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Facult des Sciences De La Nature Et De La Vie

Dpartement de Biologie et Ecologie Vgtales


Exposer
Spcialit : BIOTECHNOLOGIE ET VALORISATION DES PLANTES

Thme

Dcoupage LADN par Les Enzymes De


Restriction

Prsenter par:
Nouar Oussama Hadji Rabah

Encadreur:
Pr.Rahmouni

2017/2018
Facult des Sciences De La Nature Et De La Vie

Dpartement de Biologie et Ecologie Vgtales


Exposer
Spcialit : BIOTECHNOLOGIE ET VALORISATION DES PLANTES

Thme

Dcoupage LADN par Les Enzymes De


Restriction

Prsenter par:
Nouar Oussama Hadji Rabah

Encadreur:
Pr.Rahmouni

2017/2018
I
II
III
IV
Liste des abrviations

RFLP: Restriction fragments length polymorphism.

SNP: Single nuclotide polymorphisme.

STS : Squence tag site.

V
Liste des figures
Figure 1 : Exemple pour un enzyme de restriction EcoRI ...4

Figure 2 : Exemple de transfert de fragments del ADN sur membran a partir


dun gel (southern blotting) ... 7

Figure3 : Schma reprsentant la coupure dADN double brin par lenzyme EcoRI ..10

Figure4 : Coupure de l'ADN double brin par EcoRI, gnrant des extrmits cohsives...........12

Figure 5 : Coupure de l'ADN double brin par HaeIII, gnrant des extrmits franches ..13

Figure 6 : Systmes de restriction et de mthylation.... 14

Figure 7 :) lectrophorse de lADN lambda digr en utilisant trois de restrictios diffrentes16

Figure 8 : Gel d'agaros ces produits de digestion d'un fragment de 5kb par deux enzymes

de restriction ..17

Figure 9 : Les diffrentes possibilits de la localisation des sites de coupure par BamHI. 17

Figure 10 : Les diffrentes possibilits de localisation des sites de restriction

des deux enzymes (EcoRI, etBamHI). 18

Figure 11 : Carte de conception des enzymes utilises en gnie gntique ..18

Liste des tableaux


Tableau 1: Liste non exhaustive des enzymes de restriction .8

Tableau 1: Coupure de l'ADN double brin par diffrent denzymes de restriction. ..10

VI
Sommaire

Introduction

I 1er Chapitre :
Gnralits .3

I.1 Histoire les Enzyme de Restriction....4

I.2 Dfinition les Enzyme de Restriction ...5

I.3 La coupure ou phnomne de restric ....5

I.4 Nomenclature des enzymes de restriction.................................................7

I.5 Types de coupures ....................................................................................9

I.6 Les types Enzyme de restriction...............................................................11

I.6.1 Enzymes de type

I.6.2 Enzymes de type II

I.6.3 Enzymes de type III

I.7 Classification des enzymes de restriction ................................................11

I.8 Enzymes de restriction utilises en gnie gntique .................................11

I.9 Exemples d'enzymes de restriction de type II............................................12

I.10 Isoschizomres et famille d'enzymes.........................................................13

II 2me Chapitre .11

II.1 Mthylation de l'ADN .........................................14

II.1.a Dam mthylase

II.1.b Dcm mthylase

II.2 Analyse lectrophortique des fragments de restriction ......15

II.3 Rendre lADN visible....................................................................16

II.4 Utilisation des endonuclases de restriction pour tablir la mappe de


restriction ........................................................................13

Conclusion ..14

Rfrences bibliographiques..15
VII

Introduction
Introduction

Lorsquun bactriophage infecte une bactrie, il lui injecte son ADN. Sans systme
de dfense adapt, de nombreux bactriophages seront alors produits dans la bactrie qui sera
finalement
lyse. De manire rsister cette infection la bactrie synthtise des enzymes de restriction
qui vont
fragmenter lADN viral tranger. Paralllement, la bactrie possde des mthylases capables
de modifier
(mthyler) son propre ADN afin quil ne soit pas reconnu par les enzymes de restriction.

