ESCOLA SUPERIOR AGRRIA

INSTITUTO POLITCNICO DE CASTELO BRANCO

Laboratrio de Biologia
Disciplina de BIOLOGIA CELULAR

Apontamentos de Microscopia
Disciplina de BIOLOGIA CELULAR

Carlos M. G. Reis

2003
Disciplina de Biologia Celular Microscopia

ndice

1. Introduo 2
2. Unidades de medida utilizadas em microscopia 2
3. Microscopia ptica 3
3.1 Partes constituintes do microscpio ptico 3
3.2 Ampliao 4
3.3 Poder de Resoluo 5
3.4 Utilizao da objectiva de imerso 7
3.5 Outros tipos de microscpios pticos 8
4. Microscopia electrnica 9
4.1 Microscpio electrnico de transmisso (TEM) 11
4.2. Microscpio electrnico de varrimento ou de explorao (scanning, 15
SEM)
5. Preparao de material biolgico para observao em microscopia 17
5.1. Fixao 17
5.2 Incluso 17
5.3 Corte ou microtomia 18
5.4 Colorao 19
5.5 Montagem 19
Bibliografia 20
Anexo: Utilizao do microscpio ptico

Agradecimento:
Agradecimento muito especial Eng. Maria Leopoldina V. Rosa, Prof. Adjunto da
ESACB, pela leitura e reviso deste documento.

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1. Introduo
O microscpio o instrumento bsico para o estudo da clula. A inveno do microscpio
atribuda a Antoine Leeuwenhoek e Robert Hooke no sc. XVII. J no sculo XIX,
Schleiden e Schwann, com base nas observaes microscpicas at a efectuadas, elaboram
a teoria segundo a qual todos os seres vivos so constitudos por clulas. Desde a as
tcnicas e metodologias para observar as clulas e a sua estrutura tm evoludo
continuamente. As tcnicas citoqumicas vieram possibilitar a identificao e localizao
de diversas molculas constituintes das clulas e o desenvolvimento dos microscpios
electrnicos possibilitou avanos extraordinrios acerca da sua ultra-estrutura.
Simultaneamente ao desenvolvimento do microscpio electrnico, foram desenvolvidas
outras tcnicas analticas que permitem isolar organelos celulares e efectuar o estudo in
vitro de suas molculas e funes.
Os microscpios pertencem a duas categorias, dependendo do princpio em que se baseia a
ampliao: luminoso ou ptico (utiliza radiao constituda por fotes) e electrnico
(utiliza um feixe de electres).

2. Unidades de medida utilizadas em microscopia

As dimenses das estruturas biolgicas podem agrupar-se em dois grandes grupos,
macroscpicas, isto , visveis ao olho humano, e microscpicas, isto , invisveis ao olho
humano, tendo como fronteira o poder de resoluo do olho humano.
As unidades de medida utilizadas em microscopia so o micrometro (m), para a
microscopia ptica, e o nanometro (m) e o angstrom (), para a microscopia electrnica.
A sua relao com a unidade fundamental do sistema mtrico, o metro (m) e com o
milmetro (mm) a seguinte:

1 m = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m

1 m = 10-3 m = 10-6 mm (0,000001 mm) = 10-9 m
1 = 10-1 m = 10-4 m = 10-7 mm (0,0000001 mm) = 10-10 m

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3. Microscopia ptica
Os microscpios pticos possuem lentes pticas, existindo vrios tipos, nomeadamente: (1)
microscopia luminosa, (2) de campo escuro, (3) de ultravioleta, (4) de fluorescncia e (5)
de contraste de fase.
Na microscopia ptica de campo luminoso, da qual se falar com maior detalhe, o campo
do microscpio aparece brilhantemente iluminado e os objectos estudados apresentam-se
mais escuros.

3.1. Partes constituintes do microscpio ptico

O microscpio ptico (fig. 1) constitudo por um sistema ptico e um sistema mecnico.
O sistema ptico compe-se de trs sistemas de lentes (ocular, objecticas e condensador) e
uma fonte de luz. O sistema mecnico constitudo pela estrutura que suporta os
elementos do sistema ptico, e inclui os elementos de focagem.

