4.6 BASES MOLECULARES DE LA INGENIERA GENTICA.

Gentica.

La Gentica es la ciencia que estudia lo relacionado con la herencia, esto

incluye qu son los genes, cmo ellos llevan esa informacin, cmo se replican y
pasan a las generaciones posteriores y cmo la expresin de su informacin
dentro de un organismo determina sus caractersticas particulares.

Naturaleza del material gentico.

Los cromosomas son estructuras celulares que llevan la informacin

hereditaria; en estos cromosomas estn contenidos los genes.

Recordemos entonces que el ADN es una macromolcula constituida por

unidades repetitivas de nucletidos. Cada nucletido consta de una base
nitrogenada (adenina (A), timina (T), citosina (C), o guanina (G)), una pentosa
(desoxirribosa) y un grupo fosfato. El ADN es una molcula de doble cadena de
nucletidos, las dos cadenas se mantienen unidas mediantes puentes de
hidrgeno entre sus bases nitrogenadas. El apareamiento de las bases
nitrogenadas ocurre siempre en una forma especfica: la adenina siempre se
aparea con la timina y la citosina siempre se aparea con la guanina, debido a esto
la secuencia de las bases de una cadena determina la secuencia de otra, a esto
se le denomina complementariedad. Esta propiedad es importante porque permite
la replicacin de la molcula de ADN conservando fielmente la informacin. Para
que este apareamiento sea posible ambas cadenas estn orientadas en direccin
opuesta, una con respecto a otra, a eso se le dice que son antiparalelas.

De la misma manera la informacin contenida en el ADN puede ser copiada

por partes, en molculas especficas de ARN denominadas ARN mensajeros
(ARNm), este proceso se denomina transcripcin. La informacin codificada en
el ARNm es luego traducida en una secuencia especfica de aminocidos que
forman una protena. Este ltimo proceso se denomina traduccin.
 Imagen 4.6. 1 Cadena de ADN.

1. Replicacin.

En la replicacin del ADN, una molcula original del ADN de doble cadena
es convertida en dos molculas hijas de ADN idnticas. La clave para entender
esta replicacin del ADN es la estructura complementaria de las secuencias de los
pares de bases en las dos cadenas del ADN, una cadena sirve de molde para la
produccin de otra.

La replicacin requiere la presencia de protenas celulares complejas que

dirigen una secuencia particular de eventos. Cuando comienza la replicacin, las
dos cadenas se desenrollan y se separan una de otra en un pequeo segmento de
la molcula. Los nucletidos libres presentes en el citoplasma de la clula se unen
a las bases expuestas del fragmento de ADN de cada cadena simple expuesto de
la molcula original. Donde hay T en la cadena original se incorporar una A, y
donde hay una G se incorporar una C.
 Imagen 4.6. 2 Replicacin del ADN.

La replicacin del ADN comienza siempre en el mismo punto llamado punto

de iniciacin u origen. En este punto de iniciacin y zonas cercanas a l, se unen a
las cadenas de ADN molculas de protenas desenrolladas, las cuales hacen que
el ADN en esa zona se abra formando una especie de burbuja, en este momento
una ARN polimerasa ADN dependiente se une al punto de iniciacin mediante la
ayuda de una o ms protenas iniciadoras especficas, las cuales son las que
reconocen el punto de iniciacin. Aparentemente este punto de iniciacin est
anclado a la membrana celular y dicho anclaje parece ser necesario para ayudar a
compensar las fuerzas de torsin que se originan cuando el cromosoma se
desenrolla para ser copiado.

Imagen 4.6. 3 Punto de iniciacin de la replicacin.

 El desenrollamiento de la doble hlice y el de las dos cadenas se mantengan
separadas es posible por varias protenas especializadas. Enzimas conocidas
como helicasas desenrollan fragmentos cortos de ADN por delante de la horquilla
de replicacin. El desenrollamiento del ADN requiere energa que es aportada por
la hidrlisis de dos molculas de ATP. Tan pronto como una secuencia corta se ha
desenrollado, varias molculas de unas protenas que se unen al ADN de simple
cadena se unen fuertemente a cada una de las cadenas simples mantenindolas
separadas para que puedan actuar las enzimas de la replicacin.