Aujourdhui plusieurs centaines denzymes de restriction diffrentes sont disponibles


commercialement.
Elles font parties des outils (ciseaux molculaires) indispensables aux biologistes
molculaires. Ces outils
permettent de couper lADN afin disoler certains fragments, de construire des cartes
gntiques (cartes
de restriction), de crer de nouvelles combinaisons dADN, etc. Les enzymes de restrictions
ont permis
lavnement de la biologie molculaire.

Le nom dune enzyme de restriction indique son origine: Sau3A provient de


Staphylococcus aureus 3A,
BamHI provient de Bacillus amyloliquefaciens H, EcoRI provient de Escherichia coli, MspI
provient
de Moraxella species, KpnI provient de Klebsiella pneumoniae. Ces enzymes reconnaissent et
coupent
des squences de nuclotides trs spcifiques appeles sites de restriction. Ces sites sont pour
la plupart
palindromiques, cest--dire quils sont composs de squences nuclotidiques identiques sur
les deux
brins mais en orientations antiparallles.

2
er
1 Chapitre

I. Gnralits

3
I. Gnralits
I.1 Histoire des Enzymes de restriction:
Dcouvertes partir de 1973. Les enzymes de restriction sont capables de reconnatre
spcifiquement une courte squence, de 4 10pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils
permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille rduite, ou de le couper tel ou tel
site dsir. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments
dont les extrmits sont franches. Cependant, la plupart ralisent une coupure
dissymtrique : on parle dans ce cas d'extrmits cohsives (chaque fragment possde une
chane qui dpasse l'autre de quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont t
caractriss : ils reconnaissent une grande varit de sites de coupure.
Les enzymes de restriction sont utiliss pour tablir une carte de restriction de toute
molcule d'ADN que l'on souhaite caractriser. Cela consiste dterminer l'ordre des sites
de restriction le long de cette molcule, qui vont produire, aprs "digestion enzymatique"
de cette molcule, des fragments de tailles diffrentes dont la taille pourra tre dfinie par
lectrophorse.

Les enzymes de restriction appartiennent la classe des endonuclases, cest--dire des


enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nuclotides lintrieur
dun acide nuclique. Les endonuclases se diffrencient des exonuclases qui dgradent
la molcule dADN partir de lune de ses extrmits (3 ou 5).

Fig.1: Exemple pour un enzyme de restriction EcoRI

4
I.2 Dfinition Les enzymes de restriction :
Les enzymes de restriction sont des protines qui coupent lADN en des sites spcifiques. Les
enzymes de restriction, galement connues sous le nom d'endonuclases de restriction,
reconnaissent les squences spcifiques de paires de bases dADN et coupent ou sparent
chimiquement lADN au niveau des arrangements spcifiques de paires de bases. Elles ont tout
dabord t identifies et isoles sur des bactries qui les utilisent en tant que mcanisme de dfense
naturelle pour couper lADN intrus des bactriophages virus qui infectent les bactries. Tout ADN
tranger rencontrant une enzyme de restriction sera digr ou coup en de nombreux fragments, et
rendu inefficace. Ces enzymes dans les bactries constituent le premier systme immunitaire
biologique. Il y a des milliers denzymes de restriction, chacune est appele daprs le nom de la
bactrie dont elle est isole. Par exemple :

EcoRI = la premire enzyme de restriction isole de la bactrie Escherichia coli

HindIII = la troisime enzyme de restriction isole de la bactrie Haemophilus influenzae

PstI = la premire enzyme de restriction isole de la bactrie Providencia stuartii.

