GRADO EN FARMACIA Curso

2017-2018

PRCTICAS - NUTRACEUTICOS

ndice
PRCTICA Pgina
I. ANTIOXIDANTES - Fenlicos: 1
1.a. Contenido en fenoles totales 3
1.b. Contenido en polifenoles de naturaleza flavonoide: determinacin de flavonoides totales 4
1.c. Contenido en polifenoles de naturaleza No flavonoide: determinacin de resveratrol 6
II. COLAGENO: 7

I. ANTIOXIDANTES-FENLICOS

INTRODUCCIN

Actualmente, los complementos alimenticios con "propiedades antioxidantes" constituyen un mercado en alza. A sus
ingredientes activos (principalmente, vitaminas E y C, carotenoides y polifenoles) se les atribuyen efectos fisiolgicos
beneficiosos que disminuyen el riesgo de padecer enfermedades crnicas, aunque an no se han establecido
exactamente ni las cantidades a ingerir ni las combinaciones de antioxidantes ms efectivas.

Posibles beneficios que se atribuyen a los polifenoles: Se les ha atribuido diversas propiedades beneficiosas:
Tratamiento de problemas cardiovasculares, efecto anticoagulante, insuficiencia venosa, antiinflamatorio, antioxidante,
prevencin del cncer (prstata y mama).

La mayora de estudios atribuyen, al consumo de polifenoles, ms concretamente a los flavonoides, un efecto

beneficioso sobre las enfermedades cardiovasculares, aunque otros demuestran una ausencia de efecto incluso

1
 Relacin del consumo de polifenoles y su efecto sobre las enfermedades cardiovasculares (Badimon et al. 2010).
Los compuestos fenlicos en funcin de su estructura qumica se clasifican en dos categoras: flavonoides y no

flavonoides

2
1.a. DETERMINACIN DEL CONTENIDO EN FENOLES TOTALES EN COMPLEMENTOS ALIMENTICIOS

FUNDAMENTO
Los compuestos fenlicos reducen el cido fosfotungstico y fosfomolibdico (reactivo de Folin Ciocalteau) de color
amarillo a xidos de tungsteno y molibdeno de color azul, con un mximo de absorbancia a una longitud de onda 765
nm. La coloracin azul producida es proporcional a la concentracin de compuestos fenlicos presentes.
Se preparar una curva de calibrado con cido glico, las lecturas del extracto se extrapolan en esta curva a fin de
calcular la concentracin de fenoles totales.

Objetivo
Calcular el contenido de fenoles totales de un complemento alimentario

Reactivos
Disolucin de carbonato sdico al 2 % (p/v)
Reactivo de Folin Ciocalteau 1N (el producto comercial viene a una concentracin 2 N,
Acetona
Disolucin patrn de cido glico 100 g/mL en agua con un 10 % acetona
Disolucin patrn de cido glico 10 g/mL. Preparar por dilucin 1/10 a partir de la disolucin de 100 g/mL
(preparada)

Procedimiento
! Preparacin del extracto de muestra

Nota: El extracto sirve para la prctica de fenoles totales y de flavonoides

o Cpsulas:
Abrir la cpsula
Pesar el contenido de la cpsula
Pesar, con exactitud, una alcuota de aproximadamente 25 mg del contenido de la cpsula, introducir en un matraz
aforado de 100 ml, disolver con 10 ml de acetona y ajustar el volumen a 100 ml con agua (filtrar si fuera necesario).

3
! Recta de calibrado:

La recta de calibrado se prepara a partir de la disolucin de trabajo del cido glico (10 g/mL), segn la siguiente
tabla:
! Reaccin muestra y patrones
volumen (mL) H 2O Na2CO3 2% Reactivo de Folin
patrn ac.glico 10 g/mL CioCalteau

Blanco 0 5 1 0.25
Patrn I 1 4 1 0.25
Patrn II 2 3 1 0.25
Patrn III 3 2 1 0.25
Patrn IV 5 0 1 0.25
volumen (mL) H 2O Na2CO3 2% Reactivo de Folin
extracto de muestra CioCalteau
Extracto Problema 0.5 4.5 1 0.25

Medir la absorbancia de la recta de calibrado y de la muestra en un espectrofotmetro a 765 nm frente al

blanco (con el blanco calibrar a cero el espectrofotmetro).