Lente ocular (A)

Tubo (B)

Brao ou coluna (B)

Revlver (B)

Platina (B)
Lente objectiva (A)
Parafuso micromtrico (B)
Lente do condensador e
comando do diafragma (A) Parafuso macromtrico (B)

Sistema de iluminao (A) Base ou p (B)

Fig. 1 Partes constituintes do microscpio ptico. A - elementos do sistema ptico; B elementos

do sistema mecnico.

A finalidade do condensador a de projectar um cone de luz uniforme sobre o objecto. Aps a

passagem pelo objecto, o feixe penetra na objectiva. A objectiva projecta uma imagem aumentada,
no plano focal da ocular, que novamente a amplia. O olho v uma imagem virtual, ampliada e
invertida do objecto (fig. 2).

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Fig. 2 Esquema da formao da imagem num microscpio ptico. AB

objecto adequadamente iluminado e colocado sobre a platina; AB
imagem real e invertida, formada ao nvel do foco da ocular; AB
imagem captada na retina do observador (na realidade forma-se uma
imagem virtual no infinito); F foco da objectiva; fobj distncia focal
da objectiva; foc distncia focal da ocular. (Adaptado de Mello & Vidal,
1980).

Em anexo (Anexo 1) encontra-se informao acerca da utilizao do microscpio luminoso

e cuidados a ter no seu manuseamento.

3.2. Ampliao
A ampliao total dada pela combinao de lentes do microscpio; igual ao produto das
ampliaes individuais das objectivas e da ocular. Assim, por exemplo, se a ampliao da
objectiva 100x e a amplio da ocular 10x, a ampliao total ser 1000x. Os valores das
ampliaes individuais so normalmente indicados nas lentes, pelo fabricante (fig. 3).

Ampliao da Abertura numrica

objectiva

Comprimento do tubo Espessura da lamela (mm)

(mm) a utilizar

Fig. 3 - Aspecto de algumas inscries existentes nas lentes objectivas.

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3.3. Poder de Resoluo

Uma das caractersticas mais importantes de um microscpio no a sua capacidade de
ampliao mas sim o poder de resoluo, isto a fineza de detalhe que o aparelho permite.
O aumento por si s no permite obter uma imagem perfeita, em consequncia, entre
outras razes, do fenmeno da difraco.
O poder de resoluo de um sistema ptico a capacidade do aparelho fornecer imagens
distintas de dois pontos adjacentes. O poder de resoluo depende do comprimento de onda
() da radiao utilizada e da abertura numrica (AN) da lente objectiva. O limite de
resoluo (LR) pode ser definido como a distncia mnima entre dois pontos de modo que
as respectivas imagens, fornecidas pelo sistema ptico, sejam distintas. Para o olho
humano, o limite de resoluo de, sensivelmente, 0,1 mm. Isto significa que a olho nu
apenas conseguimos distinguir objectos distanciados entre si at 0,1 mm. O limite de
resoluo inverso do poder resolvente, isto , quanto menor o limite de resoluo de uma
lente objectiva, maior o seu poder de resoluo. Para um microscpio, o limite de
resoluo dado pela seguinte frmula:

LR = K
AN
Em que K uma constante avaliada em 0,61, o comprimento de onda da radiao e AN
representa a abertura numrica, a qual dada por:

AN = n x sen
Nesta frmula, n o ndice de refraco1 do meio interposto entre a preparao e a lente
objectiva e sen o seno do semi-ngulo de abertura da objectiva (fig. 4).

Objectiva

Lmina Semi-ngulo do cone de luz que

entra na objectiva

Fonte luminosa

Fig. 4 Semi-ngulo de abertura da objectiva ().

