INFORME DE PRCTICA 7

ESTUDIO DE LOS PARMETROS CROMATOGRFICOS A SER APLICADOS

EN MUESTRAS AMBIENTALES

Mara Yesenia Contreras Acua. Cdigo: 1.122.142.938

Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Bsicas,

Tecnologa e Ingeniera ECBTI. Escuela de Ciencias Agrcolas,
Pecuarias y del Medio Ambiente - ECAPMA. Qumica Ambiental
(Evaluacin y Control de la Contaminacin). Grupo # 2 CEAD ACACIAS.
Acacas - Colombia.

Sesin 1: 07, octubre de 2017

Entrega informe: 29, octubre de 2017
OBJETIVOS:

General

Estudiar los parmetros cromatogrficos que aplican para el anlisis de

muestras ambientales.

Especficos

Manejar el simulador de HPLC para el estudio de compuestos orgnicos

presentes en muestras ambientales
Identificar las caractersticas necesarias para el uso del simulador de
HPLC.
Identificar cromatogrficamente los compuestos orgnicos presentes en
muestras ambientales.

MARCO TERICO

La determinacin de los parmetros cromatogrficos es indispensable para una

correcta separacin de analitos por medio de cromatografa lquida de alta
eficiencia, CLAE (HPLC, por sus siglas en ingls High Performance Liquida
Chomatography). La optimizacin de los parmetros cromatogrficos, como la
composicin de la fase mvil, las caractersticas de la fase estacionaria
(columna) y la naturaleza qumica de los compuestos, permite separaciones
eficientes en trminos de tiempo, costos y calidad analtica. Si bien, esta
optimizacin puede llevarse a cabo por medio de diseos experimentales o a
travs del ensayos de error. En equipos CLAE, esto implica altas inversiones de
tiempo por parte del analista y costos en el empleo de disolventes, por lo que el
uso de simuladores constituye una alternativa estratgica en la optimizacin.
Este es justamente el trabajo que nos convoca: simular por medio de un
software libre la optimizacin de algunos parmetros cromatogrficos, como una
interesante introduccin al mundo de las separaciones cromatogrficas ms
usadas en los campos de la investigacin y la industria.

En muestras ambientales este mtodo es altamente utilizado para el estudio de

residuos de plaguicidas en matrices de agua y suelo, por otro lado para las
pruebas de aire se suele utilizar cromatografa de gases.

INTRODUCCIN

En el desarrollo de la prctica se identifican parmetros cromatogrficos en

cromatografa liquida de alta eficiencia y otros conceptos (incluidas las
estructuras de los solutos). Los compuestos estudiados en el HPLC son
Acetofenona, Butilparabeno, Ketoprofeno, Benzofenona, Propiofenona, 3-
nitrofeno, Etilparabeno, Propilparabeno y 4-nitrofenol, durante el desarrollo de
hicieron varias medicaciones al HPLC simulador, es decir, sus propiedades
generales, propiedades cromatogrficas y de la columna donde se observaron
diferentes resultados. Para este caso, se utiliz como solvente A (agua), y para
solvente B (Metanol y Acetonitrilo respectivamente).

PARTE I

Reconocimiento de los parmetros cromatogrficos en cromatografa

lquida de alta eficiencia (CLAE)

Defina y explique cmo se relacionan los siguientes conceptos. Incluya cuando

corresponda, el smbolo y ecuacin que representa al concepto

Factor de Separacin: Es un parmetro definitorio de la selectividad

cromatografa, referido a la separacin entre s de dos analitos, Se define
como la reaccin entre los tiempos de retencin ajustados, o entre los
factores de capacidad o retencin respectivos, es una columna para
separar dos picos. La columna puede ser selectiva a una separacin, que
se identifica por un valor alto de este factor, El factor selectivo a de una
columna para dos especies A y B se define como :

= , =

Calculo:

( )
=
( )

Donde es el coeficiente de distribucin para la especie ms

fuertemente retenida B, y es el coeficiente de distribucin para la
menos retenida, o que fluye con ms rapidez, la especie A.

Resolucin: Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se

puede obtener es un sistema cromatogrfico para dos componentes
dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatogrfico
para dos componentes, se define como:

=

( + )

Donde es la resolucin, y son los tiempos de retencin de los

componentes A y B, y aA y bB son las anchuras de los picos del
cromatograma de los anteriores componentes.

