Introduccin

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la

mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de
recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener
cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar
anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de
los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es
preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.

La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las
estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de
purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos
celulares. La degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Un mtodo
clsico de purificacin de cidos nucleicos se basa en el uso de disolventes
orgnicos txicos, siendo la extraccin mediante fenol/cloroformo la ms conocida,
con ello se consigue el objetivo de desproteinizar la muestra. La fraccin proteica
puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio. La
precipitacin del ADN se logra por que el DNA es insoluble en alcohol, por lo que
se puede precipitar etanol fro y recuperar mediante una centrifugacin. La
confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en
un gel de agarosa y posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz
UV o directamente al espectrofotmetro mediante espectro de absorcin. El ADN
purificado se puede cuantificar con un espectrofluormetro mediante el uso de
fluorforos especficos. Para cuantificar el DNA se prepara una solucin del DNA
lisado, se realizan lecturas de absorbancia una a 260 nm especfica para DNA y
otra a 280 nm para determinar la pureza del acido nucleico.

La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o

fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para
separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la
agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA
sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores
a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As,
molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel
de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los
pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de
agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases
del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las
bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de
peso molecular.

Objetivos:

Realizar la extraccin y purificacin de ADN y ARN genmico a partir de

tejido fresco de diferentes clulas vegetales.
Realizar el corrimiento electrofertico en gel de agarosa de cidos nucleicos
extrados y purificados de las muestras de clulas vegetales.

Buffers y reactivos:

Buffer de extraccin Cloroformo Buffer TBE

NaCl 1,4 M Alcohol isoamlico (24:1) 1% v/v Tris 10 mM pH 8
Tris-HCl 100 mM pH 8 RNasa A (10mg/ml) 50% v/v EDTA 1 mM
EDTA 20 mM pH 8 Isopropanol
CTAB 2% p/v b- Etanol 70%
mercaptoetanol

Gel de agarosa: 1% p/v en buffer TBE 1%, 10 L de bromuro de etidio, 100 ml de

agarosa preparada, buffer de carga 6x

Procedimiento

Extraccin de ADN:

Se procede a moler 0,1 g de pasto con hidrgeno lquido en un mortero

para la obtencin de un polvo fino.
Se agregaron 700 L de buffer CTAB con 1% de b-mercaptoetanol
volviendo a moler.
Luego se incub la muestra en un bao termorregulador a 65C por 3
minutos.
 Se agregaron 700 L de Cloroformo y alcohol isoamlico en proporcin
(24:1) se mezcl por inmersin y se procedi a centrifugar po 10 minutos a
13.000 rpm a 4C.
Se transfiri la fase superior a un tubo (600 L aprox) y se volvieron a
agregar 700 L de Cloroformo y alcohol isoamlico en proporcin (24:1)
mezclando por inversin y centrifugando por 10 minutos.
Se volvi a transferir la fase superior a un tubo y se agregaron 450 L de
isopropanol fro, luego se mezcl por inversin y centrifug por 5 minutos.
Se elimin el sobrenadante, conservando el pellet de ADN.
El pellet se lav con 500 L de etanol 70% fro y se volvi a centrifugar.
El sobrenadante se removi cuidadosamente con micropipeta, luego se
agregaron 40 L de agua sin nucleasas.

Extraccin de ARN:

Se cort en pequeos trozos una muestra de tejido vegetal moliendo con

ayuda de un pistilo.

Se agreg 1 ml de Trisure fro homogeneizando en un vortex por 3 minutos,

luego se agregaron 200 L de cloroformo fro y se centrifug a 12.000 rpm por
15 minutos a 4C.

Se procedi a colectar la fase acuosa evitando de contaminar la fase

intermedia pasando la muestra a un tubo eppendorf nuevo.

Se agreg a la fase colectada 500 L de isopropanol fro y se mezcl por

inversin, luego se incub por 20 minutos a -20C y se centrifug a 12.000 rpm
por 10 minutos a 4C.

Se procedi a eliminar el sobrenadante y se agragaron 500 L de etanol 75%

fro sin mezclar para luego centrifugar la muestra a 7500 rpm por 5 minutos a
4C.

Luego se retira el etanol con pipeta invirtiendo el tubo, se dej secar a

temperatura ambiente por 3 minutos y luego se agreg a la muestra agua libre
de nucleasas.

Anlisis de muestras

Para un ntegro anlisis de las muestras recolectadas (ADN y ARN) se

cuantificaron por espectofotometra y luego se cargaron 2 L de la muestra de
ARN en un gel de agarosa al 2%