dc y p de/dp ) y de Ia fraccién insoluble del ostraco (fio dc
y fio de/dp):...... od
Figura18: SEM de cristales de carbonato de calcio in vitro cristalizados con fraccién
soluble del ostraco descalcificado (fsodc) sobre los substratos de
periostraco (p dey p de/dp) y traccién insoluble del ostraco (fio de y fio
de/dp):. 32
Figura19: Difraccion de rayos X (XRD) de cristales de carbonato de calcio
cristalizados durante 24 horas en presencia de fraccién insoluble de!
ostraco descalcificado (fs0 dc). aS
Figura 20: Modelo de la cristalizacién in vivo de la valva
die Diplocion chilensis......o.-.--ssssesseseesestnseneeseen 0
Figura 21: Molécula de Stains-all.............. ss cose eeeeececttenennneeeses ces e
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Lista de abreviatur:
ZPO: zona prismatica del ostraco:
ZPN: zona nacarada del ostraco
CaCO,: carbonato de calcio
T: temperatura
P: presion
Ca®*: i6n calcio
CO;*: i6n carbonate
°C: grados Celsius
XRD: difraccién de rayos X
SEM: microscopio electrénico de barrido
FT-IR: espectro infrarrojo con transformada de Fourier
ngitud de onda
micron equivalente a 10°
um: micrémetro equivalente a 10° metros
7: ndmero de ondas
cm: centimetro equivalente a la centésima parte de! metro
mi: millitro equivalente a 10° litros
uk microlitro equivalente a 10° litros
M: concentracién molar
‘mM: milimolar equivalente a 10° M
v: frecuencia de radiacién
AE:
ariacion de energia
n: numero de grados de libertad
N: numero de atomos Ac: acido
hrs: horas
P: periostraco
pdc: periostraco descalcificado
p dcldp: periostraco descalcificado y desproteinizado
©: ostraco
fiode: fraccién insoluble del ostraco descalcificada
fio deldp: fraccién insoluble del ostraco descalcificada y desproteinizada
fsode: fraccion soluble del ostraco descalcificada
a: aragonita
v: vaterita
c: calcita
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O08. 6.20.:0:O:O:6:O:0:O:G.9:O-G-O-O.0:O-8:'O 8-O-O-O98008000008CO8HOOTOS OOO SWOSOOO OOS OOOO OS 00000008 CHHHOOTZE
00 CeO 660:
Resumen
En este estudio se utilizé como modelo de biomineralizacién a Diplodon chilensis.
Molusco de agua dulce, el cual posee dos valvas cubiertas por una delgada cuticula
llamada periostraco y constituidas en su interior por una region mineralizada de
carbonato de calcio llamada ostraco, la cual se encuentra formada por dos zonas,
una prismatica y. otra nacarada. El periostraco (p) y el ostraco (0) fueron
separados mec&nicamente y analizados por FT-IR y SDS-PAGE. Una vez
separados, el periostraco fue desmineralizado (pde) con écido formico 10% y
desproteinizado (pdcldp) con NaOH 1M. De igual modo el ostraco fue
desmineralizado obteniendo dos fracciones una soluble (fs0 de) y otra insoluble (fio
dc), de las cuales sélo la fraccién insoluble fue desproteinzada (fio de/dp). Luego el
carbonato de calcio fue cristalizo en presencia tanto de diferentes periostracos (pdc,
pdcldp) como de diferentes fracciones del ostraco (fso, fio, fio de/dp). Para el
‘experimento de cristalizacién se us6 el método Sitting-Drop.
Los resultados mostraron que tanto el periostraco como la presencia de
macromoléculas orgénicas del ostraco indujeron cambios en la morfologia del
carbonato de calcio. Concluyendo que la presencia de fraccién soluble es necesaria
para la formacién de vaterita dentro del antrum y que la presencia de proteinas
tanto en la superficie del periostraco como en la superficie de la fraccién insoluble
de! ostraco inducen cambios morfolégicos al habito cristalino de carbonato de
calcio.
xii O.0.0 0.0: 0.0.0. 0.9:.2.0.0-BD.O.®.®O.O.O.D:O.D-O-0.9.008 9888 OCOCHCOCODDOO
Abstract
In this study we use the Diplodon chilensis fresh-water mussel as a
biomineralization model. The Diplodon chilensis have two shell's covert with a thin
cuticle called periostracum and the inner ostracum zone composed by the prismatic
and nacre part of calcium carbonate. The periostracum (p) and ostracum (0) was
detached and analyzed by FT-IR and SDS-PAGE technique. The periostracum zone
was demineralizated (pdc) and deproteined (pdc/dp). The ostracum was
demineralizated by using formic acid. From the demineralization process, ostracum
soluble fraction (fs) and ostracum insoluble fraction (fio) was obtained.
Deproteinization of the fio was done (fio de/dp). Calcium carbonate crystallization in
the presence of different periostracum (pde, pdc/dp) and ostracum phase fractions
(f50, fio, fio de/dp) was made. For the Crystallization experiments the sitting-drop
method was done.
These results showed that periostracum and the presence of organic phase
macromolecules induced change on the calcium carbonate morphology. Were the
fsodc is need to produce vaterite into the antrum. And other way, the periostracum
proteins and fiode protein induce change in tha cristaline grove of the calcium
carbonate.
xiv OOO © OOOO: O69 8 FHGSHHHHHHHHBHSHHOHHHOOHHOHOHOHEOO
Introduccién
1. Biocerémicas
La mayoria de los animales producen tejidos mineralizados tales como cascaras de
huevo, conchas de moluscos, huesos y diente entre otros, conocides como
Biocerémicas. Estas estructuras son consideradas biocompositos constituides por
sales inorganicas y biomacromoléculas (que constituyen la matriz orgénica)
(Lakshminarayanan et al, 2002). Su produccién involucra un exquisite nivel de
control molecular tanto en la regulacién espacial de la nucleacién como en el
crecimiento de! mineral y en el desarrollo de microestructuras durante su formaci6n.