En la siguiente tabla se resume el papel de las principales protenas que

participan en la replicacin del ADN sealando el sustrato y la funcin.

Protena Sustrato Funcin

Protenas que se unen ADN de cadena simple Mantiene separadas las
al ADN de cadena cadenas
simple

Topoisomerasas ADN de cadena doble, Superenrollamiento

(girasas) requiere ATP negativo del ADN

Helicasa ADN de cadena doble Desenrolla el ADN en la

horquilla de replicacin

Primasa (ARN ADN de cadena doble, Forma el ARN cebador

polimerasa ADN trifosfato-5-ribonucletidos (primer)
dependiente)

ADN polimerasa III

(1) Sintetasa ARN cebador en el extremo Forma las nuevas

3, trifosfato-5- cadenas
desoxirribonucletidos

(2) ADN exonucleasa Bases apareadas en forma Corrige errores

incorrecta

ADN polimerasa I

(1) ARN exonucleasa ARN cebador (53) Remueve el ARN

cebador

(2) ADN exonucleasa Bases apareadas en forma Corrige errores

incorrecta
(3) Sintetasa ADN de cadena simple Reemplaza el ARN
cebador con ADN

ADN ligasa Fragmentos de ADN de Une los extremos

cadena simple

Imagen 4.6. 4 Esquema de la replicacin.

2. Transcripcin.

La transcripcin ocurre cuando en la clula se requiere una determinada

protena, sta se forma a partir de la informacin contenida en el ADN. El ADN se
localiza exclusivamente en el ncleo de la clula; la informacin que codifica para
la sntesis de la protena, la enva hacia el citoplasma a travs del ARNm (cido
ribonucleico mensajero); por ello, el ADN primero sintetiza a ste en un proceso
que se llama transcripcin.

La transcripcin se inicia cuando la doble cadena de ADN se separa en un

punto determinado, para servir como plantilla para la formacin de los nucletidos
que van a formar el ARNm.

Los nucletidos libres del ARNm se empiezan a aparear con los nucletidos
del ADN que quedaron expuestos cuando la doble cadena se abri. De esta
manera, tomando como base los nucletidos de un tramo de una de las cadenas
del ADN, se forma el ARNm, el cual consta de una sola cadena, una vez formado,
el ARNm se separa del ADN y queda listo para viajar al citoplasma. Una vez que
el ADN se separ la cadena del ARNm, la doble cadena de ADN vuelve a unirse
en el mismo orden en que estaba.

Cuando la transcripcin del ARNm termina, las dos cadenas del ADN vuelven
a unirse.

Imagen 4.6. 5 Transcripcin del ADN: a) las dos cadenas que forman el ADN se separan en un punto determinado; b)
los nucletidos de ARN que andan libres se aparean con los nucletidos del ADN; c) queda formado el ARNm que viaja
al citoplasma para codificar los aminocidos.
 Como se puede observar, la molcula de ARNm es una sola cadena de
nucletidos, cuya secuencia de bases fue determinada por el ADN; en esta
secuencia va indicado el tipo de aminocido que se va a codificar, de acuerdo a
como lo determin el ADN. El ARN difiere del ADN porque:

En lugar de timina contiene uracilo.

En lugar de desoxirribosa contiene ribosa.
Se forma de una sola cadena de nucletidos.

La sntesis de una molcula de ARN complementaria a la cadena de ADN, se

denomina transcripcin.

3. Traduccin.

Ahora veremos de qu manera la informacin que ha sido transcrita en una

molcula de ARNm se traduce en una secuencia de aminocidos.

La traduccin inicia cuando el ARNm sale al citoplasma y establece contacto

con los ribosomas. El ARNm contiene codones para codificar los diferentes
aminocidos. En el citoplasma se encuentra otro tipo de ARN, conocido como
cido ribonucleico de transferencia (ARNt).