I.3 La coupure ou phnomne de restriction:


Le phnomne de restriction a t
observ bien avant que les enzymes de restriction ne fussent mises en vidence. En effet,
lorsquun bactriophage colonise une bactrie, le phnomne de lyse bactrienne, aprs
multiplication du phage par le biais de la machinerie enzymatique de la bactrie hte peut ne
pas avoir lieu.
Ceci est expliqu par le fait que :
1. lADN phagique est intgr, sous forme silencieuse, dans celui de la bactrie : cycle
lysognique
2. lADN phagique est compltement dtruit (hydrolys) par les enzymes de la bactrie
hte : les enzymes de restriction (Werner Arber).
Lorsquune endonuclase de restriction coupe un ADN, le rsultat peut tre :
1. soit une coupure franche c'est--dire au mme niveau sur les deux brins ; ce sont les
bords ou les bouts francs : la coupure a lieu au milieu du site de restriction. Il ne peut
pas y avoir de liaison spontane entre les fragments qui ont rsult de cette coupure.
Seule une T4 ligase peut rtablir la ligation des deux brins dADN rsultant de la
coupure.
ADN avant la coupure
5CCCGGG 3
3GGGCCC 5

ADN1
5CCC 3
3GGG 5

5
ADN2
5 GGG 3
3 CCC 5

2. soit une coupure dcale sur les deux brins. On parlera alors dextrmits cohsives.
Les bouts des deux ADN obtenus ne sont plus francs ; ce sont des bouts collants ou
bouts cohsifs. Les coupures sont dcales lune par rapport lautre sur les deux
brins. Les parties simples brins peuvent sapparier, do la possibilit de lier des
fragments dADN dorigine diffrentes :
cest le phnomne de la recombinaison gntique.

ADN avant la coupure


5GAATTC 3
3 CTTAAG 5

ADN1
5G 3
3CTTAA 5

ADN2
5 AATTC 3
3 G 5

qui regroupe les deux types de coupure : En bleu ( gauche) coupure cohsive, en rouge (
droite) coupure franche :

6
I.4 Nomenclature des enzymes de restriction :
Cette nomenclature nobit pas aux rgles de lIUPAC (International Union of Pure
and Applied Chemistry), mais dpend de rgles spcifiques qui tiennent compte de la
bactrie dont a t isole lenzyme de restriction :

La premire lettre, en majuscule, reprsente linitiale du genre bactrien


Les deux lettres, minuscules, qui suivent la premire sont reprsentatives de
lespce.
Le chiffre romain qui suit ces trois lettres est le numro dordre de dcouverte
de
lenzyme pour la mme bactrie source.
La dernire lettre majuscule nest pas obligatoire pour toutes les endonuclases
de
restriction. Elle est reprsentative de la souche de la bactrie do lenzyme a t
isole.

La bactrie Escherichia coli Ry13


EcoR I : premire enzyme isole chez Escherichia coli Ry13
Les enzymes

EcoR V : cinquime enzyme isole chez Escherichia coli Ry13

Fig .2 : La nomclature des Enzymes de restriction exp : EcoRI

7
Chaque enzyme de restriction reconnat une squence nuclotidique spcifique dans
lADN,
appele un site de restriction et coupe la molcule dADN uniquement cette
squence spcifique.
De nombreuses enzymes de restriction laissent une courte longueur de bases non
apparies, appele
une extrmit adhsive , sur le site dADN o elles coupent, alors que deux
enzymes de restriction
peuvent effectuer une coupure sur les deux brins crant des fragments dADN
double brins avec
des extrmits franches . En gnral, les sites de restriction sont palindromiques,
ce qui signifie
que la squence des bases se lit de la mme faon dans les deux sens, de droite
gauche et de
gauche droite sur le brin dADN oppos.

8
I.5 Types de coupures :
les hydrolyses qui gnrent des extrmits dites bouts francs ("blunt ends"), une
fois coup
les deux brins d'A.D.N. ne peuvent plus s'associer (sauf en utilisant la ligase du
phage T4).

les hydrolyses qui gnrent des extrmits dites bouts collants ou dcals
("sticky or protruding ends"), une fois coup les deux brins d'A.D.N. ne peuvent
plus s'associer (sauf en utilisant
la ligase du phage T4).

Par exemple, on trouvera ci-dessous une liste des enzymes et des sites o ils
sont coups

9
Tableau N2 : Coupure de l'ADN double brin par diffrent denzymes de restriction.

Fig.3 : Schma reprsentant la coupure dADN double brin par lenzyme EcoRI.