1
ndice de refraco: razo entre a velocidade da luz no vazio e a velocidade da radiao no meio considerado

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O limite de resoluo directamente proporcional ao comprimento de onda da radiao

utilizada e inversamente proporcional abertura numrica da objectiva. O comprimento de
onda de luz utilizado nos microscpios de campo luminoso limitado. A luz visvel varia
entre 400 e 700 m (nanmetros); para efeitos de clculo utilizado o valor de 550 m
(0,55 m), comprimento de onda que corresponde radiao na banda do amarelo verde e
para a qual o olho humano apresenta maior sensibilidade.
Para diminuir o limite de resoluo necessrio utilizar luz de pequeno comprimento de
onda ou ento utilizar objectivas de maior abertura numrica. Em qualquer dos casos,
existem dificuldades intransponveis. No que se refere ao comprimento de onda, a radiao
ultra-violeta apresenta valores cerca de 300 m (0,3 m), o que permite melhorar quase
duas vezes o poder resolvente (para cerca de 0,1m). esta a ideia base que esteve no
desenvolvimento do microscpio de ultravioleta. Contudo existem dificuldades prticas
associadas utilizao deste tipo de radiao. Como o vidro no transmite o ultravioleta
necessrio utilizar lentes de quartzo. Outra limitao associada reside no facto de no ser
possvel fazer a observao directa das imagens, pelo que a imagem deve ser registada
fotograficamente. Como instrumento de alta resoluo o microscpio de ultravioleta
superado pelo microscpio electrnico, sendo utilizado sobretudo em citoqumica, j que
certos componentes celulares, como os cidos nucleicos, absorvem selectivamente luz
ultravioleta de comprimento de onda especfico.
Quanto abertura numrica, esta caracterstica de cada lente objectiva (fig. 3) e a
possibilidade de alterao das objectivas microscpicas, capaz de aumentar a abertura
numrica, limitada; o maior valor de A.N. conseguido para as objectivas a seco menor
que 1 (0,95), e as objectivas de imerso tm um valor de AN apenas ligeiramente superior
a 1 (1,2 a 1,4) (tabela 1).
O valor mnimo de L.R. para um microscpio ptico, considerando uma grande abertura
numrica (1,4), com o mximo de correco de aberraes e iluminao correcta, de
cerca de 0,2 m. No caso dos microscpios do laboratrio de Biologia, utilizando uma
objectiva de imerso com um valor de AN de 1,25, o melhor que se consegue,
teoricamente, um limite de resoluo de 0,27 m.

0,55
LR = 0,61 = 0,27 m
1,25

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Tabela 1 - Abertura numrica das objectivas e limite de resoluo conseguido com os microscpios
utilizados nas aulas prticas de Biologia Celular.

Objectiva de
Caractersticas Lentes objectivas a seco imerso

Ampliao da objectiva 4x 10x 40x 100x

Ampliao total2 40x 100x 400x 1000x
Abertura numrica 0,10 0,25 0,65 1,25
Limite de resoluo (m) 3,36 1,34 0,52 0,27
Distncia entre objectiva e o 29,0 6,30 0,53 0,29
espcimen (mm)

3.4. Utilizao da objectiva de imerso

Esta objectiva usada com o leo de imerso interposto entre a lmina de vidro e a
objectiva. a objectiva que exige maiores cuidados na sua utilizao, pois foca muito
prximo do material a observar.
Como foi referido, o limite de resoluo inversamente proporcional abertura numrica
da objectiva, sendo este valor calculado por AN = n x sen . Como o valor de no
excede na prtica 72 (sen 72 = 0,95), o valor mximo da abertura numrica com uma
objectiva a seco 0,95, j que para o ar n = 1,0. O valor do ndice de refraco assim
especialmente importante na determinao da abertura numrica. A vantagem de utilizar o
leo de imerso que este possui um ndice de refraco de 1,5 o qual semelhante ao do
vidro (tabela. 2). Tal evita a disperso dos raios luminosos quando atravessam o conjunto
lmina-leo, permitindo a entrada de um grande cone de luz na objectiva (fig. 5). Como foi
referido conseguem-se valores de LR prximos de 0,2 m.