La funcin del ARNt es la de recoger del citoplasma los aminocidos libres y

llevarlos al ribosoma donde se encuentra el ARNm. Hay diferentes molculas de
ARNt porque cada una de ellas se combina con un solo tipo de aminocidos; hay
un ARNt para cada codn de ARNm.

El ARNt conduce un aminocido especfico en un extremo, y en el otro tiene

un grupo de tres bases, llamado anticodn, que habrn de ensamblarse con las
bases que forman el codn en el ARNm. El ARNm con sus codones se coloca en
el ribosoma, y cada codn va ensamblando con el anticodn del ARNt.
 Imagen 4.6. 6 Ensamble de aminocidos para formar protenas.

La secuencia nucletida que determin el ADN y que envi a travs de la

molcula de ARNm se complet con los anticodones del ARNt para finalmente dar
lugar a la protena anterior.

A medida que ensambla el anticodn del ARNt con el del ARNm, este ltimo
se separa del aminocido y se aleja. Los aminocidos, a su vez, se van uniendo
por enlaces peptdicos para formar las largas cadenas que constituyen la protena.
De esta manera se originan los miles de diferentes protenas que un organismo
necesita.
 Imagen 4.6. 7 El ARNm sale del ncleo y se une a los ribosomas. El ARNt lleva aminocidos y aparea sus anticodones
con los codones de ARNm. Los aminocidos se unen qumicamente en cadenas polipeptdicas que crecen hasta formar
una protena.

Generalidades sobre Ingeniera Gentica.

Existen complicadas definiciones legales de lo que es ingeniera gentica.

Tal vez una definicin sencilla y clara sea la que se entiende por ingeniera
gentica como la introduccin de una planificacin humana en la formacin de
nuevos genes y nuevas combinaciones de genes.

Supongamos que queremos clonar un gen de una clula donadora que

llamaremos clula A en una clula receptora que denominaremos clula B. Para
ello debemos extraer el ADN total de la clula A y transformar con l la clula B
seleccionando posteriormente aquellas clulas que hayan tomado el gen que
deseamos clonar. Esto sobre el papel es muy sencillo, pero en la prctica
tropezaramos con muchas dificultades. La principal de ellas radica en el hecho
que la simple introduccin del ADN exgeno tal cual de la clula receptora se
produce con una deficiencia muy baja, prcticamente no entra, y si lo hace es
degradado en su mayor parte. Para proteger el ADN exgeno de la degradacin
se hace preciso introducirlo en el interior de otra molcula de ADN denominada
vector. Este ADN recombinante gen-vector ya puede penetrar con facilidad,
conservndose de forma estable en el citoplasma de la clula receptora.
 Vamos a profundizar un poco ms en los vectores de clonacin. Son
plsmidos o virus en los que se inserta el gen que se desea clonar. Deben cumplir
las siguientes propiedades:

a) Ser capaces de penetrar la membrana citoplasmtica de la clula

receptora.
b) Ser estables en el citoplasma de la clula receptora por poseer un
origen de replicacin que les permita independizar su proliferacin de
la divisin nuclear.
c) Estar relacionado con el ADN de la clula receptora para no ser
degradado.
d) Contener algn gen que le confiera caractersticas fenotpicas que
permitan seleccionar fcilmente las clulas receptoras que lo posean.

Un caso tpico de vector es el plsmido pBR322 (Imagen 4.6.8). Construido

en el laboratorio de forma artificial, posee genes que confieren resistencia a
ampicilina y tetraciclina. Al transformar con l clulas receptoras podremos
distinguir claramente las que lo tomen de las que no lo hacen cultivndolas en
medio adicionado de ambos antibiticos. Slo las portadoras de pBR322 crecern
merced a su capacidad de inactivar los antibiticos.

Imagen 4.6. 8 Mapa fsico del plsmido pBR322, un clsico vector de clonacin.

