Bioqumica General (2017) Universidad Nacional de Trujillo

PRACTICA DE LABORATORIO N 3
INHIBICIN DE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

I. INTRODUCCION
La enzima succinato deshidrogenasa (SDH), succinato coenzima Q reductasa o
complejo II mitocondrial (nmero EC 1.3.5.1) es un complejo proteico que est
compuesta de cuatro subunidades, dos hidroflicas y dos hidrofbicas, y que contiene
FAD (flavn-adenn-dinucletido) unido covalentemente. Se encuentra ligado a la
membrana interna mitocondrial e interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de
transporte de electrones. Posee algunas caractersticas de una enzima alostrica; es
activada por el succinato, el fosfato, el ATP y la coenzima Q reducido, y es inhibido
por el malonato, un anlogo estructural del succinato.
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a las enzimas y
disminuyen su actividad. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible.
En la inhibicin competitiva, inhibidor y sustrato no se pueden unir a la misma
enzima al mismo tiempo; compiten por el acceso al sitio cataltico de la enzima.
Generalmente, esta inhibicin ocurre cuando el inhibidor es a menudo
estructuralmente similar al sustrato. Este tipo de inhibicin puede revertirse con
concentraciones suficientemente altas del sustrato, mientras la concentracin del
inhibidor se mantiene constante.
Los inhibidores competitivos pueden unirse a la enzima libre (E), pero no al
complejo enzima-sustrato (ES), dando lugar a la formacin de dos complejos:
enzima-inhibidor (EI) y ES. Estos inhibidores interfieren con la unin del sustrato (es
decir, aumentan el valor de Km), pero no obstaculizan la catlisis en el complejo ES
dado a que no se pueden unir al complejo ES (es decir, no afectan a la Vmax).
El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto inhibidor del
malonato, como un inhibidor reversible de la enzima succinato deshidrogenasa del
hgado.

II. MATERIALES
1. Material biolgico: Homogenizado heptico.
2. Material y equipo de laboratorio:
Gradilla para tubos.
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm (5).
Pipetas de 1 mL (2), 2 mL (1) y 5 mL (1).
3. Reactivos y soluciones:
Buffer fosfato de Na 0.1 M pH 7.4
2,6 diclorofenolindofenol 0.02%.
Solucin de succinato 0.1 M.
Solucin de malonato 0.1 M.

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III. PROCEDIMIENTO
A) INHIBICIN DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA: Sistema de
incubacin y evaluacin del efecto inhibidor del malonato:

TUBOS
COMPONENTES (mL) Y PROCESO
1 2 3 4 5
Buffer Fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4 1.5 1.2 1.0 0.8 0.3
2,6 diclorofenolindofenol 0.02% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Succinato 0.1 M 0.2 --- 0.2 0.2 ---
Succinato 0.5 M --- --- --- --- 0.7
Malonato 0.1 M --- --- --- 0.2 0.2
Homogenizado heptico --- 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar suavemente y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar y anotar

los resultados segn el color de cada uno de los tubos.

IV. RESULTADOS
Registrar en la siguiente tabla los datos obtenidos e interpretar:
TUBOS
PARMETRO
1 2 3 4 5
Color inicial
Color final (despus de 15 a 30
minutos)
Existe xido-reduccin: Si / No

Existe inhibicin: Si / No

V. CUESTIONARIO
1. Qu es un inhibidor? Cul es su mecanismo general de accin?
2. Qu relacin hay entre los trminos inhibicin, inactivacin y desnaturalizacin
de una enzima?
3. Qu se entiende por sitio alostrico?
4. Qu efecto tiene el aumento de la concentracin del sustrato sobre la inhibicin
competitiva de una reaccin enzimtica?. Cmo puede reconocerse
experimentalmente que la inhibicin de una reaccin enzimtica es competitiva?
5. Existe algn tipo de relacin entre la estructura qumica del sustrato y la del
inhibidor competitivo de una reaccin enzimtica?. Es esta una condicin
necesaria para este tipo de inhibidores?
6. Qu tipo de inhibidor es el malonato?. Cul es su mecanismo de accin?
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