Tabela 2 - Valores do ndice de refraco para diferentes meios. Em microscopia, varia entre 1,0
(para o ar) e 1,5 (para o leo de imerso).

Material ndice de Refraco

Ar 1.0003
gua 1.33
Glicerol 1.47
leo de imerso 1.515
Vidro 1.52
Diamante 2.42

2
Assumindo que a ampliao da lente ocular de 10x

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Fig. 5 Funo do leo utilizado com a objectiva de imerso (adaptado de Pelzcar et al., 1980).

3.5. Outros tipos de microscpios pticos

Microscpio de campo escuro

Baseia-se no princpio de que a luz dispersada pela superfcie dos materiais que possuem
diferentes ndices de refraco. A luz dispersada entra na objectiva e o objecto aparece
iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal consegue-se pela utilizao de um tipo
especial de condensador que ilumina o objecto obliquamente. um tipo de microscopia
utilizada na observao de microorganismos no corados, suspensos em lquidos
preparaes a fresco e em gota pendente.

Microscpio de contraste de fase

Grande parte dos detalhes de clulas vivas no so detectados no microscpio de campo
luminoso devido ao facto de as estruturas celulares serem transparentes e incolores, no
apresentando contraste suficiente. O microscpio de contraste de fase tem um sistema
ptico especial que torna possvel a distino de materiais biolgicos que diferem
ligeiramente no que se refere aos seus ndices de refraco. A luz que passa atravs de
materiais com densidades ligeiramente diferentes refractada ou desviada do seu trajecto
original. Variaes mnimas de fase, devidas s diferenas de ndice de refraco dentro
do objecto, so ampliadas e transformadas em mudanas de amplitude (intensidade) as
quais so visualizadas como diferenas de contraste na imagem (fig. 6). A microscopia de
fase utilizada para observar clulas e tecidos vivos e particularmente til para o estudo
da mitose em clulas cultivadas in vitro.

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Figura 6 - Aspecto de clulas vivas observadas com microscpio ptico de campo luminoso
(a) e microscpio ptico de contraste de fase (b).

Microscpio de fluorescncia
Fluorescncia a propriedade de algumas substncias para, aps serem excitadas com
radiao de baixo comprimento de onda, emitirem radiao de maior comprimento de
onda. Algumas substncias absorvem a energia da radiao ultravioleta emitindo depois
radiao dentro do espectro de luz visvel. Microorganismos corados por um corante
fluorescente aparecem como objectos luminosos quando observados com luz ultravioleta.
com recurso a esta tcnica que se evidenciam, por exemplo, os antigenes quando
associados a anticorpos acoplados a molculas fluorescentes. Os fluorocromos so
conjugados com anticorpos, sendo possvel identificar clulas individuais que reagem com
o anticorpo (aplicao designada de imunofluorescncia).

Microscpio de ultravioleta
J se fizeram algumas referncias a este tipo de microscpio em pargrafos anteriores (ver
3.3). A radiao utilizada o ultravioleta que tem um comprimento de onda perto de 0,2 a
0,3 m, inferior ao valores de para a luz visvel, o que permite melhorar o limite de
resoluo comparativamente ao microscpio de campo luminoso. A ptica constituda
por lentes de quartzo j que o vidro no transmite este tipo de radiao.

4. Microscopia electrnica
Como foi referido o poder de resoluo do microscpio ptico est limitado pela abertura
numrica e pelo comprimento de onda da radiao. No sendo possvel aumentar a

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abertura numrica, a soluo passou pela utilizao de radiao de menor comprimento de

onda ().
Em 1924 Louis de Broglie, um fsico francs, demonstrou que os electres tm
propriedades ondulatrias, semelhana da luz visvel, ultravioleta e raios x. O
comprimento de onda de um electro em movimento depende da sua velocidade e esta da
energia de acelerao que lhe imprimida. O comprimento de onda de um electro dado
por:
h
=
mv

Nesta frmula representa o comprimento de onda, h a constante de Planck (6,62559 x

10-34 J.s-1), m a massa da partcula e v a velocidade da partcula.
Os electres podem ser acelerados por uma diferena de potencial, sendo a velocidade
directamente proporcional a essa diferena de potencial (tabela 3).