En este proceso, biomacromoléculas Acidas unidas a una superficie organica
(secretada por células) interactiian con grupos funcionales iniciando la nucleacién y
el crecimiento de la fase inorganica. Esta interaccién permite adoptar un habito
cristalino particular ditigido por la matiz orgénica y asumir una orientacién
delerminada por esta (Heuer et al, 1992).En algunos casos esta interaccién
determina tanto el tipo de polimorfo como el lugar especifico donde este se
depositara (Belcher et al, 1996; Thomson et al, 2000; Blank et al, 2003), tal es el
caso de los moluscos.
2. Moluscos
Invertebrados de cuerpo blando y simet
bilateral (a veces desfiguradas por
torsion), poseen una masa muscular ventral llamada pie (por servir para la
locomocién) y estan envueltos en un gran repliegue tegumentario (Clavet Pons,
1998).
Se caracterizan por ser mineralizadores de una gran versatilidad, tanto en el tipo de
mineral depositado como en la variedad de estructuras mineralizadas, siendo estas,
en su mayoria, formadas extracelularmente. La complejidad de su arquitectura es
debida al control que ejerce el repliegue tegumentoso, conocido como manto 0 e
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palium (figt). El manto esta constituido por una capa Unica de células epiteliales
encargadas tanto del movimiento de iones minerales al sitio de depésito, como de
la secrecién de matriz organic
que llegard a ser la matriz de depésito (Simkiss &
Wilibur , 1989).
24. Matriz Organica
La microestructura de la concha de los moluscos (la zona del ostraco en el caso de
bivalvos) es el resultado de una unién intima entre la matriz orgénica con la fase
mineral. Esta matriz rodea y separa los cristales individuales y es responsable de la
morfologia laminar de la fase mineral en la estructura de la concha. A ella se le han
atribuido cuatro tipos de
luencias relacionadas con el crecimiento de la concha,
Jas cuales son: nucleacién, orientacién, tipo y tamafio del cristal.
Experimentalmente esta matriz puede ser separada en dos grandes fracciones, una
Fraccién Soluble y una Fraccién Insoluble (Simkiss & Willbur, 1989; Pereira
Mouriés et al, 2002).
Fraccién Soluble: Sus principales componentes son, polipéptidos
polisacaridos, y glicoproteinas. Los primeros poseen un alto contenido de residuos
Acidos como aspartato y glutamato, en cambio los ultimos un alto contenido de
grupos sulfatos. Son estos residuos écidos (carboxilato y sulfato) los que participan
tanto en la unién del calcio como en la nucleacién
Fraccién Insoluble: Contiene tanto proteinas con altas concentraciones de
residuos de fenilalanina y tirosina como quitina,
El estudio de la composicién de la matriz organica (fraccién soluble e insoluble) y su
articipacién en los tejidos mineralizados, han sido motivo de un amplio debate,
encontréndose investigaciones relacionadas con la matriz organica soluble
insoluble de Bivalvos como Pinctada maxima (Pereira Mouriés et al, 2002;
Balmain et al, 1999; Bédouet et al, 2001), Pinctada fucata (Samata et al,1999), 1O.@.©.0.0.0:0:9.8.9.9.0.9 9-9.2.9.09 89D 9H9GSSHOSOOHCOHH8HO8O8DE
Balmain et al, 1999; Bédouet et al, 2001), Pinctada fucata (Samata et al,1999),
Atrina rigida (Gotliv et al, 2003), Cassostrea gigas (Choi & Kim, 2000) y de
Gastrépodes como Haliotys laevigata. (Weiss et al, 1999), Haliotys tuberculata
(Bédouet et al, 2001) y Haliotys rufescens (Shen et al, 1997).
Es asi como uno de los grupos de moluscos més estudiados han sido los Bivalvos
marinos, los cuales se encuentran en abundancia en las costas, produciendo una
de las biocerémicas mas apetecidas, la perla. A continuacién, se describirén las
partes principales de la anatomia de Jo€ estos moluscos.
2.1.1. Bivalvos
Moluscos con un exoesqueleto formado por dos valvas unidas por medio de una
chamela (articulaci6n en los bivalvos). Ellas se encuentran exteriormente revestidas
por una delgada cuticula llamada periostraco, e intemamente por dos zonas
microscépicas de carbonato de calcio, formando el Ostraco, llamados: Zona
Prismética (ZPO) y Zona Nacarada o Madre Perla (ZPN). Inmediatamente después
‘se encuentra el manto (fig), que al ajustarse en el borde permite la salida del pie y
uno 0 dos sifones, uno de los cuales sirve para expeler el agua y el excremento 0
cualquier otro residuo (Clavet Pons, 1995).
Figt, Seccién sagital del manto de un bivalvo: muestra la relacién entre la valva y el manto.
Donde ZPO y ZNO son Ia zona prismatica y la zona nacarada o madre perla det
COstraco, resoectivamente. ©.9D DDD DDD DDDHHHDHHOHSHHHOOHHOOHOLDDO
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‘A continuacién se describe el carbonato de calcio (CaCOs), componente inorganic
que forma parte del ostraco y se encuentra minuciosamente regulado por
biomacromoléculas de la matriz organica responsables de la resistencia a fracturas
de la concha, la cual es 3000 veces més que la aragonita cristalina pura, (Bédouet
et al, 2001).