CALCULOS:
Obtener la recta de calibrado o ecuacin lineal
y = bx + a
y= absorbancia / x= cantidad o concentracin de cido glico en el ensayo / m= pendiente de la recta n= ordenada en el
origen.
Recta de calibrado
y = bx + a
Pendiente b
Ordenada en el origen a
Coeficiente de correlacin r

Interpolar el valor de absorbancia de la muestra en la ecuacin lineal para obtener la cantidad (g) o concentracin
(g/mL) de cido glico en el ensayo.
Calcular el contenido en fenoles totales expresado en mg de cido glico por comprimido o cpsula

1.b DETERMINACIN DE FLAVONOIDES TOTALES EN COMPLEMENTOS ALIMENTICIOS (Mtodo del AlCl3)

FUNDAMENTO

El AlCl3 anhidro forma quelatos con flavonoides orto-dihidroxilados, 3-hidroxilados y 5-hidroxilados en medio bsico.
Estos quelatos presentan una coloracin rosada que absorbe a 510 nm.

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Objetivo
Calcular el contenido de flavonoides totales de un complemento alimentario
Reactivos
Disolucin patrn de catequina 50 g/mL en acetona al 10 % (v/v)
Disolucin de AlCl3 al 10% (p/v): Se pesaron 10 g de AlCl36H2O y se disuelven con H2O desionizada hasta un volumen
final de 100 mL.

Disolucin de NaNO2 al 5% (p/v): Se pesaron 5 g de NaNO2 y se diluyen en H2O hasta un volumen final de 100 mL. De
preparacin reciente

Disolucin de NaOH 1.0 M: 40 g de NaOH por litro de agua.

MTODO ANALTICO

! La concentracin de flavonoides totales fue establecida mediante una curva de calibracin de rutina, aplicando el
mismo proceso de preparacin a las muestras que en la determinacin de fenoles totales (Aprovechar el extracto
preparado para la determinacin de fenoles totales)
o Cpsulas:
Abrir la cpsula
Pesar el contenido de la cpsula
Pesar, con exactitud, una alcuota de aproximadamente 25 mg del contenido de la cpsula, disolver en 10 ml de
acetona, filtrar si fuera necesario, y ajustar el volumen a 100 ml.

La recta de calibrado se prepara a partir de la disolucin patrn de catequina de 50 g/mL segn la siguiente tabla:
! Reaccin muestra y patrones
Blanco Patrn I Patrn II Patrn III Patrn IV Extracto
Problema
Patrn catequina 50 g/mL 0 2 4 5 10 0

EXTRACTO PROBLEMA 0 0 0 0 0 5
H2 O 10 8 6 5 0 5
NaNO2 al 5%
1 1 1 1 1 1

Reposo cerrado a Temperatura ambiente por 5 minutos.

AlCl3 al 10% 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Reposo cerrado a Temperatura ambiente por 5 minutos.
NaOH 1 M 5 5 5 5 5 5
H2O c.s.p 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0
La absorbancia de la reaccin fue medida a una longitud de onda de 510 nm
Calcular la ecuacin de la recta. Interpolar el resultado obtenido para el problema

5
Calcular la cantidad de total de flavonoides expresados en mg de catequina por cpsula
Recta de calibrado
y = bx + a
Pendiente b
Ordenada en el origen a
Coeficiente de correlacin R

1.c DETERMINACIN DE POLIFENOLES NO FLAVONOIDES, RESVERATROL, EN COMPLEMENTOS

ALIMENTICIOS
Objetivo
El objetivo principal es determinar la concentracin de resveratrol en un Complementos alimenticio
Fundamento
Para determinar la concentracin de resveratrol se realiza un anlisis cromatogrfico de muestras comerciales
Reactivos
- Patrn de resveratrol de 5 g/mL en Fase mvil
- Fase mvil: mezcla de metanol:acetonitrilo:cido-fosfrico al 0.1% en agua (40:10:50 v/v/v)
- Condiciones cromatogrficas: flujo de 0,8 mL/min; Fase estacionaria: Columna C18, 5m 125 x 4,6 mm; Deteccin
UV a 302 m nm.