10
I.6 Les types Enzyme de restriction :

I.6.1 Enzymes de type I : lenzyme reconnat un site particulier qui na aucune


symtrie, ne coupe pas lADN ce niveau mais environ 1000 jusqu 5000
nuclotides plus loin et libre plusieurs dizaines de nuclotides.

I.6.2 Enzymes de type II : ce sont les plus nombreuses et les plus utilises aux
laboratoires de gnie gntique. Leurs sites de restrictions de 4 8 paires de
bases sont des squences palindromiques (se lisent de droite gauche et
inversement, comme le mot radar et la phrase "esope reste ici et se repose").
Elles coupent au niveau de leurs sites de restriction.

I.6.3 Enzymes de type III : Lenzyme reconnat une squence mais coupe une
vingtaine de paires de bases plus long

I.7 Classification des enzymes de restriction :


Les enzymes sont souvent des protines prsentant des proprits de catalyse
spcifique dune raction chimique. Elles sont rparties en 6 classes :
E.C. 1 Oxydorductases: catalysent les ractions redox.
E.C. 2 Transfrases: transfrent d'un groupement fonctionnel.
E.C. 3 Hydrolases: catalysent l'hydrolyse de diffrentes liaisons.
E.C. 4 Lyases: Coupe des liaisons varies sans raction dhydrolyse ou de redox
E.C. 5 Isomrases: isomrisation au niveau de la mme molcule
E.C. 6 Ligases: joinsdeux molcules par une liaison covalente.

I.8 Enzymes de restriction utilises en gnie gntique :


Les enzymes de restriction de type II sont pratiquement les plus utilises en gnie
gntique, cause de leurs proprits de coupure et de reconnaissance. Le E.C. de ces
enzymes
est le suivant: E.C.3.1.21.4.
Nom Commun: Les endonuclases de restriction de type II
Raction: Coupure l'intrieur de la squence d'ADN db au niveau des sites de
reconnaissance et de coupure spcifiques, gnrant des fragments d'ADN double brin se
terminant par 5'-phosphate.
3 (classe): Hydrolase
1 (sous classe): Agissent sur les liaisons esters (Estrases)
21 (sous-sous classe): Leurs produits gardent leurs phosphates 5initial
4 : Ncessite la prsence de Mg++dans le milieu

11
Raction gnrale
ADN (Substrat) ADN digr : Produit de digestion
(H2O, nergie, Enzyme, Mg++)
La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction (E.C.3.1.21.n) implique la
prsence dans le milieu des facteurs suivants.
- Enzyme (E.C.3.1.21.n)
- Substrat ADN double brin non digr
- Cofacteur : En gnral, seul le Mg++ est indispensable. Quelques enzymes de
restriction font
appel dautres cofacteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzymes le S-
adnosylMthionine.
- Facteurs physico-chimiques: Ces facteurs contrlent aussi ces ractions, pH, potentiel
doxydorduction, forces ioniques. Lnergie libre dgage par lhydrolyse est
suffisamment
importante pour que la raction ne soit pratiquement pas rversible dans les conditions
habituelles.
- Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettant
loptimisation
des ractions de multiples enzymes avec le mme tampon (pH:7- 7.9, PotOxyRed :
dithiothreitol 1mM, Force ionique : NaCl ou CH3COOK de o 100mM ; varient dun
tampon
lautre).

I.9 Exemples d'enzymes de restriction de type II:


1- EcoRI : E.C. 3.1.21.4: C'est la deuxime enzyme caractrise et identifie chez E. coli
souche
R, le site de reconnaissance et de coupure est form de six paires de bases (nuclotides)

Fig.4: Coupure de l'ADN double brin par EcoRI, gnrant des extrmits cohsives.

12
2- HaeIII: C'est la troisime enzyme de restriction caractrise et identifie chez la bactrie
Haemophilus aegypticus.

Fig.5: Coupure de l'ADN double brin par HaeIII, gnrant des extrmits franches

Isoschizomres et famille d'enzymes:


En gnral, des enzymes de restriction diffrentes reconnaissent des squences
diffrentes. Cependant, plusieurs enzymes isoles d'organismes diffrents
reconnaissent des
squences identiques. On les appelle isoschizomres. Ceux-ci ne coupent pas toujours la
squence reconnue au mme endroit.