3. Carbonato de calcio
Mineral muy abundante en la naturaleza, se presenta en masas compactas més 0
menos puras (piedras de construccién, marmol, creta y biocerdmicas). Es insoluble
en agua pura y soluble parcialmente en aguas que contienen anhidrido carbénico
disuelto (formacién de estalactitas y estalagmitas):
Ca** (acy + ZHCO3 (acy) <—> CaCOs;e) + CO2(9) + HOW
El carbonato de calcio forma diferentes tipos de cristales tales como: rombohedros
(espato de Islandia y calcita) y prismas rémbicos (aragonita) entre otros (Biblioteca
Temética Educacional, 1986). Estos diferentes tipos de cristales de carbonato de
calcio se consideran polimorfos cristalinos, pues son estructuras distintas de un
mismo compuesto quimico (CaCO:) y cuya cristalizacién depende de la
temperatura (T), presién (p) 0 de ambos, describiendo a escala microscépica
habitos cristalinos caracteristicos (fig2. d-).
Es asi como los polimorfos mas habituales de CaCO; en la naturaleza son calcita,
aragonita y en menor medida vaterita. Siendo la calcita la més abundante y mas
estable bajo condiciones ambientales.
3.1, Calcita
Es descrita por un numero de celdas unitarias incluyendo el clivage de la celda
(rombohedro morfolégico) (fig2.d), el cual es cominmente usado en estudios
morfolégicos del cristal y contiene cuatro unidades de CaCOs. Por conveniencia se e
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usa la_celda unitaria hexagonal que contiene seis unidades de CaCO; (fig2.a)
esta celda muestra la organizacién de la estructura de la calcita en donde ef Ca” y
‘el CO; son localizados en capas altemadas perpendicular al eje c. Ademas los
grupos CO," son orientados idénticamente en una misma capa y alternadamente
en capas adyacentes (Meldrum, 2003).
3.2. Aragonita
La aragonita es descrita por una celda unitaria ortorémbica en la cual el ion metélico
se encuentra en un arreglo pseudohexagonal. Donde el calcio y el carbonato se
encuentran organizados en capas altemadas perpendiculares al eje c (fig2.b),
ademas las capas de carbonato se encuentran divididas en dos capas paralelas al
eje a manifestandose en forma acanalada (Meldrum, 2003).
3.3. Vaterita
Esta tercera forma del! carbonato de calcio es descrita también por una celda
unitaria hexagonal donde el calcio y el carbonato se encuentran organizados en
capas altemadas, pero en contraste a la calcita y a la aragonita, el plano del
carbonato es paralelo al eje c (ig2.c) ( Meldrum, 2003).
En condiciones experimentales estos polimorfos cristalinos son altamente sensibles
a la temperatura, supersaturacion y a la presencia de aditivos. Es asi como la
calcita precipita tipicamente a temperatura ambiente, no asi la aragonita que es
producida en solucién a temperatura cercanas a los 100°C (Meldrum, 2003). Fig.2 Polimorfos de carbonato de calcio:
(a-¢) Distribucién atémica de los polimorfos cristalinos de CaCO; (Falini et af,2000):
a) calcita, bjaragonita, c) vaterita,
(d-f) Habito cristalino caracteristico de cada polimorto.( Neira et al,2003; Colfen & Markus,1998):
4) calcita, e) aragonita, £) vaterita.
(gh) Tipos de hébitos cristalinos en la concha de moluscos bivalvos marinos.( Blank et al,200:
9) calcita ,h) aragonita
Siendo la valva de los moluscos marinos altamente mineralizada y con excelentes
OOOOH OCOSS OOOOH SHHTHHHHHHOHHOHHHOHO888O8228
propiedades mecanicas resulta interesante conocer si los Bivalvos que habitan en
lagos y rios posean las mismas caracteristicas, considerando que la concentracién
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ooo QBODOOHDHDDHDHOHDDHDHOHHHOHHHHHHOHHOHSOO
O:6.0.0:0:0: OO 0:0:09:9
de calcio, en estos ecosistemas dulce acuicolas, es menor que en la mar, se
debiese esperar diferencias entre ambos Bivalvos.
Fig.3 Valva de Diplodon chilensis:
Vista dorsal (D) y ventral (V)
En el presente trabajo se utilizaré como modelo la valva del bivalvo dulce acuicola
Diplodon chilensis (Gray 1828) (fig.3), conocido como almeja de agua dulce,
eficiente bombeador y filrador, distribuido ampliamente en rios y lagos del centro -
sur de Chile y Argentina. En Chile, se distribuye desde el rio Mataquito - Curicé
(34°58' S; 71°48'W) hasta el rio Negro - itsmo de Ofqui (46°37'S;74°10'W) y en
Argentina se distribuye desde Mendoza (32° 52'S; 68°51'W) hasta Chubut (45°5 1'S;
67°28'W) (Jara-Segue! et al, 2002).
Dado que las macromoléculas biolégicas participan directamente en los procesos
de cristalizacién de la concha en bivalvos marinos in vivo, entonces fracciones de
macromoléculas obtenidas de la valva de Diplodon chilensis (bivalvo de agua dulce)
influirian en la cristalizacién de carbonato de calcio in vitro. e
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Objetivos Generales
Describir fa morfologia de Ia valva de Dipiodon chilensis
. Obtener y caracterizar las fracciones que contengan macromoléculas organicas
de la valva de Diplodon chilensis
|. Determinar la influencia de estas fracciones en los ensayos de cristalizacién in
vitro del carbonato de calcio
Objetivos Especificos
Analizar mediante microscopia electrénica de barrido (SEM) la valva de
Diplodon chilensis
. Caracterizar mediante espectroscopia Raman la concha de Diplodon chilensis
Obtener fracciones solubles e insolubles de periostraco y ostraco.
|. Caracterizar por FTIR. las fracciones obtenidas de la matriz organica de las
valvas de Diplodon chilensis.