Para poder insertar el gen a clonar en el vector se precisa de una serie de

enzimas implicadas en el metabolismo del ADN. De todos ellos los ms
importantes son sin lugar a dudas las endonucleasas de restriccin. Estas
enzimas reconocen secuencias palindrmicas de cuatro a seis pares de bases en
el ADN cortndolas generalmente en un extremo. Si disponemos de dos ADN de
diferente origen digeridos con la misma enzima podremos unirlas gracias a la
complementariedad de bases adenima-timina y guanina-citosina que sus extremos
presentan (Imagen 4.6.9). Esta unin se ver favorecida por la presencia de otra
enzima importante: la ADN ligasa, la cual cataliza la formacin de un enlace
fosfodister entre los extremos 3hidroxilo y 5fosfato adyacentes en el ADN.

Imagen 4.6. 9 Utilizacin de las enzimas de restriccin en la formacin de ADNs recombinantes. La digestin de dos
ADNs de diferentes orgenes con la enzima EcoRI genera en ambas molculas extremos cohesivos de secuencia
complementaria que pueden unirse por la actuacin de laADN ligasa.

Con todo ello se logran ADNs recombinantes gen-vector con los que se
transforman clulas receptoras. Estas pueden ser de cualquier tipo: bacterias,
levaduras, hongos, clulas vegetales o clulas animales. Hay que destacar que el
emplear un tipo u otro depende del experimento. Si bien la inmensa mayora de
los mismos se disea para el trabajo con bacterias por la facilidad de su
manipulacin.

Estrategias para la clonacin de genes.

Cada experimento de ingeniera gentica precisa de una estrategia de

clonacin propia, por lo que es muy difcil establecer generalidades. Ahora bien, se
puede hablar de sistemas clsicos para la clonacin de genes. En concreto hay
tres de ellos de los cuales dos toman como material de partida para obtencin del
gen ADN mientras que el otro toma ARN.

La primera estrategia (Imagen 4.6.10) consiste en digerir tanto el ADN de la

clula donadora como el vector con una enzima de restriccin que produzca un
nico punto de corte en este ltimo. Ambas preparaciones se ponen en contacto
en presencia del ADN ligasa, con lo que tal y como antes veamos se forman los
ADNs recombinantes. Con el conjunto de los mismos se transforma una clula
receptora obtenindose un nmero de clones de los cuales identificaremos aquel
que porte el gen que se desea clonar.

Imagen 4.6. 10 Mtodo directo para clonacin de genes. Se asla en ADN total de una clula y se digiere con una
enzima de restriccin. Por otra parte un plsmido vector se digiere con el mismo enzima. Ambas poblaciones
moleculares se ponen en contacto en presencia de ADN ligasa logrndose una coleccin de ADNs recombinantes de
los que se habr que aislar el que porte el gen deseado.

La segunda estrategia parte de un ADN donador cuyos extremos son romos.

Esto puede deberse a la actuacin de determinadas enzimas de restriccin o al
hecho de que el ADN se haya fragmentado por procedimientos mecnicos. Se
puede resolver el problema por diversas vas. La primera de ellas consiste en
intentar ligar gen y vector mediante ADN ligasa, a pesar de que los extremos no
sean complementarios. Para ello se precisan altas concentraciones de gen, vector
y ADN ligasa pudiendo deducirse que se trata de un procedimiento caro. Otra
solucin se basa en la adicin de una cola del polinucletidos al vector y otra cola
del polinucletido complementario al gen a clonar (Imagen 4.6.11).
 Imagen 4.6. 11 Mtodo de la terminal transferasa para la clonacin de genes incluidos en insertos de ADN de
extremos romos. Gen y vector se tratan con la terminal transferasa pero a uno se le da como fuente de nucletidos
adenina y al otro timina. Se logran as colas complementarias que en presencia de ADN ligasa se unen.