Los parmetros que influyen en la resolucin de una separacin

cromatografa son: la eficiencia de la columna, la selectividad y el factor
de retencin:
1
= ( ) . ( ).( )
4 1+

Eficiencia: El nmero de platos tericos mide la capacidad de la columna

para separar los componentes, no la retencin de los mismos: la eficiencia
o el nmero de platos se puede observar directamente a partir del
cronograma, observando la agudeza de los picos.

= = ( )

Donde N es el nmero de platos tericos, L es la longitud de la columna,

SI H es la altura de cada plato, es el tiempo corregido de retencin
de un componente y ah es la anchura del pico cromatogrfico, y:

= ( )

Factor de retencin: Es un parmetro que describe la velocidad de

migracin de los solutos en la columna. Para una especie A, el factor de
capacidad se define como :

= =

Tiempo de retencin ( ): Tiempo transcurrido desde la introduccin de

la muestra hasta que el componente alcanza el detector.

Tiempo Muerto: Tiempo requerido para que una especie no retenida

alcance el detector, es el tiempo de migracin de la especie no retenida;
es el tiempo necesario para que , por trmino medio una molcula de la
fase mvil pase a travs de la columna.

Ancho de Banda ( Sigma total ): Corresponde al intervalo de longitudes

de onda comprendido entre los puntos en donde la transmitancia alcanza
la mitad de su mximo de transmisin o en intervalos de 6 longitudes de
onda que contiene el 75 % de la energa radiante que provienen del
monocromador. La anchura de banda se puede expresar en trminos de
la apertura o amplitud de las rendijas, S, y la dispersin lineal reciproca
del monocromador como : SBW= S.D-1

Cromatografa liquida en fase normal: La fase estacionaria presenta

puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen con
el soluto son especficas del grupo activo. Las fases estacionarias pueden
ser un slido adsorbente (slice-almina) o un soporte al que se unen
 qumicamente molculas orgnicas que presentan grupos funcionales de
alta polaridad.

Cromatografa liquida en fase reversa: Tambin llamada fase inversa,

la fase estacionaria tiene una naturaleza apolar y las interacciones que
producen son inespecficas.

Gradiente de elucin: Los diferentes compuestos son eludidos

modificando gradualmente la composicin de la fase mvil durante la
cromatografa. El resultado sobre la elucin es un acortamiento de los
tiempos de retencin, el factor de retencin disminuya conforme aumenta
la variacin de flujo del gradiente y el compuesto fluye.

La relacin del cambio de la composicin de la fase mvil durante el

transcurso de la elucin en gradientes:

=

Dnde: = Volumen de fase del modificador

= El tiempo del gradiente

= La pendiente del frente o la relacion lineal de la fuerza del solvente

Elucin isocrtica: Los compuestos eluyen usando una fase mvil de

composicin constante durante toda la cromatografa. Todos los
compuestos acaban migrando a travs de la columna hasta el final. Sin
embargo cada uno migra con una velocidad diferente, resultando en una
relacin de elucin ms rpida o ms lenta.

La separacin de los compuestos mediante elucin isocratica puede

describirse utilizando las ecuaciones:

- Tiempo de retencin: = . +
- Factor de capacidad: = ( )/
1
- Resolucin: = [( ) . (( 1)/) 1/2 ] . [/(1 + )]
4

PARTE II

Efecto de la estructura de los compuestos (solutos) y de la

composicin de la fase mvil sobre la retencin y la resolucin.
1. Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las
convenciones de cua/slash representando los ngulos de enlace
adecuados:

Nombre del Estructura Propiedades

Compuesto Molecular
Densidad : 1030kg/m3;
1,03 g/cm3
Acetofenona Punto de fusin : 293,15k
(20C)
Punto de ebullicin:
475,15 K (202 C)
Apariencia: Solido Blanco
Densidad: 1110kg/m3;
Benzofenona 1,11g/cm3
Masa molar: 182.217
g/mol
Densidad: 1,25 g/cm3
Etilparabeno Masa molar: 166.17
g/mol

Masa molar : 194.227

Butilparabeno g/mol

Propiofenona
Apariencia liquida incoloro
a amarillo plido
Punto de fusin: 18C
Punto de ebullicin:
218C
Propilparabeno
Masa Molar: 180,2 g/mol
Densidad: 1,06 g/cm3

Ketoprofeno
Masa molar: 254,281
g/mol
Punto de fusin: 94-97C
3-nitrofenol
Peso molecular : 139,11 g
/ mol
 4-nitrofenol

2. Sobre la base de sus estructuras:

a) Prediga el orden de elucin de los compuestos, partiendo del menos al

ms retenido en RPLC (Cromatografa lquida en fase reversa).
Justifique su respuesta.