“Determinar electroforéticamnente los componentes de la fraccién soluble
. Estudiar la influencia de las distintas fracciones en la cristalizacién in vitro de
carbonate de calcio
Determinar mediante XRD la presencia de polimorfos cristalinos obtenidos en
los ensayos de cristalizacién de CaCO; in vitro.
Modelar el habito cristalino de carbonato de calcio obtenido en los ensayos de
cristalizacion, e
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Materiales y Métodos
4. Andlisis mediante Microscopia Electronica de Barrido (SEM).
4.1 Descripcién de la preparacién de la valva de Diplodon chilensis para
Microscopia Electrénica de Barrido (SEM):
Se tomaron valvas de Diplodon chilensis que fueron tratadas mecanicamente
de dos formas diferentes: unas se rompieron en forma sagital y en otras el
Periostraco fue separado del Ostraco. Luego las muestras se sombrearon con
oro y fueron vistas en el microscopio electronico de barrido.
2. Caracterizacién espectroscépica de la valva de Diplodon chilensis.
Tanto la espectroscopia Raman como Infrarroja_conforman la espectroscopia
vibracional, ambas técnicas dan informacién de transiciones entre niveles
vibracionales. Sin embargo, son diferentes los mecanismos que inducen dichas
transiciones. Asi, en la espectroscopia infrarroja las moléculas absorben
énergia y pasan de un nivel vibracional a otro, mientras que el efecto Raman lo
hace a través de un fenémeno de dispersion de radiacién (scatering).
241, Espectroscopia Raman: (Contreras, 1987)
El efecto Raman, fue expuesto a la comunidad cientifica en 1928 por C.V.
Raman, la fuente de radiacién usada fue la linea azul indigo de una lampara de
mercurio y la luz dispersada se analizé en un espectrografo. C.V. Raman,
comenzé buscando el componente éptico andlogo al efecto Compton, donde los
rayos x dispersados por un bloque de grafito poseen dos componentes, una que
correspondia al rayo incidente y el otro cuya frecuencia estaba desplazada en
una cantidad que dependia del angulo de dispersion, pero que era
independiente de la longitud inicial. Es asi como, poco después del
descubrimiento de C.V. Raman numerosos investigadores franceses y rusos
informaron sus resultados sobre este nuevo fenémeno, provocando un
sostenido interés entre fisicos y quimicos de entonces. Sin embargo, esta nueva SOCHOSHOSNHSHHHFHDHSSSHHSHHHHSOHHHESOHSOHHHHHHHOHOOH88O
10
técnica poseia limitaciones, dado que el efecto Raman observado es de muy
baja intensidad. S6lo, en 1960 con el advenimiento del laser y mas tarde con el
surgimiento de eficientes sistemas de.deteccién, se inicié el resurgimiento de la
espectroscopia Raman.
2.4.1. Descripcién de ta preparacién de la valva de Diplodon chilensis para
andlisis espectroscépico Raman:
Para este estudio se utiizé un equipo LabRam 010 en el que se analizaron las
zonas prismaticas (ZPO) y nacaradas (ZPN) del ostraco de las valvas de
Diplodon chilensis obtenidas segtin descripcién 1.1.
2.2. Espectroscopia Infrarroja (FT-IR) (Hesse et al,1997):
Las rotaciones y vibraciones moleculares pueden ser excitadas por la
absorcion de radiacién en la regién infrarroja del espectro electromagnético. La
posicién de una banda de absorcién en el espectro IR es expresada en
inidades de longitud de onda 4 (en » 0 um) de la radiacion absorbida. No
obstante es mas usado el de numero de ondas 7 el cual corresponde al
inverso de A, asi se tiene: 7 = 1/2. La ventaja del nimero de ondas es la de ser
proporcional tanto a la frecuencia de radiacién (v) como a la energia (AE)
absorbida.
EI nimero de vibraciones posibles de una molécula comploja puede ser
determinado por la siguiente regia:
Para moléculas lineales n=3N-5
Para moléculas no lineales n=3N-6
(nes el ndmero de grados de libertad y N el nimero de étomos) SOO SHSHOSSHSHHSSSHHSHHHHHHHHHHHSCHHHHHHHHHHOHHSHOOO
Por otro lado el estado vibracional pueden estar determinados por
Eli
de vibracién:
Vibracién stretching: altera la longitud del enlace
Vibracién bending: altera el angulo de enlace, no cambiando la longitud
-El tipo de simetria:
Vibracién simétrica (s): retiene la totalidad de la simetria molecular
Vibracién antisimétrica (as): distorsiona uno 0 més elementos de simetria
2.2.1, Descripcién de la obtencién de fracciones solubles e insolubles del
periostraco y ostraco para caracterizacién por FTAR:
Se tomaran 20 valvas de Diplodon chilensis, a las cuales se les extrajo el
Periostraco mecénicamente, y entonces fueron obtenidas tanto el ostraco como
el periostraco. La fraccién del ostraco (0) fue molida hasta polvo y otra fraccién
fue directamente descalcificada en 10% de Ac. Férmico con agitacién durante
24 hrs, con lo que se obtuvo una mezcla heterogénea, que fue dializada contra
agua destilada durante 3 dias usando bolsa de didlisis Spectrum ® con un
tamaiio de poro de 3,5 MWCO y luego centrifugada para posteriormente
obtener dos fracciones: fraccién soluble del ostraco descalcificada (fs0 dc) y
fraccién insoluble del ostraco descalcificada (fio dc), que luego fueron
liofilizadas. Ademés, el periostraco (p) fue molido hasta polvo, para luego ser
descalcificado, dializado y liofilizado, bajo las mismas condiciones que la
muestra anterior, obteniéndose un periostraco descalcificado (pdc). Luego, la
fraccién insoluble del ostraco y la fracién descalcificada del periostraco fueron
desproteinizadas con 20 mi de NaOH 1M, durante 20 hrs con agitacién a
temperatura ambiente, obteniéndose tanto fracciones insolubles del ostraco 12
descalcificadas y desproteinizadas (fio de/dp) como periostracos descalcificados
e
e y desproteinizados (p de/dp),
. De cada una de las muestras (0, .f0 de, fio de, fio de/dp, p, pdc, p dc/dp) se
formé una pastila al 2% KBr que fue analizada usando un equipo Bruker Vector
6
e 22.
