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CITMICA EN INVESTIGACIN Y
DESARROLLO DE MEDICAMENTOS
Jos Enrique OConnor1, Alberto M. Alvarez2, Robert C. Callaghan3,

Guadalupe Herrera1, Alicia Martnez1, Pilar Prieto4
1 Centro
de Citometra y Citmica, Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular,
Universidad de Valencia; 2 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares,
Madrid; 3 Departamento de Patologa, Universidad de Valencia; 4 ECVAM, EC
Joint Research Center, Ispra, Italia
II Reunin de la Red Espaola de Mtodos Alternativos Centro de Citometra y Citmica
GENOMICA, PROTEOMICA, CITOMICA
Centro de Citometra y Citmica

La citmica, o citometra de sistemas complejos, es una disciplina
que se orienta a la investigacin molecular en clulas individuales
y que permite acceder a mltiples caractersticas bioqumicas de
los sistemas celulares heterogneos
Genmica Estructural
Protemica Citmica
Genmica Funcional
Los citomas estn compuestos por varios tipos de clulas
individuales, que forman las unidades de rganos, sistemas y
organismos.

El anlisis citmico determina el fenotipo molecular en cada clula
individual, resultante del genotipo y la exposicin a factores externos.
Genmica Estructural
Protemica Citmica
Genmica Funcional
La citmica aborda el problema de la interpretacin de datos
homogneos, en los que los efectos pueden ser atribudos a cambios
uniformes en todas las clulas en lugar de en subpoblaciones
determinadas.

El progreso de la Citmica ha sido posible por la evolucin de las
tecnologas de anlisis celular individual, fundamentalmente la citometra
de flujo y la microscopa confocal y de barrido laser


CITOMETRIA EN INVESTIGACIN FARMACO-TOXICOLOGICA
El
El anlisis
anlisis citmico
citmico se
se integra
integra en
en las
las estrategias
estrategias esenciales
esenciales en
en elel
anlisis
anlisis de
de lala interaccin
interaccin xenobitico-clula
xenobitico-clula en
en investigacin
investigacin bsica,
bsica,
elel desarrollo
desarrollo industrial
industrial yy lala evaluacin
evaluacin de
de efectos
efectos teraputicos
teraputicos yy
txicos
txicosde
deproductos
productosqumicos
qumicosyybiolgicos.
biolgicos.

CITOMETRIA EN INVESTIGACIN FARMACO-TOXICOLOGICA:
APLICACIONES GENERALES
- Identificacin y seleccin de subpoblaciones celulares especficas
- Identificacin de clulas diana/susceptibles a xenobiticos
- Anlisis multiplexado de analitos solubles
- Screeening de alto rendimiento y de alto contenido
- Caracterizacin de mecanismos de accin de frmacos/xenobiticos
- Deteccin y cuantificacin de toxicidad
CITOMETRIA EN INVESTIGACIN FARMACO-TOXICOLOGICA
La citometra de flujo puede ser aplicada en todas las etapas de la

interaccin entre un frmaco/xenobitico y sus clulas diana,
especficas o inespecficas.

CITOMETRIA EN INVESTIGACIN FARMACO-TOXICOLOGICA:
ESTUDIO DE LA INTERACCION FARMACO/CELULA
- Deteccin y cuantificacin de receptores de superficie
- Deteccin y cuantificacin de receptores intracelulares
- Deteccin de respuestas mediadas por receptores de frmacos
- Anlisis del transporte y difusin de solutos a travs de membrana
- Anlisis del metabolismo intracelular de xenobiticos
- Anlisis de los efectos intracelulares de frmacos y xenobiticos
- Deteccin y cuantificacin de alteracin metablica y muerte celular
DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE RECEPTORES DE SUPERFICIE
-Identificacin de subpoblaciones celulares especficas:
- Tipo salvaje
-Transfectantes y Knock-outs
- Identificacin de dianas potenciales para la accin de frmacos que
actan a travs de receptores
- Seleccin de poblaciones modelo para:
- Interaccin frmaco-receptor
- Unin e internalizacin de ligandos

DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE RECEPTORES INTRACELULARES
- De relevancia prctica, sobre todo, en el estudio de los receptores
nucleares de esteroides
- Identificacin de subpoblaciones celulares tumorales dependientes
de hormona
- Monitorizacin teraputica en distintos tipos de tumores
DETECCIN DE RESPUESTAS MEDIADAS POR RECEPTORES
- Permite el anlisis funcional de receptores:
- Deteccin de respuestas rpidas de movilizacin de Ca2+
- Modificaciones funcionales intracelulares
- Fenmenos proliferativos inducidos por la activacin de
receptores

DETECCIN DE RESPUESTAS MEDIADAS POR RECEPTORES
La mayora de dianas moleculares de frmacos son:

- Receptores de 7 dominios transmembrana acoplados a protenas G (~ 5000)
- Receptores nucleares (~>150)
- Canales inicos (~ 1000)
- Enzimas (indeterminado)
Si se consideran los 100 frmacos top :
- 18 se unen a GPCR
- 10 se unen a receptores nucleares
- 16 se unen a canales inicos
- La mayor parte de los restantes inhiben enzimas
TRANSDUCCIN DE SEALES POR RECEPTORES DE TIPO GPCR

TRANSDUCCIN DE SEALES POR RECEPTORES DE TIPO GPCR
?
HTS mediante FLIPR
Medida cintica de Ca2+ intracelular
Robotizado
1024 wells/seg
Miles de anlisis por da
ANALISIS CITOMETRICO DE RECEPTORES

RELACIONADOS CON LA INFLAMACIN

FILOGENIA DE GPCR IMPLICADOS EN INFLAMACIN
RECEPTORES
DE QUIMIOATRAYENTES
BLT2
BLT1 RECEPTORES DE
LISOFOSFOLIPIDOS
RECEPTORES
DE QUIMIOQUINAS RECEPTORES DE
EN LEUCOCITOS PROSTANOIDES
RECEPTORES CysLT1
DE ADP Y TROMBINA CysLT2
EN PLAQUETAS
RECEPTORES
DE NUCLEOTIDOS
ANALISIS CITOMETRICO DE ACTIVACION DE

PLAQUETAS EN SANGRE ENTERA

EXPRESIN DE LOS RECEPTORES DE LEUCOTRIENOS EN
CLULAS INFLAMATORIAS
CD19
LN5
Linfocito B
Basfilo Macrfago
M-CSF, GM-CSF, IL-3 CD14
LTC4, LTD4, LTE4 Monocito

CD34+
IL-5 IL5R LTs
Clula madre LTC4
IL-3
pluripotente GM-CSF
LTD4
BLT
LTE4
CD8+ Neutrfilo
LTs
CD4+ Eosinfilo
Linfocito T
CysLT
SANGRE ENTERA ESTIMULADA CON LTB4 5 nM
SANGRE ENTERA ESTIMULADA CON LTE4 0.9M

PARAMETROS CINETICO DE LA RESPUESTA A LTB4
EN PMN DE SANGRE ENTERA
10
1/Vmax
VELOCIDAD (UAF/S
0
-2 -1 0 1 2 3
0 5 10 15 20 25 30 35
(LTB4)nM 1/[LTB4]
TRANSPORTE Y DIFUSIN DE SOLUTOS A TRAVS DE MEMBRANA
- Caracterizacin de frmacos de bajo peso molecular o de proteinas

bioactivas que no actan a travs de receptores especficos y son
transportadas o internalizadas a travs de la membrana plasmtica.
- Estudio de los fenmenos de extrusin o difusin pasiva de solutos:
- Caracterizacin funcional de bombas de expulsin de frmacos
- Fenotipo MDR en la terapia antitumoral o antiinfecciosa

ANLISIS DEL METABOLISMO INTRACELULAR DE XENOBITICOS
Biotransformacin de xenobiticos:
- Actividad de isoformas de CYP450
- Formacin de aductos con el glutation
Dibencilfluoresceina
ANLISIS DE LOS EFECTOS CELULARES DE XENOBITICOS
La citometra de flujo multiparamtrica es, probablemente, la
disciplina analtica potencialmente ms poderosa para el estudio de
los efectos biolgicos inducidos por frmacos y xenobiticos en
clulas diana o, en general, en poblaciones celulares susceptibles