Une famille d'enzymes est caractrise par le fait que tous les membres de cette famille
produisent les mmes extrmits, mme si elles ont des squences de
reconnaissance diffrentes.

13
II.2me Chapitre
II.1 Mthylation de l'ADN:
La plupart des souches de E. coli contiennent deux enzymes qui mthylent l'ADN : la
Dam mthylase et la Dcmmthylase.

Fig.6: Systmes de restriction et de mthylation.

II.1.a Dam mthylase:


La Dam mthylase mthyle l'adnine dans la squence 5'-GA*TC-3'. Les sites de
reconnaissance de plusieurs enzymes de restriction telles que PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII,
MboI et Sau3AI contiennent cette squence de mme qu'une certaine proportion des sites
reconnus par ClaI (1 site sur 4), TaqI (1 site sur 16), MboII (1 site sur 16) et HphI (1 site sur
16). Certaines enzymes ne coupent pas si l'adnine est mthyle. L'enzyme MboI ne coupe
pas la squence GATC si elle est mthyle tandis que l'enzyme Sau3AI reconnat la mme
squence que MboI et n'est pas affecte par la mthylation dam.

II.1.b Dcm mthylase:


Cette mthylase ajoute un groupement mthyle la cytosine interne des squences 5'-
CC*AGG-3' et 5'-CC*TGG-3'. Une enzyme affecte par la dcm mthylation est EcoRII. On
peut contourner le problme en utilisant BstNI qui reconnat la mme squence quEcoRII,
mais qui ne la coupe pas au mme endroit. Si BstNI ne convient pas, on peut prparer l'ADN
partir de souches dE. coli qui sont dcm-. E.coli K contient au moins 3 systmes de
restriction diffrents dpendant de la mthylation qui reconnaissent leurs squences cibles
seulement lorsqu'elles sont mthyles: mrr (6-mthyladnine), mcrA (m5CG o m5C est la 5-
mthylcytosine) et mcrB (Pum5C). Des fragments d'ADN mthyls un de ces sites sont
clons inefficacement dans des souches sauvages de E. coli. Par exemple, comme les CG de
l'ADN de mammifre sont largement mthyls in vivo, l'ADN humain est restreint par mcrA.

14
II.2 Analyse lectrophortique des fragments de restriction :
Une enzyme de restriction agit linstar de ciseaux molculaires, effectuant des
coupures au niveau de la squence de paires de bases quelle reconnat. La structure
tridimensionnelle ou la forme dune enzyme de restriction lui permet de sintgrer
parfaitement dans le sillon form par les deux brins dune molcule dADN. Lorsque
quelle est attache lADN, lenzyme glisse le long de la double hlice jusqu ce
quelle reconnaisse une squence spcifique de paires de bases qui indique lenzyme
quelle doit arrter de glisser. Lenzyme spare ensuite chimiquement ou coupe la
molcule dADN sur le site - appel le site de restriction.

Si un site de restriction intervient dans plusieurs emplacements dune molcule dADN, une
enzyme de restriction effectue une coupure chacun de ces sites, ce qui donne plusieurs
fragments dADN. Par consquent, si un morceau donn dADN linaire est coup avec
une enzyme de restriction dont la squence de reconnaissance spcifique est trouve en
cinq emplacements diffrents sur la molcule dADN, on obtiendra six fragments de
longueurs diffrentes. La longueur de chacun des fragments dpend de lemplacement
des sites de restriction sur la molcule dADN.

Un fragment dADN qui a t coup avec les enzymes de restriction peut tre spar en
utilisant un processus connu sous la dsignation d' lectrophorse sur gel dagarose .
Electrophorse signifie transport par l'lectricit. Llectrophorse sur gel dagarose
spare les fragments dADN par taille. Les fragments dADN sont dposs sur un gel
dagarose qui est plac dans une chambre remplie dune solution tampon conductrice. Un
courant continu est pass entre les lectrodes chaque extrmit de la chambre. Les
fragments dADN tant chargs ngativement, ils seront attirs vers le ple positif
(anode) lorsquils sont placs dans un champ lectrique. La matrice de gel dagarose agit
comme un tamis molculaire travers lequel les fragments dADN plus petits peuvent se
dplacer plus facilement que les fragments plus importants. Par consquent, le taux
auquel un fragment dADN migre travers le gel est inversement proportionnel sa
dimension en paires de bases. Avec le temps, les fragments dADN plus petits, iront plus
loin que les fragments dADN plus importants. Les fragments de la mme taille restent
ensemble et migrent en bandes simples dADN. Ces bandes se verront dans le gel une
fois que lADN est color.