e : :
e 3. Analisis mediante electroforesis.
e 3.1 Descripcién de las condiciones Electroforéticas :
La Fraccién soluble de Ostraco (fs0 dc) fue analizada electroforéticamente
usando un gel denaturante de poliacrilamida (SDS- PAGE) al 15%, con un
potencial de 80 volt en el gel concentrador y 100 volt en el ge! separador, para
luego ser tefiido primero con Stains-all (ver apéndice, pag. 43) y enseguida con
Plata (Gottiv et al, 2003).
4, Ensayo de cristalizacién in vitro.
4.1 Descripcién de tas condiciones para los Ensayo de cristalizacién in
vitro:
Para la aplicacién de esta técnica se usd el método Sitting-Drop (Fig 4) que
consiste en una cémara de mineralizacién cerrada, a la cual se le coloca en el
fondo 3ml de una solucién de bicarbonato de amonio 25mM y en los
micropocillos se adiciona una solucién de cloruro de calcio 200mM, disuelto en
17
|)’ Buffer Tris 200mM a pH9. Los ensayos se desarrollaron a 24 y 48 hrs, siguiendo
las condiciones experimentales de la Tabla N°1.
PPOPLOPODDDDIDPD PDI DODD
PO.
|
ae;
Fig.4 Esquema del método Sitting-Drop usado en ensayos de cristalizaci6n
in vitro: a) Camara de Mineralizacién; b) micropocillo
@.@ ©. 0.0. SC COHHHSHHHSHSHHOOHHOHHSOSHHOSOH OOOOH OSCOOHOOCOOSDO
13
Tabla N°1: Resumen de las condiciones experimentales de cristalizacion de
carbonato de calcio (CaCO;) in vitro.
]
Aditivo Substratos
Namero'de P FIO
Micropocities | FSOPC | PPC |FIOPC| pomp | nciDP
Control . : . : :
= —
ql + i z = >
7 z + - . :
5 : > + 5
A _— : = =
. + : 7 . =
; 6 : - é -
7 : i] : :
7 lee = +
5 i Z S 5 +
La preparacién de las muestras de la Tabla N° se realizé de la siguiente manera:
+ Preparacién de la fraccién soluble del ostraco descalcificado (fs0
dc) como aditivo:
Una alicuota de fsode (7Oug/ul) fue solubilizada en 100, de cloruro de
calcio (200mM) llegando a una concentracién final de 26,46 uig/ul de fsodc,
depositandolo como aditivo en cada micropocillo.
* Preparaci6n de los substratos (pdc, p dc/dp, fio de y fio de/dp):
La fase s6lida de cada substrato fue colocada al interior del microposillo que
le correpondia segiin tabla N° 1. OC OOOOH SOHHLOSHHOOHHOLHOHHOSH OOOOH OOOO OOOO OOOOO
4
Una vez realizados los ensayos de cristalizacién in vitro a 24°C, los micropocillos
fueron sombreados con oro y observados al microscopio electrénico de barrido
(SEM) en un equipo TESLA BS 343 A.
5. Determinacién mediante XRD de la presencia de polimorfos cristalinos
obtenidos en los ensayos de cristalizacién de CaCO, in vitro.
Para analizar la estructura cristalina y determinar los tipos de polimorfos se utiliz6 la
técnica de difraccién de rayos X (XRD), debido a que las longitudes de onda de
algunos rayos X son del mismo orden de magnitud que las distancias entre planos
de dtomos en sélidos cristalinos. De esta manera cuando un haz incidente de rayos
X monocromatico de longitud de onda A golpea un conjunto de planos cristalinos
con indice de Miller (Aki), en un dngulo tal que los diagramas de ondas reflejados
del haz dejan a los diversos planos en fase, entonces se produce un reforsamiento
del haz conocida como interferencia constructiva o difraccién (fig. 5a), pero cuando
el haz incidente deja a los planos en una situacién fuera de fase, da lugar a
interferencias destructivas (fig. 5b).
Ears
a
Fig.5 Reflexion de un haz de rayos X por los planos (hk) de un cristal: a) Para
el angulo de Bragg,9, los rayos reflejados estan en fase y se refuerzan
mutuamente; b) Para angulos arbitrarios de incidencia no se produce haz reflejado e
°
e
e
e
e
e
e
°
e
e
e
e
e
°
e
e
e
°
e
9
@
e
e
e
e
e
e
@
g
e
s
e
e
e
e
e
e
@
e
e
®
15
Para que tanto los rayos incidentes como reflejados estén en fase, la distancia extra
de recorrido del rayo reflejado debe ser un numero entero de longitudes de onda A.