Tabela 3. Comprimento de onda de um electro em funo da diferena de potencial aplicada

Diferena de potencial (V) - Comprimento de onda (m)

150 0,1
50 000 0,0053
100 000 0,0038
1 000 000 0,00087

Para efeitos de clculo, valores aproximados para o comprimento de onda dos electres
podem ser obtidos pela seguinte frmula:

1,5
=
V
onde V a diferena de potencial em volts.

Electres acelerados por diferena de potencial de 50 000 a 100 000 volts tm um

comprimento de onda cerca de 100 000 vezes menor que o da luz visvel. Graas ao
reduzido valor de possvel aumentar o poder de resoluo. O limite de resoluo do
microscpio electrnico de transmisso atinge 0,4 a 0,5 m (excepcionalmente 0,2 m) o
que representa, relativamente ao microscpio ptico, um poder resolvente cerca de 500
vezes maior. Em objectos biolgicos o limite de resoluo situa-se perto de 1 m (10 ).

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O primeiro microscpio foi construdo em 1931, na Universidade Tcnica de Berlim, por

Max Knoll e Ernst Ruska.

4.1. Microscpio electrnico de transmisso (TEM)

A fig. 7 mostra o aspecto exterior de um microscpio electrnico de transmisso (TEM). A
parte essencial do microscpio electrnico de transmisso uma coluna vertical a qual
percorrida por um feixe de electres.
Na parte superior da coluna existe uma fonte de electres, o canho electrnico. No canho
electrnico existe um gerador de electres que frequentemente um filamento de
tungstnio. A voltagem aplicada entre o filamento e o nodo situa-se entre 40 000 e 100
000 V e provoca a acelerao dos electres (fig. 8).

Fig. 7 - Aspecto exterior de um microscpio

electrnico de transmisso (JEOL mod. JEM
1230)

Diferena de
potencial 60 kV
Filamento

Anodo
Feixe de electres

Fig. 8 Esquema do canho electrnico.

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Para alm do canho electrnico, a coluna constituda por uma ou mais lentes
condensadoras, uma lente objectiva, uma ou mais lentes intermedirias (sem
correspondente no microscpio ptico e que servem para variao da ampliao), uma
lente projectora, um porta objectos em platina mvel que controlado do exterior, um
cran (por vezes dois), uma cmara fotogrfica e outros dispositivos que no sero
mencionados dada a complexidade do aparelho (fig. 9).
As lentes do microscpio electrnico so de natureza electromagntica, sendo constitudas
por uma bobine, formada por milhares de voltas de fio, atravs da qual passa uma corrente
elctrica. Enquanto que no microscpio ptico a focagem da objectiva faz-se pelo
deslocamento mecnico da lente ou do objecto, no microscpio electrnico a focagem
feita por variao da corrente que passa na bobine, a qual afecta a distncia focal da
objectiva. A variao da ampliao feita por variao da distncia focal das lentes
intermdias.

A
Fig. 9 Aspecto da coluna do microscpio electrnico
de transmisso (TEM); A - Seco da coluna (Philips,
EM 200); B Aspecto exterior (Leo, Libra 120).

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Os objectos que se pretendem estudar, resultantes de cortes ultra-finos, so colocados sobre

uma pequena grelha metlica circular de dimetro reduzido (3 mm). So as modificaes
que os electres experimentam ao atravessar esses cortes, isto a disperso que sofrem,
que nos do a imagem final. A disperso dos electres ocorre em funo da espessura e da
densidade molecular do objecto e depende, em especial, do nmero atmico dos tomos
que entram na sua composio. Quanto maior for o nmero atmico, maior a disperso.
Como grande parte dos tomos que constituem as estruturas biolgicas tm nmero
atmico baixo e contribuem pouco para a formao da imagem, adicionam-se tomos
pesados estrutura molecular, para aumentar o contraste. Como o olho humano no
sensvel aos electres, a imagem visualizada num cran fluorescente ou ento registada
em pelcula fotogrfica. semelhana do microscpio ptico a imagem obtida
bidimensional; na fig. 10 possvel visualizar a ultra-estrutura de uma mitocndria
observada ao TEM.