Etilparabeno< Propilparabeno<Butilparabeno< Ketoprofeno<Acetofenona

Propiofenona <Benzofenona

El orden de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad

de la fase mvil o eluyente. Este puede ser un disolvente nico o dos miscibles
de distinta polaridad.

b) Cules son los principales usos de cada uno de estos compuestos?

Acetofenona:

Es un compuesto orgnico de formula 6 5 ()3 es la cetona aromtica ms

simple, este lquido viscoso incoloro es un precursor en la preparacin de
numerosas resinas y fragancias.

Usos:

Precursor de Resinas: La resina de inters comercial son producidas

por la accin del formaldehido en una base sobre la acetofenona, los
polmeros resultantes son convencionalmente descritos por la formula
[(6 5 ())(2 )], Resultante de la condensacin aldolica y son
utilizados en la confeccin de tintas y recubrimientos.

Precursor del estireno: La conversin de acetofenona en estireno se

hace comnmente en los laboratorios acadmicos a travs de un proceso
de dos pasos, que ilustra la reduccin del carbonilo y deshidratacin de
los alcoholes:
 Uso farmacutico: Es materia prima para la sntesis de diversos
productos farmacuticos y tambin es un portador estn aprobados para
su uso por las autoridades sanitarias.

Benzofenona:

Es un compuesto importante en fotoqumica orgnica, perfumera y como

reactivo en sntesis orgnicas. Es una sustancia blanca cristalina insoluble
en agua y con olor a rosas. Su punto de fusin es de 49 C y su punto de
ebullicin de 305-306 C.

Acta como filtro para las radiaciones UV ya que es capaz de absorberla

y disiparla en forma de calor. Esto es posible debido a que posee sus
estados de singlete y triplete energticamente muy prximo entre s.

Debido a esta propiedad la benzofenona se utiliza en productos tales como

perfumes y jabones para evitar que la luz ultravioleta degrade el olor y el
color de estos perfumes.

Butilparabeno:
Es uno de los dos parabenos, de formula 4 9 (6 4 ()). Es un ster
butlico de cido para- hidroxibenzoico utilizando como preservativo anti
fngico en cosmticos.

Propiofenona:
Reactivos comunes, productos farmacuticos, perfumes y la industria de
sntesis orgnica.

Etilparabeno:
Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las
levaduras y los hongos. No obstante, no son muy efectivos contra las
bacterias, su actividad es independiente de la acidez, y adicionalmente,
son poco solubles, lo que limita sus aplicaciones en formas farmacuticas
liquidadas como jarabes, soluciones, suspensiones e inyecciones, son
usados en una gran variedad de alimentos y cosmticos.

Propilparabeno:
Usado como conservador de cosmticos y en combinacin con
metilparabeno se utiliza en formulaciones farmacuticas parentales. Para
productos de cuidado para la piel y comida, tiene una toxicidad
generalmente baja por ingestin. Puede irritar los ojos, la piel, el tracto
 intestinal y el respiratorio con el contacto, la ingestin y la inhalacin,
respectivamente tambin es combustible.

Ketoprofeno :
Es un antiinflamatorio no esteroide dotado de potente actividad
analgsica, muy eficaz en el tratamiento de enfermedades reumticas,
traumatolgicas y procesos inflamatorios en general. El principio activo
Ketoprofeno se utiliza en el tratamiento de la artritis reumatoide,
osteoartrosis, espondilitis, anquilosante y episodios agudos de gota.

3-nitrofenol:
Usado principalmente para manufactura de tinturas, pigmentos,
productos de caucho y sustancias funguicidas.