1 A= 2dnwSend con n=1,2,3,...
Conocida como ley de Bragg donde n es el orden de la difraccién. En la mayor
De este modo:
parte de los casos se utiliza el primer orden de difraccién y asi la ley de Bragg
adopta la forma:
AB 2dsen® con n=1
5.1. Descripcién de las condiciones de las muestras para anilisis por
difracci6n de rayos X (XRD):
Para la obtencién de cristales de carbonato de calcio en presencia de aditivo fso de,
‘86 us6 el método Sitting-Drop (descrita en el punto 4.1). Se colocaron 14 micro
pocillos con un trozo de filtro inerte (Sepraphore III, Gelman Sciences Inc) en su
interior. Luego, sobre este filtro se depositaron 4uL de aditivo fso de (70yg/uL), para
enseguida adicionar, en cada uno de ellos, 35L de cloruro de calcio (200mM),
llegando a obtener una concentracién final del aditivo de 8ug/ul, en cada micro
pocillo, Una vez realizados fos ensayos de cristalizacién de carbonato de calcio in
vitro (24 horas a 24°C), los filtros fueron deshidratados en una estufa de secado a
37°C por ‘hr y analizados por XRD en un equipo Simens D-5000.
6. Modelamiento del habito cristalino de carbonato de calcio obtenido en los
ensayos de cristalizacién.
Para él modelamiento del habito cristalino de carbonato de calcio se uso el software
JCristal. PDGDODDDOGHOOOOHOCHOOCHNDO
92 LPIDO@ OO.
©0200 000000
16
Resultados
4. Descripcién morfolégica de la valva de Diplodon chilensis mediante
Microscopia Electrénica de Barrido (SEM)
Como se aprecia en fig 6 y fig 7 la valva de Dipiodon chilensis, al igual que en la
mayoria de los bivalvos, se encuentra constituida por el ostraco (O) y el periostraco
(P), (fig. 6a). En el ostraco se puede describir la presencia de dos zonas cristalinas,
una zona prismatica (ZPO) y una zona laminar 0 nacarada (ZNO). La primera
colinda con el periostraco y la segunda con la zona prismatica (fig. 6a). Al observar
con mayor aumento se puede apreciar tanto la microestructura laminar de la zona
nacarada, distribuida en forma de “mil hoja” (fig. 6b), como la_microestructura en
‘empalizada de la zona prismatica (fig. 6c). Al observar dorsalmente la zona ZPO se
aprecia una superficie irregular con grupos de crecimiento cristalinos en forma de
terraza distribuidos homogéneamente con un diémetro menor de 2,5um y un
diémetro mayor de 10 um (fig. 7c). Por otro lado, en el periostraco se pueden
desoribir dos tipos, un periostraco extemo (Pe) que se encuentra en contacto con el
medio liquido y un periostraco intemo (Pi) que esté en contacto con la fase
inorganica (fig. 7a). En Pi se pueden apreciar pozos regulares distribuidos
homogéneamente formados por capas organicas organizadas en forma de terraza,
con un diémetro menor de 5um y un didmetro mayor de 10 um (fig.7b). SOSHSHSSS HSH SSSHHSSHHHSHSHHHHSSHHOHHHOHHOOLOTOO8
Fig.6 Morfologia de la vista lateral de la valva de Diplodon chilensis mediante
microscopia electronica de barrido (SEM):
a)
»
9
Visién lateral de la valva mostrando el Periostraco (P); el Ostraco (0) y sus dos
zonas: Zona Prismatica del Ostraco (ZPO) y Zona Nacarada del Ostraco (ZNO)
Microestructura nacarada de aragonita de ZNO
Microestructura prismatica de ZPO
17 SCHOHOSHSSSHSH HOT HHRHSSSOSHHOHGSHOHHSHSHHCHHHHHHHHHOEEHOOD
Fi.7 Morfologia de ta vista dorsal de fa valva de Diplodon chilensis mediante
‘microscopia electrénica de barrido (SEM):
4) Periastraco externa (Pe), periostraco intemo (Pi) y zona prismatica det ostraco
(ZO),
') Pi mostrando pozos regulares con un didmetro mayor de 10m y un diametro
menor de Sym
©) ZPO apreciando un crecimiento en terraza de forma cénica truncada con un
‘igmetro menor de 2,Sum y un diémetro mayor de 10 ym
2. Caracterizacién morfolégica de las di
tas fracciones de la valva de
Dipiodon chilensis mediante Microscopia Electronica de Barrido (SEM)
La figura 8 muestra las fracciones (pdc, p deldp, fio do, fio do/dp) utiizadas como
substrato para los ensayos de cristalizacién’, en la que se puede observer, para el
caso del periostraco descalcificado (pde) estructuras hexagonales localizadas en su
superficie (fig. 8a) (las mismas encontradas en el periostraco sin descalcificar (fig.
7b) , mientras que en el caso de la fraccién insoluble del ostraco descalcificado
41+ Ver materiales seccién n® 2.2.1 y seccién n°4.4 SOO OOHHSHHSGHHHHHHHHHHHHHHHOHOHHHHHHHOHHHHESOOOO
19
(fio de) la superficie es practicamente lisa, sin hexégonos (fig. 8b). Luego al ser
ambos substratos desproteinizados, sus estructuras se mantuvieron inalteradas (fig
8c y 8d).
EI andlisis morfologico de estas fracciones permitiré estudiar de mejor manera los
efectos que ellos producen en la cristalizacién del carbonato de calcio in vitro.