Fig. 10 Aspecto da ultra-estrutura

mitocondrial observada ao TEM, com
ampliao de 60 000 x.

Um aspecto importante que a coluna do microscpio electrnico tem de estar em alto

vcuo para impedir a coliso dos electres com os tomos do ar. Uma bomba de vcuo
assegura um vazio de menos 5 atm.
O microscpio de electrnico de transmisso assemelha-se, na disposio dos seus
elementos, a um microscpio ptico invertido. Este paralelismo pode ser observado na fig.
11. As tabelas 4 e 5 permitem comparar os dois tipos de microscpios, ptico e electrnico,
para um conjunto de caractersticas.

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Fonte Fonte de electres

luminosa (filamento)

Lente do
condensador
Lente
Objecto

Lente
objectiva
Objecto Lente
Imagem
visualizada em
Lente ocular Lente
monitor
projectora

Colector
Observao Imagem num electrnico
directa cran
fluorescente

Microscpio Microscpio electrnico Microscpio electrnico de

ptico (invertido) de transmisso (TEM) varrimento (SEM)

Fig. 11 Comparao entre o microscpio ptico, microscpio electrnico de transmisso (TEM) e

microscpio electrnico de varrimento (SEM).

Tabela 4 Comparao entre os dois tipos de microscpios, ptico e electrnico

Caracterstica Microscpio ptico Microscpio electrnico de
transmisso

Ampliao 25 a 1500 x 1 500 a 200 000 x

Limite de resoluo 0,2 m 0,4 a 0,5 m
na prtica 1 m (10 )
Tipo de radiao Feixe de fotes Feixe de electres
Comprimento de onda da radiao 0,4 a 0,7 m 0,05
(+/- 0,55m)
Tipo de lentes pticas Electromagnticas
Visualizao da amostra Visualizao directa Em cran fluorescente
Espessura dos cortes 5 a 10 m 0,02 a 0,1 m (20 a 100 m)
Coluna Coluna em vcuo

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Tabela 5 Comparao entre diferentes tipos de microscopia (adaptado de Pelzcar et al., 1980).

Tipo de Ampliao total Aspecto do objecto Exemplos de aplicaes

microscopia
Campo luminoso 1000 2000 x Objectos corados ou no; as Determinao dos elementos
bactrias, geralmente morfolgicos grosseiros de
coradas, assumem a cor do bactrias, leveduras, fungos,
corante algas, protozorios

Campo escuro 1000 2000 x Geralmente no corados; o Microorganismos que exibem

objecto aparece brilhante ou algum dado morfolgico
iluminado sobre um fundo caracterstico em estado vivo e em
escuro suspenso lquido (ex.
espiroquetas)

Ultravioleta 1000 2000 x No possvel a visualizao Diferenciao de componentes

directa; fotografado celulares, com base em maior ou
menor absoro da luz ultravioleta

Fluorescente 1000 2000 x Brilhante e corado; cor do Tcnicas de diagnstico, nas quais
corante fluorescente o fluorocromo fixado ao
organismo revela a sua identidade

Contraste de fase 1000 2000 x Vrios graus de brilho Exame de estruturas celulares em
clulas vivas de microorganismos
como leveduras, algas,
protozorios e algumas bactrias

Electrnica (TEM) 200 000400 000 x Observao em cran Exame de vrus e da ultra-
fluorescente estrutura celular

4.2. Microscpio electrnico de varrimento ou de explorao (scanning, SEM)

Os microscpios electrnicos de varrimento foram comercializados pela primeira vez em
1965, sendo extremamente teis em determinadas reas da pesquisa biolgica.
O principal aspecto deste tipo de microscpio que um feixe de electres extremamente
fino utilizado para varrer o objecto. Resultam da vrios efeitos, nomeadamente a
emisso de electres secundrios, isto , electres livres do objecto so ejectados em
consequncia do impacto dos electres do feixe. Os electres secundrios emitidos pelo

