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Por:
Director:
Asesor:
Corporacin Autnoma Regional de los Ros Negro y Nare e ISAGEN S.A. E.S.P., por la
financiacin y ayuda logstica necesaria para llevar a cabo esta investigacin.
Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln, por la utilizacin de la infraestructura y
equipos presentes en los Laboratorios de Anatoma Animal, Ecologa Aplicada (LECA), y
Biologa Molecular y Celular.
Postgrado en Bosques y Conservacin Ambiental, Departamento de Ciencias Forestales,
Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln; por su financiacin en la compra de
materiales y reactivos necesarios para terminar el trabajo de laboratorio.
Bilogos Vernica Mara Duque, ISAGEN S.A. E.S.P. y Javier Cardona, CORNARE;
quienes gestionaron la firma del convenio interinstitucional CORNARE-ISAGEN y
velaron por la consecucin y ejecucin de los recursos para este proyecto de investigacin.
Ings. Maria Isabel Pulgarn y Winston Cullar, Empresas Pblicas de Medelln, por la
logstica y gestin en el uso de las instalaciones del campamento La Araa, en el
municipio de San Rafael.
Profesor Mauricio Marn, Director del Laboratorio de Biologa Molecular y Celular,
Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln, quien aport las secuencias cebadoras
para evaluar los marcadores RAPD.
Profesora Edna Judith Mrquez Fernndez, por sus aportes en la interpretacin de los datos
obtenidos.
Profesor lvaro Lema, Departamento de Ciencias Forestales de la Universidad Nacional
de Colombia Sede Medelln, por su colaboracin en los anlisis estadsticos.
Zoot. Fabio Garca, con quien se dise conjuntamente la propuesta de investigacin de la
cual se origin esta Tesis de Maestra.
Bils. MSc., Alexandra Arango y Mara Isabel Ros, profesoras de la Universidad Catlica
de Oriente, por todo el apoyo logstico (gestin para acceder al equipo de pesca elctrica,
propiedad de la U. Catlica), as como por su apoyo acadmico y de trabajo de laboratorio
brindados para la evaluacin de los peces obtenidos en campo.
Bil. Ariel Bermdez y Zoot. Juan Guillermo Ospina, por su trabajo de campo y de
identificacin de las especies en laboratorio.
A todos los compaeros del Laboratorio de Biologa Celular y Molecular que colaboraron
en alguna instancia del trabajo de laboratorio o en el anlisis de los datos.
Al personal que colabor en la obtencin de las muestras y el trabajo de campo en el
oriente antioqueo (conductor Segio Tobn, Zoot. Fabio Garca, asistentes de campo,
pescadores artesanales).
Carolina Villafae y Juan Diego Palacio, anteriormente vinculados al Instituto Alexander
von Humboldt, quienes enviaron material necesario para la colecta inicial de muestras y de
protocolos para trabajo con peces.
A aquellas personas que no se mencionaron y que hayan tenido que ver con la realizacin
de este proyecto.
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RESUMEN
Brycon henni (sabaleta), es una especie nativa de la cuenca del ro Magdalena y tributarios. En
el departamento de Antioquia se distribuye en los ros Nech, Porce, Grande, Nus, Anor, Nare
y Guatap, donde por dcadas ha sido aprovechada por los campesinos y pescadores
deportivos. Su sobre-explotacin podra generar una prdida de la variabilidad gentica en sus
poblaciones. En este estudio, fue determinada la variabilidad gentica y la estructura
poblacional en Brycon henni E. en la cuenca media de los ros Nare y Guatap. Se extrajo
ADN genmico total de 195 ejemplares, para su evaluacin con cebadores para amplificacin
de regiones de ADN microsatlite y con oligonucletidos para la tcnica RAPD (Random
Amplifyed Polimorphic DNA). Con relacin a las regiones de ADN microsatlite, no se
obtuvieron amplificaciones de utilidad, solo mltiples bandeos inespecficos y monomrficos
con algunas de las secuencias, sin utilidad en la estimacin de variabilidad y estructura
gentica. Por el contrario, con la amplificacin de secuencias RAPD se hallaron 66 fragmentos
diferentes, de los cuales un 63% fueron polimrficos. Mediante anlisis de varianza molecular
(AMOVA), se mostr estructuracin poblacional para todos los sitios en las dos cuencas
evaluadas y para la cuenca del ro Nare (ST =0.297 y ST =0.163, p<0.001; respectivamente).