4-Nitrofenol: Es usado principalmente en la manufactura de

medicamentos, funguicidas, tinturas y para oscurecer el cuerpo. Es un
producto de la degradacin de plaguicidas como el paration y el
fluoridifen. Puede producir enfermedades de la sangre.

3. Ejecute el HPLC simulator (http://www.hplcsimulator.org/)

4. Configure el simulador segn las caractersticas descritas en la Tabla 19.

Tabla 19, primera configuracin del HPLC Simulator

Composicin Solvente A: Solvente Elucin: Fraccin de B

fase mvil agua B: Isocrtico (%v/v)=50
metanol
Propiedades
cromatografas T= 25C Inyeccin(L):10 Flujo (mL/min):20
Constante de Desplazamiento Ruido: Puntos
Propiedades tiempo: 0.1s de la seal 2.0 marcados:300
generales (min):0.0
Fase Longitud Dimetro Tamao
Propiedades estacionaria: (mm): Interno Partcula
de la agua 100.0 (mm): 4.6 (m): 3.0
columna

Tabla 20, resultados de la primera configuracin

Compuesto Tiempo de Factor de Ancho de banda

retencin (tR) retencin (k) (sigma total)
Acetofenona 0,1343 1,5254 0,2111
Butilparabeno 0,7494 13,0915 1,0414
Ketoprofeno 0,3564 5,7020 0,5031
Benzofenona 0,6690 11,5799 0,9308
Propiofenona 0,2434 3,5762 0,3513
3-nitrofenol 0,1349 1,5371 0,2119
Etilparabeno 0,2007 2,7739 0,2952
Propilparabeno 0,3832 6,2047 0,5394
4-nitrofenol 0,1262 1,3728 0,2013
Imagen Primera Configuracin

Acetofenona

Butilparabeno
Ketolprofeno

Benzofenona

Propiofenona
 3-nitrofenol

Etilparabeno

Propilparabeno
 4-nitrofenol

7. Se cambi la composicin de la fase mvil de metanol a Acetonitrilo como se

muestra en la Tabla 21.

Tabla 1 Segunda configuracin del HPLC Simulator

Composicin de Solvente Solvente B: Modo de Fraccin del

la fase mvil A: Agua Acetonitrilo elucin: solvente B
Isocrtico (%v/v): 50

Tabla 22, resultados de la segunda configuracin

Compuesto Tiempo de Factor de Ancho de banda

retencin (tR) retencin (k) (sigma total)
Acetofenona 0,0809 0,5208 0,1267
Butilparabeno 0,1611 2,0296 0,1838
Ketoprofeno 0,1114 1,0948 0,1463
Benzofenona 0,2493 3,6878 0,2586
Propiofenona 0,1247 1,3452 0,1558
3-nitrofenol 0,0763 0,4345 0,1241
Etilparabeno 0,0745 0,4012 0,1231
Propilparabeno 0,1037 0,9498 0,1411
4-nitrofenol 0,0732 0,3760 0,1223

Imagen Segunda Configuracin

Acetofenona

Butilparabeno
Ketoprofeno

Benzofenona
Propiofenona

3-nitrofenol

Etilparabeno
 Propilparabeno

4-nitrofenol

9. Explique por qu se da el cambio en los tiempos de retencin y en la

separacin de los compuestos cuando el metanol es sustituido por el Acetonitrilo.
En qu caso se obtiene una mejor separacin?

Cuando un soluto se disuelve en agua, las fuerzas de atraccin entre las

molculas de agua se distorsionan o se rompen. nicamente los solutos
altamente polares o inicos pueden interaccionar con la estructura del agua. Los
solutos no polares casi no interactan con estas estructuras y como
consecuencia abandonan la fase mvil para adsorberse al hidrocarburo de la
fase estacionaria. La fuerza motriz de la retencin no es la interaccin favorable
del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto de
repulsin del disolvente por el soluto.
Se observ una mejor separacin en el caso de Agua/Metanol

10. Cul es la importancia del agua en la composicin de la fase mvil?

El agua de alta polaridad adsorber fuertemente sobre la superficie,

evitando la adsorcin de los solutos, por lo que estos no se retendrn.