Une situation analogue est celle dans laquelle tous les bureaux et les chaises dune salle
de
classe ont t rassembls au hasard. Un lve isol peut rapidement et assez facilement se
faufiler dans ce labyrinthe alors quil faudra plus de temps une chane de quatre lves
qui aura des difficults se frayer un chemin.

15
II.5 Rendre lADN visible:
LADN est incolore, ainsi, on ne peut pas voir les fragments dADN dans le gel
pendant llectrophorse. On ajoute la solution dADN un tampon de charge
contenant deux colorants bleus.
Le tampon de charge ne colore pas lADN lui-mme mais facilite le chargement
des gels et la surveillance de lavancement de llectrophorse de lADN. Les
fronts colors migrent vers lextrmit positive du gel linstar des fragments
dADN. Le colorant plus rapide co-migre avec les fragments dADN denviron
500 pb, alors que le colorant plus lent co-migre avec les fragments dADN
dune taille d'environ 5 kb. La coloration de lADN fait ressortir son emplacement
sur le gel. Lorsque le gel est immerg dans un colorant dADN Fast Blast, les
molcules colores sattachent
lADN pig dans le gel dagarose. Lorsque les bandes sont visibles, vos lves
peuvent comparer les modles de restriction ADN des diffrents chantillons
dADN.

Fig.7. lectrophorse de lADN lambda digr en utilisant trois enzymes de restriction diffrentes.

. Ligne 1, marqueurs ADN ( Lambda digr avec HindIII); ligne 2, ADN lambda non
digr; ligne 3, ADN lambda digr avec PstI; ligne 4, ADN lambda digr avec
EcoRI; ligne 5, ADN lambda digr avec HindIII.

16
II.4 Utilisation des endonuclases de restriction pour tablir la
mappe de restriction:
La figure au dessous montre la digestion d'un fragment d'ADN de 5 kb par deux enzymes
de restriction (BamHI et EcoRI).

Fig.8: Gel d'agarose des produits de digestion d'un fragment de 5kb par deux enzymes de restriction.

L'analyse des rsultats de la digestion (fig.) nous permet de dterminer les diffrentes
possibilits de la localisation des sites de restriction pour chaque enzyme (fig. et ).

Fig.9: Les diffrentes possibilits de la localisation des sites de coupure par BamHI.

17
Fig.10: Les diffrentes possibilits de localisation des sites de restriction des deux enzymes (EcoRI, et
BamHI).

2- Enzymes de modification des acides nucliques :

Fig.11: Carte de conception des enzymes utilises en gnie gntique.

18
Conclusion :
Elles sont trs utiles en biologie molculaire pour extraire ou recombiner des morceaux
d'ADN lors de clonages.

les enzymes de restriction sont utilises Pour couper(rduire) l'ADN dans des fragments, qui
est ncessaire pour la recombinaison d'ADN et l'lectrophorse.

La recombinaison d'ADN dans ce laboratoire a utilis des enzymes de restriction Pour insrer
ampicillin rsistant des gnes dans des cellules bactriennes usine plasmids bactrien, qui
prend les gnes.

Le choc de chaleur a t utilis Pour faire la membrane cellulaire bactrienne permable


l'ADN recombinant, alling il passer par la membrane.

L'lectrophorse d'ADN est utilise dtermine le sise du fragment qui Est coup(rduit)
d'enzymes de restriction.

Enzymes de restriction seulement coupe(diminution) et leurs sites de reconnaissance de


protine spcifiques.

19
Rfrences bibliographiques:

20