Fig.8 Morfologia del periostraco y de la fraccién insoluble del ostraco (fio) por microscopia electrénica
de barrido (SEM):
8) Periostraco de Diplodon chilensis descalcificado con acido férmico al 10% (pdc)
b)_Fraceién insoluble del ostraco de Diplodon chilonsis descalcificado con acido férmico al 10% (io de)
©) Periastraco de Diplodon chilensis descaleiicado con acido férmico al 10% y desproteinizado con NaOH 1N
(pdeldp)
4) Fraccién insoluble del ostraco de Diplodon chilensis descalcificada con acido térmico al 10% y
desproteinizada con NaOH 1 (fio deldp) SCHHOSHOSHHSHODPDHHFHDHHHHHHHHHHHHHHOHHHHHHOHOHOCHHHHHDOO
20
3, Caracterizacién de la valva de Diplodon chilensis mediante espectroscopia
Raman
La fig.9 A, muestra el espectro Raman del ostraco de la valva de Diplodon chilensis,
‘en el que se caracterizan espectroscépicamente tanto la zona nacarada del ostraco
(ZNO) como la zona prismatica del ostraco (ZPO). En este espectro se puede
apreciar longitudes de ondas intensas cercanas a 1100 cm” y longitudes de onda
débiles alrededor de 700 cm’, las que determinan la presencia del ion carbonato
(Mikelsen et al, 1997). Al graficar las regiones de longitudes de onda
caracteristicas de los polimorfos de carbonato de calcio (fig.9B) se pueden
lentificar los 3 tipos de polimorfos cristalinos. Asi, en fa regién cercana a 1100 cm”
‘encontramos que tanto calcita como aragonita presentan un mismo pico intenso a
1086 cm”, mientras que vaterita presenta dos picos uno a 1078cm' y otro a 1095
em“(fig.9B1). Luego En la region de 700 cm", se encuentra un pico simple a
72cm" indicando la presencia de calcita, un pico doble a 701 y 705 cm’
mostrando la presencia de aragonita (fig.982), por ultimo en la regién cercana a
280 cm’ se encuentra un pico a 205 cm” mostrando Ia presencia de aragonita
(fig.9B3),
De esta manera, se pudo determinar la presencia de aragonita en la zona ZNO,
mientras que en la zona ZPO se determiné la presencia de vaterita, calcita y
aragonita (ver discusién, pag. 37). GOD: DOD ®2DDDDOHOHSOOOOHHOOOESOOO
BOBD
8: OOD:
0.0 0 0.0 @:
Intensidad (u.a)
21
8000
7000
6000
5000
4000 |
3 1
3000
2000 zNo
1000 ad
200 400 600 00 1000 1200
Numero de onda (cm™)
8
7086-8] ~
14000
__ 12000
B 10000
3 108
5 9000 -
6000
\
4000 t
vk
2000 gery
100010501100
Numero de onda (em")
Fig. 9 Espectro Raman de Ia vaiva de Diplodon chilensis:
|A) Espectro Raman de ta Zona Nacarada del Ostraco (ZNO) y de la Zona Prismatica de!
Ostraco (ZPO)
B) Regiones espectrales caracteristicas de los distintos polimorfos de carbonato de calcio:
4) ealeita {c) y aragonita (a): 1086 cm",
vaterita (v): 1078,6 cm’ y 1095,6 om";
2) ealeita (¢): 712 cm"; aragonita (a): 701 cm" y 705 cm"
205 em'*
3) aragonita ( SOO OHOSHSHHHHHHHHHHHHHHHDHDHGSHOHHHHHHHHH8HOH8988
22
4.Caracterizacién de las fracciones obtenidas de la matriz orgénica de las
valvas de Diplodion chilensis mediante FTIR y electroforesis SDS-PAGE
4.1. Caracterizacién del periostraco, ostraco y fraccién insoluble del ostraco
(fio) mediante FT-AR
La fig.10 muestra el espectro del periostraco (P) y del ostraco (0) (ambos sin
descalcificar). El espectro IR del periostraco no descalcificade mostré modos
vibracionales intemos del ion carbonato (CO): 1471 cm”,1082 em", 862 cm", 748
em’, 712 cm”,700 cm’ y una banda a 1786 cm" atribuida al grupo carbonilo (C=O)
del ion carbonato (CO%), ademas se encuentran dos bandas a 1655 cm" y 1236
cm’ asociadas a la matriz orgénica (MO) del periostraco. Mientras que el espectro
IR del Ostraco no desalcificado presenté los siguientes modos vibracionales
asociados al ion carbonato: 1471 cm, 1082 om, 860 cm, 712 cm’, 700 cm" y
una banda a 1788 cm’ atribuida al grupo carbonilo del ion carbonato, no
detectando modos vibracionales correspondientes a la matriz organica del Ostraco.