La alta presencia de agua da lugar a que compuestos cargados se

disuelvan perfectamente en ella y no sean repetidos hacia la fase
estacionaria, en estos casos es necesario anular la carga del soluto
mediante la presencia de un modificador incluido en la fase mvil.

Error! No se encuentra el origen de la referencia.12. Calcule y reporte la

diferencia en los cambios de energa libre (G) para la retencin de los solutos
en las fases mviles MeOH/Agua 50/50 y ACN/Agua 50/50, segn las siguientes
ecuaciones:

Ecuaciones a Utilizar:

= 1 2

1 = 1

1 = 2

Acetofenona:

.
1 0,082 298 ln(1.5254) = 10,31
.
.
2 0,082 298 ln(0,5208) = 15,94
.

= 10,31 15,94 = ,

Butilparabeno
 .
1 0,082 298 ln(13,0915) = 62,84
.
.
2 0,082 298 ln(2,0296) = 17,29
.

= 62,84 17,29 = .

Ketoprofeno

.
1 0,082 298 ln(5,7020) = 42,53
.
.
2 0,082 298 ln(1,0948) = 2,21
.

= 42,53 2,21 = ,

Benzofenona

.
1 0,082 298 ln(11,5799) = 59,85
.
.
2 0,082 298 ln(3,6878) = 31,88
.

= 59,85 31,88 = ,

Propiofenona

.
1 0,082 298 ln(3,5762) = 31,13
.
.
2 0,082 298 ln(1,3452) = 7,24
.

= 31,13 7,24 = ,

3-nitrofenol
 .
1 0,082 298 ln(1,5371) = 10,50
.
.
2 0,082 298 ln(0,4345) = 20,36
.

= 10,50 20,36 = ,

Etilparabeno

.
1 0,082 298 ln(2,7739) = 24,93
.
.
2 0,082 298 ln(0,4012) = 22,31
.

= 24,93 22,31 = ,

Propilparabeno

.
1 0,082 298 ln(6,2047) = 44,60
.
.
2 0,082 298 ln(0,9498) = 1,25
.

= 44,60 1,25 = ,

4-nitrofenol

.
1 0,082 298 ln(1,3728) = 7,74
.
.
2 0,082 298 ln(0,3760) = 23,90
.

= 7,74 23,90 = ,

Tabla 23 Resultados de energa al cambiar la fase

mvil
Compuesto Fase mvil G
MeOH/Agua ACN/Agua
(50/50) (50/50)
G1 G2
Acetofenona 10,31 15,94 26,25
Butilparabeno 62,84 17,29 45.55
Ketoprofeno 42,53 2,21 40,32
Benzofenona 59,85 31,88 28,04
Propiofenona 31,13 7,24 23,89
3-nitrofenol 10,50 20,36 30,86
Etilparabeno 24,93 22,31 47,24
Propilparabeno 44,60 1,25 45,85
4-nitrofenol 7,74 23,90 31,54

13. Cules solutos poseen las diferencias ms grandes y ms pequeas en la

energa libre asociada a la retencin, comparando las fases mviles MeOH/Agua
(50/50) y ACN/Agua (50/50)? Explique la naturaleza de esos cambios.

Energas ms Grandes Energas ms pequeas

Etilparabeno: -47,24 J/mol Propiofenona: -23,89 J/mol

Butilparabeno: -45.55 J/mol Acetofenona: -26,25 J/mol

La ausencia de un solvente polar que compita por las interacciones

electrostticas con alguno de los componentes, incrementa la energa de
interaccin entre los componentes del par.

PARTE III
Efecto del porcentaje del modificador en la composicin de la fase
mvil sobre la retencin y la resolucin.

1. En el listado de compuestos, elimine 7 solutos dejando solo a

Acetofenona y Etilparabeno.