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objecto so recolhidos por um tubo fotomultiplicador e a imagem formada num cran de

televiso. Frequentemente o objecto coberto com uma fina pelcula metlica no sentido
de favorecer a emisso de electres secundrios. A fig. 12 mostra o aspecto exterior de um
microscpio electrnico de varrimento.
O microscpio electrnico de varrimento pode ser utilizado numa amplitude larga de
ampliaes, variando desde 10 a 100 000x o que permite uma grande plasticidade na sua
utilizao. Acresce o facto de apresentar uma grande profundidade de focagem o que
permite estudar a topografia da superfcie de objectos slidos e obter imagens
tridimensionais (fig. 13). Relativamente ao limite de resoluo, este depende de vrios
factores, sendo o mais importante o dimetro do feixe de electres no ponto de impacto
com o objecto. Na prtica, em condies favorveis, conseguem-se valores de cerca de 10
m para o limite de resoluo.
Os microscpios electrnicos de transmisso e varrimento diferem nas suas propriedades.
No primeiro caso (TEM), o objectivo principal centra-se em obter valores muito baixos
para o limite de resoluo, pelo que a sua utilizao est vocacionada para o estudo da
ultra-estrutura celular. Aqui os objectos a observar so resultado de cortes ultra-finos,
sendo difcil obter informao sobre estruturas a 3 dimenses. No segundo caso (SEM),
possvel obter informao detalhada sobre a topografia da superfcie de objectos slidos, e
obter imagens tridimensionais.

Fig. 12 Aspecto exterior de um moderno microscpio

electrnico de varrimento (SEM) (Leo).

Fig. 13 Aspecto tridimensional de uma diatomcea

observada com SEM (ampliao 5000x).

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5. Preparao de material biolgico para observao em microscopia

A preparao de material biolgico para observao em microscopia ptica e em
microscopia electrnica implica uma srie de procedimentos tcnicos. Seguidamente so
mencionados, ainda que de forma breve, alguns aspectos bsicos e normas comuns a
muitas dessas tcnicas.

5.1. Fixao
As clulas depois de morrerem decompem-se rapidamente. O objectivo da fixao parar
as reaces qumicas que ocorrem ao nvel celular procurando manter intactas as
estruturas. Com a fixao pretende-se:
i) evitar a autlise, isto , a destruio da clula pelas suas prprias enzimas;
ii) impedir a actividade e a proliferao de bactrias;
iii) endurecer as clulas para que estas resistam melhor s etapas seguintes da
tcnica histolgica;
iv) aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na
microscopia ptica e aumentar o contraste na microscopia electrnica.
A fixao pode ser feita utilizando agentes qumicos ou por processos fsicos, como o
calor, que muito utilizado para as fixaes de bactrias e leveduras. A congelao rpida
do material biolgico em azoto lquido (-160 a 190C) seguida de desidratao no vcuo
(-30Ca 40C), para impedir a formao de cristais de gelo, tambm um processo fsico.
A fixao qumica faz-se normalmente por imerso do objecto numa mistura de compostos
qumicos diversos e em propores determinadas. Nas misturas fixadoras entram
normalmente lcoois (etlico e metlico), aldedos (formaldedo, glutaraldedo, etc), cido
actico, tetrxido de smio, etc. A mistura deve considerar um pH e uma presso osmtica
adequados. Deve ter-se presente que normalmente aquilo que se observa no corresponde
necessariamente ao que existia in vivo, devido interaco da mistura fixadora com o
material biolgico.
O glutaraldedo e o tetrxido de smio so os fixadores mais usados em microscopia
electrnica porque provocam a coagulao das protenas, originando modificaes
mnimas na estrutura celular.