MTODO ANALTICO

El resveratrol es un compuesto de polaridad media que puede extraerse desde diversas matrices con disolventes
orgnicos miscibles con el agua. Su identificacin y cuantificacin se realiza por cromatografa

Muestra: complemento alimentario comercial, registrado.

Preparacin del extracto de muestra:

Pesar la cpsula entera

Abrir la cpsula
Pesar el contenido de la cpsula
Pesar, con exactitud, una alcuota de aproximadamente 25 mg del contenido de la cpsula, disolver en fase mvi y
ajustar el volumen a 50 mL.
Preparar una dilucin 1/25 del extracto en la fase mvil. (1 mL de extracto en 25 mL de fase). Filtrar e inyectar la
muestra en el cromatgrafo

Preparacin de la recta de calibrado: Se preparan 4 tubos y se aade a cada uno de ellos los siguientes volmenes
de resveratrol y se ajusta hasta 2 mL con metanol.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Patrn de resveratrol de 5 g/mL (mL) 0.5 1 1.5 2
Metanol c.s.p 2 mL (mL) 1.5 1 0.5 0
Fase Mvil 2 2 2 2
Agitar los tubos e inyectar en el HPLC-UV
Concentracin de resveratrol
rea del pico

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Determinar la ecuacin de la recta
Recta de calibrado
y = bx + a
Pendiente b
Ordenada en el origen a
Coeficiente de correlacin r
RECTA

Interpolar el resultado obtenido para el extracto de muestra

Calcular la cantidad de resveratrol (mg) por cpsula

II. DETERMINACIN DE COLGENO. EN COMPLEMENTOS ALIMENTICIOS

El colgeno es la protena ms abundante de origen animal, que constituye aproximadamente el 25 - 30% de todas las
protenas de los organismos animales, se encuentra en los tejidos conectivos, especialmente en tejidos asociados a la
piel, huesos y en el tejido intersticial. La principal funcin que se le atribuye es la de mantener la estructura, mejorar la
fuerza, resistencia y flexibilidad de los tejidos. Se caracteriza por tener una estructura interna de triple hlice, que le
proporciona alta resistencia y propiedades de retencin de humedad.

El colgeno comercial, principalmente, s de origen porcino y bovino, pero la comunidad cientfica busca nuevas fuentes
de extraccin de la protena debido al rechazo generado por las enfermedades bovinas que pueden pasar a los
humanos y tambin por creencias de carcter religioso. Una fuente que actualmente se estudia es la piel de pescado.

Posibles beneficios que se atribuyen al colgeno

Colgeno: Contribuye a la salud de la piel, articulaciones y tejido conectivo
Reduce los signos de envejecimiento al mantener la elasticidad de la piel
Mejora las uas y los folculos del cabello
Preserva, forma y repone la masa muscular magra
Mejora la movilidad en condiciones como la artritis y los dolores articulares
Objetivo

El objetivo principal es determinar la cantidad de colgeno en un complemento alimenticio, mediante la

cuantificacin de Hidroxiprolina.

FUNDAMENTO
Previa hidrlisis en medio cido de los enlaces peptdicos del colgeno y oxidacin de la
hidroxiprolina, el producto formado reacciona con el p-dimetilaminobenzaldeido y los
compuestos de condensacin obtenidos se cuantifican espectrofotomtricamente ( = 560
nm).

REACTIVOS

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 - Disolucin HCl 50% (v/v), a partir de HCl conc.
- Disolucin de NaOH de 400 g / L
- Disolucin madre de hidroxiprolina de 100 g/mL
- Disolucin de trabajo de hidroxiprolina de 10 g/mL (preparar)
- Isopropanol
- Disolucin A: Disolucin Cloramina T 10,5 % (p/v)
- Disolucin oxidante: Disolucin A / Disolucin B (1:4) [(preparar): En un tubo de ensayo mezclar 2 mL de la
disolucin A con 8 mL de la disolucin B)]
- Disolucin B: Disolucin tampn de pH 6: Disolver 34 g de acetato sdico anhidro, 36.5 g de citrato trisdico
monohidratado, 5,5 g de cido ctrico en 385 mL de alcohol isoproplico y enrasar a 1000 mL con agua
destilada)
- Ac. perclrico 17'5 %
- Disolucin del p-dimetilaminobenzaldeido (pDMAB) al 5% en alcohol isopropilico. Se conserva 1 semana a
temperatura ambiente

MTODO ANALTICO
Muestra: complemento alimenticio comercial.