Tabla 24 Tercera configuracin del HPLC Simulator

Composicin de Solvente A: Solvente B: Modo de Fraccin
la fase mvil Agua Metanol elucin: del
Isocrtico solvente B
(%v/v): 95
Propiedades Temperatura Volumen de Flujo (mL/min): 10
cromatogrficas (C): 25 inyeccin (L):
5.0
Propiedades Constante Desplazamiento Ruido: 2.0 Puntos
generales de tiempo de la seal marcados:
(s): 0.1 (min): 0.0 3000
Propiedades de Fase Longitud Dimetro Tamao de
la columna estacionaria: (mm): 100.0 interno partcula
Agua (mm): 4.6 (m): 3.0

Tabla 2 Resultados tercera configuracin del HPLC Simulator

Compuesto Tiempo de Factor de Ancho de banda
retencin (tR) retencin (sigma total)
(k)
Acetofenona 0,1119 0,0516 0,1261
Etilparabeno 0,1120 0,0526 0,1261

3. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10%

iniciando en 95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%,, 5%) y registre
en la Tabla 26 y para cada compuesto: el tiempo de retencin (tR), el
factor de retencin (k) y el ancho de banda (sigma total). Adjunte una
imagen del cromatograma obtenido
% Compuesto Tiempo de Factor de Ancho de banda
MeOH retencin (tR) retencin (sigma total)
(k)
95 Acetofenona 0,1119 0,0516 0,1261
Etilparabeno 0,1120 0,0526 0,1261
85 Acetofenona 0.1180 0,1096 0,1350
Etilparabeno 0,1199 0,1270 0,1360
75 Acetofenona 0,1311 0,2325 0,1494
Etilparabeno 0,1390 0,3066 0,1543
65 Acetofenona 0,1588 0,4935 0,1759
Etilparabeno 0,1851 0,7399 0,1959
55 Acetofenona 0,2177 1,0472 0,2310
Etilparabeno 0,2963 1,7856 0,3003
45 Acetofenona 0,3427 2,2222 0,3497
Etilparabeno 0,5647 4,3094 0,5610
35 Acetofenona 0,6079 4,7157 0,6001
Etilparabeno 1,2125 10,4002 1,1843
25 Acetofenona 1,1707 10,0070 1,1087
Etilparabeno 2,7760 25,0997 2,6201
15 Acetofenona 2,3650 21,2358 2,1085
Etilparabeno 6,5493 60,5755 5,8382
5 Acetofenona 4,8995 45,0642 4,0224
Etilparabeno 15,6557 146,1926 12,8494

Imagen del cromatograma obtenido

%MeOH: 95 %MeOH: 85
%MeOH: 75 %MeOH: 65

%MeOH: 55 %MeOH: 45

%MeOH: 35 %MeOH: 25
 %MeOH: 15 %MeOH: 5

Se repiti el mismo proceso cambiando el metanol por Acetonitrilo y registre

los resultados en la Tabla 27.

Tabla 3 Resultados quinta configuracin del HPLC Simulator

% Compuesto Tiempo de Factor de Ancho de banda

ACN retencin (tR) retencin (sigma total)
(k)
95 Acetofenona 0,1074 0,0098 0,1163
Etilparabeno 0,1066 0,0023 0,1161
85 Acetofenona 0,1089 0,0237 0,1186
Etilparabeno 0,1071 0,0072 0,1181
75 Acetofenona 0,1125 0,0573 0,1219
Etilparabeno 0,1088 0,0227 0,1206
65 Acetofenona 0,1211 0,1385 0,1275
Etilparabeno 0,1140 0,0717 0,1247
55 Acetofenona 0,1420 0,3349 0,1394
Etilparabeno 0,1304 0,2260 0,1340
45 Acetofenona 0,1925 0,8099 0,1696
Etilparabeno 0,1841 0,7125 0,1637
35 Acetofenona 0,3147 1,9584 0,2519
Etilparabeno 0,3453 2,2465 0,2727
25 Acetofenona 0,6100 4,7355 0,4703
Etilparabeno 0,8597 7,0832 0,6553
15 Acetofenona 1,3243 11,4509 1,0197
Etilparabeno 2,4818 22,3339 1,9043
5 Acetofenona 3,0514 27,6893 2,3613
Etilparabeno 7,5963 70,4198 5,8737
% ACN: 95 % ACN: 85

% ACN: 75 % ACN: 65

% ACN: 55 % ACN: 45
% ACN: 35 % ACN: 25

% ACN: 15 % ACN: 5
 BIBLIOGRAFIA

- Ruz, M. (2002). Simulacin de la contaminacin atmosfrica generada

por fuentes mviles en Bogot. Bogot, Colombia. Ediciones Universidad
Nacional de Colombia, pg. 34.