5.2 Incluso
O objectivo da incluso conferir ao material biolgico uma consistncia adequada para
que este possa ser cortado em fatias muito finas.

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Os meios de incluso mais usados (parafina e resinas do tipo epoxi) no so miscveis com
a gua, pelo que, aps a fixao, o material biolgico sujeito a uma desidratao,
normalmente pelo lcool ou pela acetona. A parafina utilizada a quente (cerca de 60C) e
solidifica pelo arrefecimento, formando blocos que permitem efectuar cortes com alguns
micra de espessura. No permite contudo a realizao de cortes com espessura inferior a
0,1 m (< 100 m), pelo que no um meio de incluso adequado para microscopia
electrnica. Quando se utilizam resinas frequente proceder-se depois substituio do
lcool por uma mistura da resina de incluso, isto , faz-se uma infiltrao inicial.
Em microscopia electrnica utilizam-se as resinas do tipo epxi, como a Araldite e Epon,
que permitem formar um bloco extremamente slido o qual suporta cortes de apenas
algumas dezenas de nanmetros de espessura.

5.3 Corte ou microtomia

Para haver formao de imagem no microscpio necessrio que o material biolgico se
deixe atravessar pela luz, no caso do microscpio ptico, ou pelos electres, no caso do
microscpio electrnico. Assim, torna-se necessrio proceder ao corte do material
biolgico para que isso seja possvel.
Os cortes so executados em aparelhos designados micrtomos. Nalguns micrtomos o
bloco est fixo e a navalha mvel, noutros a navalha fixa e o bloco que se movimenta
(fig. 14).

Fig. 14 Aspecto de micrtomo do tipo

rotativo, de navalha fixa.

Os micrtomos possuem navalhas extremamente afiadas que permitem efectuar cortes

muito finos. Em microscopia ptica as navalhas so de ao e permitem efectuar cortes com
alguns micra de espessura (5 a 10 m); em microscopia electrnica os cortes so

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extremamente finos, cerca de 20 a 100 m, utilizando-se micrtomos com navalhas de

vidro ou de diamante.

5.4 Colorao
A maioria dos elementos que constituem os tecidos biolgicos naturalmente incolor,
apresentando pouco contraste, pelo que difcil a sua observao. Assim, no sentido de
evidenciar determinadas estruturas celulares, os cortes so corados por diferentes
substncias antes de se proceder montagem definitiva.
A maioria dos corantes comporta-se como base ou cido. Nos corantes bsicos, o grupo
qumico responsvel pela cor ou cromforo, catinico (isto , apresenta carga positiva).
Os grupos cromforos destes corantes combinam-se com os grupos cidos ou aninicos
(que apresentam carga negativa) das molculas celulares. Molculas cidas como o DNA,
que apresenta carga elctrica negativa conferida pelos grupos fosfato, tm afinidade com
este tipo de corantes. O azul de metileno, o azul de toluidina e a hematoxilina so
exemplos de corantes bsicos.
Nos corantes cidos o grupo cromforo aninico (apresenta carga negativa) e ocorre a
combinao com os componentes celulares bsicos (que tm carga positiva). Exemplos de
corantes cidos so a eosina e a fucsina cida.
Os cortes para microscopia electrnica de transmisso so colocados sobre uma pequena
grelha e sofrem uma contrastao, a qual consiste na deposio, sobre certas estruturas, de
tomos de elementos de nmero atmico elevado (normalmente chumbo, urnio ou
tungstnio) os quais apresentam grande poder para dispersar electres.

5.5 Montagem
Consiste na colocao do material biolgico fixado, desidratado, includo, cortado e
corado, entre uma lmina e uma lamela de vidro. A montagem pode ser permanente se os
cortes forem colocados na lmina numa resina (por exemplo blsamo do canad ou
entellan) que, depois de colocada a lamela, solidifica e permite conservar a preparao.
No caso da microscopia electrnica esta fase no existe uma vez que o material, aps ser
contrastado, observado de imediato e fotografado, sendo as fotografias o registo
definitivo das estruturas biolgicas em estudo.

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