Se estimaron las distancias genticas y se encontr que todas las poblaciones diferan entre s
(p<0.01). La matriz de distancias genticas permiti discriminar entre ejemplares provenientes
de las dos cuencas. Se realiz un Test de Mantel y se hall correlacin entre las distancias
genticas y geogrficas (r=0,431; p<0.001, ambas cuencas; r=0.377, p<0.001, cuenca del ro
Nare ). Los hallazgos de este trabajo sugieren la ocurrencia de una poblacin estructurada, y
pueden tener implicaciones importantes para la conservacin de la variabilidad gentica de
diferentes poblaciones naturales de Brycon henni.
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Genetic variability and population structure in Brycon henni E. (Characiformes:
Characidae) in the middle basin of Nare and Guatap rivers, Antioquia
ABSTRACT
Brycon henni (sabaleta) is a native fish from Magdalena River and tributaries. In Antioquia, it
is distributed across Nech, Porce, Grande, Nus, Anor, Nare and Guatap rivers, and it have
been widely exploited by local countrymen and sport fishermen. The overfishing could drive
to losses of genetic variability into populations. In this study were determined genetic
variability and structure in populations of sabaleta from middle basin of Nare and Guatap
rivers. Total genomic DNA from 195 individuals were extracted, for evaluation with primers
for amplification of microsatellite regions of DNA and oligonucleotides for the RAPD
technique (Random Amplifyed Polimorphic DNA). With regard to regions of microsatellite
DNA, no amplification were useful, because it was obtained only nonspecific multiple
monomorphic bands with some of the primer sequences, useless in the estimation of
variability and genetic structure. Nevertheless, by means of amplification of RAPD sequences
were found 66 different fragments, of which 63% were polymorphic. Through analysis of
molecular variance (AMOVA), population structure was shown for all sites in the two basins
and the river Nare (ST =0.297 y ST =0.163, p<0.001; respectively). Genetic distances were
estimated and found that all populations were different (p <0.01). The genetic distances matrix
allowed to discriminate between both of the middle river basins evaluated. It was carry out a
Mantel Test, finding correlation between genetic and geographic distances (r=0.431, p<0.001,
both of the basins evaluated; r=0.377, p<0.001, Nare river basin). The results of this work
suggest the occurrence of structured populations, and could have valuable implications to
conservation of genetic variability in natural populations of Brycon henni.
Key words: Genetic variability, Brycon henni, population structure, RAPD, conservation
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INTRODUCCIN
En Colombia los ros andinos estn sometidos a problemticas asociadas con la alteracin de
ecosistemas por fragmentacin y prdida de hbitat, alteracin en las dinmicas de regulacin
hdrica, prdida de la cobertura vegetal de sus laderas, alta presin sobre recursos
hidrobiolgicos, contaminacin, entre otros problemas, lo cual conlleva a una alta prdida de
biodiversidad (Mojica 1999; Mojica et al. 2002). El pas posee un enorme potencial en
recursos cticos, y se estima que el nmero de especies de peces de agua dulce en el pas
podra ser superior a 2000 (Cala 1987, 2001).
Brycon es uno de los principales gneros de peces de agua dulce del neotrpico, y algunas de
sus especies son explotadas como recurso pesquero (Wasko et al. 2004). Dentro de este gnero
se encuentra Brycon henni (Eigenmann 1913), especie endmica colombiana de alta
importancia para la seguridad alimentaria de los pobladores ribereos de los cuerpos de agua
que habita, y alternativa promisoria para realizar reintroducciones, como opcin para la
conservacin de la especie y el desarrollo de pesca deportiva. B. henni, conocido en los Andes
Centrales de Colombia como sabaleta, es una especie nativa de la cuenca del principal ro
colombiano, el ro Magdalena y tributarios, distribuyndose ampliamente desde el
suroccidente hasta el noroccidente colombianos (Montoya et al. 2006).