Ello se logra por la actuacin de la enzima terminal transferasa. De esta

forma ambos ADNs presentan extremos complementarios y en presencia de ADN
ligasa formarn ADNs recombinantes. Una ltima alternativa para el problema de
los extremos romos toma como base el empleo de prendedores. Estos son
secuencias de nucletidos sintetizadas qumicamente y que son diana para un
enzima de restriccin. Se unen a gen y vector, se digieren con la enzima para el
cual son diana y de esta forma se disponen de ADNs complementarios en sus
extremos (Imagen 4 .6.12).
Imagen 4.6. 12 Empleo de prendedores para la clonacin de genes en extremos romos de ADN. Altas concentraciones
del gen y del prendedor se ponen en presencia de ADN ligasa. Se seleccionan los fragmentos que hayan tomado
prendedores en ambos extremos y se digieren con la enzima Eco RI con lo que ya se dispone de un fragmento de ADN
de extremos complementarios.

La tercera y ltima estrategia toma como material de partida el ARN

mensajero del gen a clonar. Es til sobre todo a la hora de trabajar con genes de
organismos eucariotas, pues permite obviar el problema de los intrones. Para
llevar a cabo esta tcnica es preciso acudir a buscar el ARN mensajero a su
fuente biolgica natural apropiada, es decir, s por ejemplo deseamos clonar el
gen de la insulina buscaremos su ARNm con el pncreas. El aislamiento del
ARNm se lleva a cabo por cromatografa de oligo deoxitimidina celulosa con lo
cual los ARNs mensajeros quedan retenidos al poseer una cola de poliadenina. A
continuacin se aade a la suspensin de ARNs el enzima transcriptasa inversa el
cual es capaz de sintetizar ADN tomando como molde ARN (Imagen 4.6.13). Se
formar as un hbrido ARN-ADN. Mediante hidrlisis alcalina se elimina del mismo
la hebra de ARN y con la ayuda de una ADN polimerasa se sintetiza un ADN
complementario de la hebra de ADN preexistente. El nico problema es la
existencia de un codo de ADN de cadena sencilla que se digiere por la actuacin
del enzima nucleasa SI. Con ello se logran ADNs de extremos romos
correspondientes al gen del cual habamos aislado sus mensajeros. La insercin
de un vector se puede llevar a cabo por procedimientos similares a los citados
anteriormente.

Imagen 4.6. 13 Mtodo de la transcriptasa inversa. Se aslan ARNs mensajeros y se someten a la accin de la
transcriptasa inversa. Del hbrido ADN-ARN formado se separa el ARN por hidrlisis alcalina. Se sintetiza una hebra
complementaria a la ADN por la accin de una polimerasa y finalmente se elimina el codo por la nucleasa SI.
Seleccin de los clones transformados.

La seleccin del clon que porte el gen que se desea clonar vara segn el
tipo de experiencia. Si el gen clonado es una resistencia a alguna droga bastar
con plaquear en medio adicionado de la misma.

Si se trata de algn enzima implicado en una va metablica se buscan

cepas receptoras mutantes de dicho gen con el objeto de poder complementar la
mutacin. Por ejemplo si deseamos clonar el gen para la orotidina-5-fosfato
descarboxilasa, un enzima implicado en la va de sntesis de las uridina,
buscaremos una cepa receptora mutante de este gen. Esta cepa no podr crecer
en un medio mnimo sin uridina. Slo aquellos clones que hayan tomado y
expresado el gen de la orotidina-5-fosfato descarboxilasa podrn crecer y dar
colonias.

Finalmente si el gen clonado corresponde a una protena habr que acudir a

realizar una bsqueda del clon productor de la misma mediante la utilizacin de
anticuerpos marcados radioactivamente contra dicha protena.

Por ejemplo, la aplicacin de las tcnicas de clonacin molecular en

medicina ofrece interesantes posibilidades tanto desde el punto de vista del
diagnstico de enfermedades como desde el de la produccin de metabolitos
secundarios con inters farmacolgico.
 http://www.uv.es/enolab/La%20ingenier%ED%20gen%E9tica.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_
Tema_7_Gen%C3%A9tica.pdf

http://blog.educastur.es/entrelineas/files/2010/05/ingenieria-genetica-lucia-
obeso-almeida.pdf