Preparacin del extracto de muestra:

Abrir la cpsula

Pesar el contenido de la cpsula

Pesar, con exactitud, una alcuota de aproximadamente 20 mg del contenido de la cpsula, e introducirla en un tubo de
digestin, adicionar 25 mL de cido HCl al 50%. Poner en la boca del tubo un embudo para que acte como refrigerante
a reflujo. Calentar de forma que se mantenga una ebullicin suave durante 7 horas (95C). Dejar enfriar. Trasvasar el
contenido del tubo a un vaso de precipitados de 250 mL.

Ajustar el hidrolizado a un pH comprendido entre 6 y 7, aadir 14 mL de una disolucin concentrada de NaOH

(400 g/L), enfriar y llevar al pH anteriormente indicado con disoluciones de bsicas de NaOH o si lo requiere, con
disoluciones de HCl. Dejar en friar y comprobar el pH, volver a ajustarlo si fuera necesario.

Verter el extracto neutralizado en un matraz aforado de 100 ml y enrasar..

- Preparacin de la curva de calibrado: La densidad ptica obtenida sigue la ley de Beer-Lambert cuando la
concentracin de hidroxiprolina se encuentra comprendida entre 0 y 20 g/mL.
Preparar la disolucin de trabajo de hidroxiprolina de 10 g/mL a partir de una de 100 g/mL, preparar
diluciones que contengan 7.5, 5 y 2.5 g/mL con agua destilada.

Rotular una batera de tubos para preparar los puntos que formaran parte de la recta de calibrado y en el tubo
correspondiente transferir 1 mL cada una de estas disoluciones patrn, en un tubo a parte preparar un blanco con un 1
mL de agua destilada y otro tubo problema depositar 1 ml del extracto de la muestra. Aadir a todos los tubos 2 mL de
isopropanol puro y 1 mL de la disolucin oxidante (*recin preparada) y agitar. Dejar reposar 10 minutos, transcurrido
dicho tiempo, aadir a cada tubo 3 mL de la disolucin de c. perclrico al 17,5 % y 2 mL de pDMAB, homogeneizar el
contenido y llevarlos a bao mara regulado a 60 C. Al cabo de 20 minutos, retirarlos y enfriarlos. Ajustar a 10 mL con
isopropanol y agitar. Leer la densidad ptica ajustando a cero con el blanco a 560 nm (utilizar cubetas de vidrio, el
isopropanol en contacto con plstico (PS) o metacrilato (PMMA), provoca la perdida de transparencia de las caras de la
cubeta)

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Esquema

Preparacin de disoluciones que contienen 2.5, 5, 7.5 y 10 g/mL

! Reaccin muestra y patrones

volumen Isopropanol Disolucin Perclrico pDMABl
(mL) (mL) Oxidante* 17,5 % 5% 1 Agitar

1 agitar
2 60 c (20)
Blanco (agua) 1 2 1 3 2
.
Patrn I (2.5 g/mL) 1 2 1 2 reposo 3 2
3 Enfriar
Patrn II (5g/mL) 1 2 1 10 3 2
Patrn III (7.5 g/mL) 1 2 1 3 2 4 Ajustar a 10 ml con

Patrn IV (10 g/mL) 1 2 1 3 2 isopropanol

Extracto Problema 1 2 1 3 2
5 leer Absorbancia en
cubeta vidrio a 560 nm

Determinar la ecuacin de la recta. Interpolar el resultado obtenido para el extracto de muestra

Calcular la cantidad de total de hidroxiprolina

Recta de calibrado
y = bx + a
Pendiente b
Ordenada en el origen a
Coeficiente de correlacin r

Calcular a que cantidad de colgeno corresponde, sabiendo que el peso de colgeno equivale a 8 veces el peso de
hidroxiprolina
Colgeno = 8 x hidroxiprolina

Suponiendo, que del polvo incluido en la cpsula, se elaborara un comprimido, calcular el contenido en colgeno por
comprimido.

Nota: la cubierta de la cpsula est elaborada a base de gelatina (la gelatina contiene hidroxiprolina)