La sensibilidad y resolucin temporal de la citometra, y el elevado
nmero de parmetros, proporcionan una visin integradora de la
funcin celular (anlisis de alto contenido).
Liberacin de Expresin de CD69 Sntesis de IL-2 Expresin de IL-6R Proliferacin

Ca2+ (segundos) (minutos-horas) (horas-dias) (dias) (dias)
Apoptosis Centro de Citometra y Citmica

(horas-dias)
ANALISIS MULTIPLEXADO: MULTIPLES ANALITOS EN UN SOLO TUBO
IL-
IL-2
IL-
IL-4
IL-
IL-5
IL-
IL-10
TNF-
TNF-
IFN-
IFN-

LA CITOMETRIA COMO METODO ALTERNATIVO EN
TOXICOLOGIA IN VITRO
An
Anevaluation
evaluationof
ofthe
thereproducibility
reproducibilityand
andtransferability
transferabilityof
offlow
flow
cytometric and confocal microscopic endpoints in an in vitro
cytometric and confocal microscopic endpoints in an in vitro
nephrotoxicity
nephrotoxicityand
andin
invitro
vitrometabolism
metabolismmodels.
models.
An
AnEuropean
EuropeanContract
Contractsponsored
sponsoredby bythe
the
European
European Center for the Validation of AlternativeMethods
Center for the Validation of Alternative Methods(ECVAM),
(ECVAM ),
(ECVAM),
Institute
Institutefor
forHealth
Healthand
andConsumer
ConsumerProtection,
Protection,
Commission of the European Communities
Commission of the European Communities
(15348-
(15348-1999-
1999-10FIED ISP
(15348-1999-10FIED ISPES)
ES)

3 Rs: Replacement, Reduction and Refinement
REPLACEMENT
Tejidos especficos
REDUCTION
Amplios paneles de screening

REFINEMENT
Citometra de Flujo y Microscopa Confocal
Mltiples endpoints
Cuantitativas
No-invasivas
Similar fundamento biolgico
Informacin Complementaria :
Descripcin poblacional
Descripcin celular
Correlacin de parmetros
Descripcin topolgica
Ensayos Multiparamtricos

CULTIVOS DE CELULAS DE TUBULO RENAL
TUBULO RENAL PROXIMAL TUBULO RENAL DISTAL

OK MDCK
LLC-PK1
CITOMETRIA DE FLUJO MICROSCOPIA CONFOCAL
ANALISIS MULTIPARAMETRICO DE
MARCADORES DE NEFROTOXICIDAD:
NEFROTOXINAS ESTANDARD : CADMIO, CICLOSPORINA A, CIS-PLATINO
CONTROLES POSITIVOS APROPIADOS
CULTIVOS DE CELULAS V79
FALSAS TRANSFECTADAS TRANSFECTADAS ESTABLES

CON EL GEN CYP 2D6
CITOMETRIA DE FLUJO MICROSCOPIA CONFOCAL
ANALISIS MULTIPARAMETRICO DE
MARCADORES DE CITOTOXICIDAD DEPENDIENTE DE 2D6:
SUSTRATOS DE CYP 2D6 : IMIPRAMINA, MIANSERINA
CONTROLES POSITIVOS APROPIADOS

REGULACION IONICA METABOLISMO
CONTENIDO EN CALCIO POTENCIALES DE MEMBRANA
CONTENIDO EN SODIO FUNCION MITOCONDRIAL
pH INTRACELULAR CONTENIDO EN LIPIDOS
ACTIVIVIDAD DEL NHE BIOTRANSFORMACION
ANALISIS
ANALISISMULTIPARAMETRICO
MULTIPARAMETRICO MUERTE CELULAR
PROLIFERACION
DE
DEMARCADORES
MARCADORES NECROSIS
CICLO CELULAR DE
DECITOTOXICIDAD
CITOTOXICIDAD APOPTOSIS
ESTRS OXIDATIVO
PROOXIDANTES
OXIDO NITRICO
GLUTATION Centro de Citometra y Citmica
REGULACION IONICA METABOLISMO
Fluo-3, Fura Red DiBac
Sodium Green Rhodamine 123, JC-1
BCECF, SNARF Nile Red
Cyp-Mix
ANALISIS
ANALISISMULTIPARAMETRICO
MULTIPARAMETRICO MUERTE CELULAR
PROLIFERACION
DE MARCADORES
DE MARCADORES Propidium iodide
Propidium iodide DE
DECITOTOXICIDAD
CITOTOXICIDAD Annexin V-FITC
ESTRS OXIDATIVO
DHDCF, HE, DHRH123
DAF-FM
Mercury Orange Centro de Citometra y Citmica
APLICABILIDAD DE LOS RESULTADOS
Hay una serie de marcadores de citotoxicidad:

- Dependientes de concentracin
- Dependientes de tiempo
Recomendados para un Primary Toxicity Cytometry Panel
Viabilidad: Necrosis/apoptosis con Annexina/PI
Potenciales de membrana : PMM (Rh123); PMP (DiBAC)
Homeostasis inica : Ca2+ con Fluo-3/Fura Red
Estrs oxidativo : Peroxidos (DCDHF); Superxido (HE)
Perfil de lpidos : Nile Red

APLICABILIDAD DE LOS RESULTADOS
- Modelos de Exposicin a Xenobiticos:

- Establecimiento inicial de la letalidad
- Exposicin a concentraciones sub-letales:
Toxicidad aguda: 5 horas
Toxicidad retrasada: 5 horas (pulso)+ 48 horas (caza)
Toxicidad sostenida: 48 horas
- Modelos celulares:
Lneas primarias/establecidas:
Neuronal/Glial
Hepatocitos/Hepatoma
Nefronas/ Tbulos Renales
Clulas Hematopoyticas
- Carcter no invasivo de la citometra de flujo

- Fcil accesibilidad a tipos celulares de relevancia:
- Leucocitos de sangre perifrica
- Espermatozoides
- Seres unicelulares en su propio entorno
- Monitorizacin fenotpica de los efectos de frmacos y
xenobiticos sobre el organismo entero:
- Biomarcadores de exposicin y de efecto.

ANLISIS DE ESTRS OXIDATIVO EN LEUCOCITOS
DE SANGRE ENTERA
WBC
RBC
Perxidos
Perxidos Superxido
Superxido
Superoxido
Superoxido
CD45-PC5
CD45-PC5
Perxidos
Perxidos
UTILIDAD DE MODELOS BACTERIANOS

GENOMICA Y CITOMICA CON CEPAS WP2 DE E. Coli
H2O2 NO O2.-
OxyR RpoS SoxR/SoxS
ahpCF katE hmp

nfo
gorA xthA
acnA
dps frp
katG sodA
ONOO-
sodB
zwf
GLUTATION fumC
TIOLES DNA micF
ACTIVIDAD OXIDATIVA INTRACELULAR GLUTATION INTRACELULAR
Control CONTROL
H2O2 H2O2
CuNO3
CuNO3+H2O2
SUPEROXIDE SUPEROXIDE
14 100
ETHIDIUM FLUORESCENCE
90
12
ETHIDIUM FLUORESCENCE (FAU)
80
10 70
IC188
60
IC188+15M
(FAU)
8
IC188 50 IC188+30M
IC5232
6 40 IC188+45M
IC188+60M
30
4
20
2 10
0 0
0 10 20
0 75 100 150 200 400
g/assay mmols H2O2 /assay

ACTIVIDAD OXIDATIVA INTRACELULAR
H2O2+
H2O2
AcCu
ACTIVIDAD OXIDATIVA INTRACELULAR

OxyR
WILD TYPE
DETECCION DE NO Y ONOO- EN E. COLI

DADOR DE NO DE VIDA MEDIA LARGA DADOR DE NO DE VIDA MEDIA CORTA
0 min 0 min
5 min 5 min
10 min 10 min
20 min 20 min
NO
O2.-

DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE MUERTE CELULAR
La resolucin temporal de la citometra, junto con el elevado nmero
de parmetros permite:
- Deteccin y cuantificacin de la apoptosis
- Estudio de los mecanismos moleculares implicados en:
- Induccin
- Ejecucin
- Inhibicin
- Distincin de la necrosis.
ANALISIS CITOMETRICO DE LA APOPTOSIS

AUTOMATIZACION Y HTS EN CITOMETRIA DE FLUJO
SISTEMAS DE RUTINA AUTOMATIZADOS:

Preparacin automatizada de muestras: Prep-Plus/CellPrep
Sistemas pre-alineados: EPICS XL; Cytomics FC500
Cargador de carrusel 32 tubos: EPICS XL; Cytomics FC500
Muestreador de placas multiwell: Cytomics FC500
Generacin automtica de hojas XL e informes
AUTO-ESTANDARDIZACION:
Calibracin: FlowCheck/FlowSet/CytoComp
Algoritmos de auto-ajuste: System II software/Expo 32 ADC
Inmunofenotipo multicolor automatizado: TetraOne/FlowCount
--Sistema
Sistemaen
enfase
fasede
dedesarrollo
desarrollo
--1.2 seg/muestra
1.2 seg/muestra
--Volumen
Volumendedemuestra:
muestra:hasta 10L
hasta10 L
--Muestreo automtico de microplacas
Muestreo automtico de microplacas
--Compatible
Compatiblecon
consoftware
softwareHTS
HTS

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Jos Enrique OConnor1, Alberto M. Alvarez2, Robert C. Callaghan3,

II Reunin de la Red Espaola de Mtodos Alternativos Centro de Citometra y Citmica

GENOMICA, PROTEOMICA, CITOMICA

Centro de Citometra y Citmica

Centro de Citometra y Citmica

Los citomas estn compuestos por varios tipos de clulas

individuales, que forman las unidades de rganos, sistemas y

Centro de Citometra y Citmica

individual, resultante del genotipo y la exposicin a factores externos.

Centro de Citometra y Citmica

La citmica aborda el problema de la interpretacin de datos

homogneos, en los que los efectos pueden ser atribudos a cambios

uniformes en todas las clulas en lugar de en subpoblaciones

Centro de Citometra y Citmica

tecnologas de anlisis celular individual, fundamentalmente la citometra

de flujo y la microscopa confocal y de barrido laser

Centro de Citometra y Citmica

Centro de Citometra y Citmica

Centro de Citometra y Citmica

CITOMETRIA EN INVESTIGACIN FARMACO-TOXICOLOGICA

Centro de Citometra y Citmica

- Identificacin y seleccin de subpoblaciones celulares especficas

- Identificacin de clulas diana/susceptibles a xenobiticos

- Anlisis multiplexado de analitos solubles

- Screeening de alto rendimiento y de alto contenido

- Caracterizacin de mecanismos de accin de frmacos/xenobiticos

- Deteccin y cuantificacin de toxicidad

Centro de Citometra y Citmica

CITOMETRIA EN INVESTIGACIN FARMACO-TOXICOLOGICA

La citometra de flujo puede ser aplicada en todas las etapas de la

Centro de Citometra y Citmica

- Deteccin y cuantificacin de receptores de superficie

- Deteccin y cuantificacin de receptores intracelulares

- Deteccin de respuestas mediadas por receptores de frmacos

- Anlisis del transporte y difusin de solutos a travs de membrana

- Anlisis del metabolismo intracelular de xenobiticos

- Anlisis de los efectos intracelulares de frmacos y xenobiticos

- Deteccin y cuantificacin de alteracin metablica y muerte celular

Centro de Citometra y Citmica

DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE RECEPTORES DE SUPERFICIE

-Identificacin de subpoblaciones celulares especficas:

- Identificacin de dianas potenciales para la accin de frmacos que

actan a travs de receptores

- Seleccin de poblaciones modelo para:

- Unin e internalizacin de ligandos

Centro de Citometra y Citmica

- De relevancia prctica, sobre todo, en el estudio de los receptores

- Identificacin de subpoblaciones celulares tumorales dependientes

- Monitorizacin teraputica en distintos tipos de tumores

Centro de Citometra y Citmica

DETECCIN DE RESPUESTAS MEDIADAS POR RECEPTORES

- Permite el anlisis funcional de receptores:

- Deteccin de respuestas rpidas de movilizacin de Ca2+

- Modificaciones funcionales intracelulares

- Fenmenos proliferativos inducidos por la activacin de

Centro de Citometra y Citmica

La mayora de dianas moleculares de frmacos son:

Centro de Citometra y Citmica

TRANSDUCCIN DE SEALES POR RECEPTORES DE TIPO GPCR

Centro de Citometra y Citmica

ANALISIS CITOMETRICO DE RECEPTORES

Centro de Citometra y Citmica