Por otro lado, es sabido que los modos vibracinales de 748,712 y 700 cm' se
relacionan con vaterita, calcita y aragonita, respectivamente (Mikelsen et al, 1997;
Cardenas et al, 2004). Es por ello que en este trabajo la espectroscopia de
infrarrojo fue fundamental a la hora de distinguir la presencia selectiva de estos
polimorfos en el periostraco y en el ostraco. La fig. 108 muestra la presencia de los
tres polimorfos en el periostraco, mientras que el espectro infrarrojo del ostraco
{fig.10b) muestra solo la presencia de calcita y aragonita distinguiendo las bandas
de absorcion a 712 y 700 cm". SOHHOHOHHHSHSHHHHHHHSHHOHHHHHHHHHSHHHOHHHHHHOHEHH8EO
23
120
100
80
60
Transmitancia (%6)
40
20
4000 9500 3000 2500 2000 1500 | 1000 © S00
Numero de ondas (cm')
Fig.t0 Espectro Infrarrojo (FT-IR) de la valva de Diplodon chitensis:
4) Periostraco no descalcificado (p)
) Ostraco no descalciicado (0)
Por otro lado, al descalcificar el periostraco (p do) (fig.11), se mantienen los modos
vibracionales relacionados con la matriz organic; 3296 em, 1655 em, 1635 cm,
1240 cm’, desapareciendo los modos vibracionales asociados al ion carbonato. De
estos estados vibracionales sélo las sefiales a 3296 cm” y 1655 cm" se asocian
con interacciones N-H | OH y amida | de B-quitina (Mikelsen et al,1997;
Cérdenas et al, 2004), encambio las bandas a 1535 cm y 1240 cm*
corresponden a las interacciones de amidas il y Ill de proteinas (Cérdenas et al,
2004). Para determinar la presencia de proteinas en la matriz organica del © OO OS OOF HOHFBHHHHHOHHHHHHHHHHHHHHOOHHHHHHHHOOH8OO
24
periostraco, este fue desproteinizado (p do/dp) y caracterizado por FT-IR (fig.11b).
El espectro IR del p deldp mostré una reduccién en {a intensidad de las bandas
relacionadas con las interacciones de amidas II y Ill de proteinas, ademas de la
disminucién de intensidad en la zona de interacciones N-H y una alteracién en el
banda de la amida | de la f-quitina, indicandonos que la desproteinizacién fue
parcialmente efectiva.
100
80
60
40
Transmitancia (%)
20
4000 9500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Numero de onda (cm*)
Fig.1t Espectro Infrarrojo ( FT-IR) de ta regién periostracal de la valva
de Diplodon chitensis:
1) Perostraco no descalcficado (6),
») Periostraco descaleificado / desproteinizado (p daldp)
©) Periostraco descaleiticado (p do)
Luego, al descalcificar el Ostraco se obtienen dos fases, una fraccién insoluble det
ostraco llamada fio de (fig.12a) y una fraccién soluble del ostraco llamada fso de (ig
14). En la fraccién insoluble del ostraco, se encontraron ausencia de modos
vibracionales asociados al ion carbonato, y se observaron los siguientes picos SOCHOHHSHSHSHSHHHDHSHHHHHHHHHHHSOHHOHHHHOHHHOHHOHSOO
25
relacionados con la matriz organica; Las bandas a 3286cm'1 y 1651cm‘t fueron
asociados a interacciones N-H / O-H y amida | de B-quitina respectivamente,
mientras que las bandas a 1625em*.y 1236cm™ fueron relacionados con
interacciones de amidas Il y Ill de proteinas, finalmente las sefiales a 1169¢m",
1107cm"*,1072cm" y 966cm" se encontraron asociadas a interacciones C-O de
polisacdridos (Camacho et al, 2001; Natanello et al, 2008; Potter et al, 2001).
Luego de esto se procedié a desproteinizar la fraccién insoluble del ostraco
obteniéndose una fase insoluble descalcificada y desproteinizada de esta (fio
deldp), la cual fue analizada por FT-IR (fig.12b). El espectro FT-IR de esta fase
mostré una ausencia de tres modos vibracionales (1169em"',1072cm"", 966em", ver
recuadro inscrito en fig.12), una reduccion y alteracién en las bandas relacionadas
con las interacciones de amidas Il y Ill de proteinas y una disminucién de intensidad
fen la zona de interacciones N-H, lo que nos permite concluir que la
despioteinizacién se produjo.
‘Transmitancia (%)
3600 3000 2600 2000 | 1800 1000 | S00
Numero de onda (cm")
Fig.12 Espectro Infrarrojo (FTR) de la regién del ostraco de la vaiva
de Diptodon chitensis:
4) Fraccién insolubles del ostraco descaleticada (fio dc);
+) Fracclén insolubles del ostraco descalcficada y desproteinizada
(Wo delsp), 0000S HSHHOHHHHHHHOHOHHOHHHHHHHHHHOHHHOHHHHHHHH8SO
‘Transmitancia (%)
26
La fig.13 muestra tanto el espectro infrarrojo del periostraco descalcificado y
desproteinizado (p de y p de/dp) como ta fraccién insoluble del ostraco desalcificado
y desproteinizado (fio de y fio de/dp). Se, observé que tanto la fraccién insoluble de!
ostraco desalcificado (fio de) como del periostraco descalcificado (pdc) poseen las
mismas bandas de &-quitina y de proteinas en su composicién quimica. Luego, al
ser desproteinizados fio de y pdc se encontré una disminucién en la intensidad de
las bandas relacionadas con proteinas, indicando que estas se encuentran
fuertemente unidas al substrato de B-quitina, por lo que su desproteinizacion no fue
‘completa (Potter et al, 2001). Ademds, en la fraccién insoluble del ostraco (fio de)
se observaron tres bandas asociadas a interacciones C-O de polisacdridos
(1169em", 1107em",1072cm"' y 966cm"), Jas que al ser desproteinizadas fueron
eliminadas del espectro, con lo cual se puede inferir la presencia de polisacaridos
unidos a proteinas (Percot et al, 2003).
5
100
20
60
40
20
3600 3000 2500 | 2000 | 1600 ©1000 © 00,
Numero de onda (cm)
Fig. 18 Espectro Infrarrojo (FT-IR) de las fracciones descalcificadas y desproteinizadas
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