B. henni no aparece en ninguna de las categoras de riesgo propuestas por el libro rojo de
peces dulceacucolas de Colombia (Mojica et al. 2002), ni en la lista roja de especies
amenazadas de la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza (UICN 2003).
Sin embargo, esta especie es altamente susceptible a cambios en las caractersticas fsico-
qumicas del agua, en particular a la disminucin del contenido de oxgeno disuelto (Builes &
Urn 1974), as como a la contaminacin de los cauces de agua, lo que puede ocasionar
disminuciones significativas en el nmero de individuos dentro de sus poblaciones.
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En la cuenca alta y media del ro Nare, la sabaleta comparte su hbitat con algunas especies de
peces nativos, as como con especies exticas de peces (Cyprinus carpio -carpa-, Oreochromis
sp. tilapias-, Micropterus salmoides trucha Bass). Esta ltima especie fue reportada por el
antiguo Instituto Nacional de Pesca y Acuicultura INPA, con una amplia distribucin en
Antioquia, en el rea de influencia del presente estudio (Alvarado & Gutirrez 2002). Dada la
introduccin de especies exticas en muchos ecosistemas acuticos colombianos, se han
generado desequilibrios, provocados por la competencia que ejercen sobre las poblaciones de
peces nativos (Alvarado & Gutirrez 2002).
Por otra parte, las modificaciones de las condiciones ambientales en sistemas lticos pueden
reducir las poblaciones de peces. En particular, la construccin de presas puede producir serios
impactos en las comunidades de peces, debido a perturbaciones o bloqueos de las migraciones
de peces (Katano et al. 2003, 2006). As mismo, se han encontrado reducciones en
distribucin, densidad y diversidad de poblaciones de peces, luego de la construccin de
presas (Morita & Yamamoto 2002; Katano et al. 2006).
Dentro de este contexto, las modificaciones marcadas en las condiciones propias en diferentes
tramos del ro Nare, tales como la construccin de embalses en el oriente antioqueo, podran
originar impactos sobre las poblaciones naturales de sabaleta presentes en el ro. Estos
cambios en el hbitat pueden estar generando procesos de prdida de biodiversidad y
modificaciones marcadas en las condiciones propias en diferentes tramos del ro Nare. Hasta
el momento, no existen estudios que hayan evaluado los posibles impactos del aislamiento
ocasionado por los embalses del oriente antioqueo sobre la estructura poblacional de la
sabaleta presentes en diferentes tramos del ro Nare.
Para la cuenca media del ro Nare podra esperarse que las poblaciones de sabaleta se estn
aislando unas de otras debido a la fragmentacin de hbitat y a barreras fsicas para su
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migracin. Mediante el uso de marcadores moleculares en Brycon henni, con este trabajo se
realizaron estimados de variabilidad y estructura gentica en algunas poblaciones de esta
especie, en la cuenca media de los ros Nare y Guatap.
Las regiones de ADN microsatlite han sido ampliamente usadas para el anlisis de variacin
gentica entre y dentro de poblaciones. Una aplicacin incluye el clculo de distancias
genticas entre individuos, para inferior diferentes niveles de relacin jerrquica, o pueden ser
de ayuda en la estimacin de parentesco, lo cual es una base importante para la evaluacin de
caracteres evolutivos o ecolgicos (Blouin 2003; Jones & Ardren 2003). Por su parte, la
tcnica de Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar (RAPD), es una herramienta til para
determinar la diversidad gentica entre poblaciones (Barman et al. 2002; Barfai et al. 2003).
Esta tcnica consiste en la amplificacin de pequeos fragmentos de ADN por Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR), distribuidos a lo largo del genoma, utilizando un nico
iniciador de secuencia arbitraria (Welsh & McClelland 1990; Williams et al. 1990). Es una
tcnica que se utiliza con mucha frecuencia porque ofrece muchas ventajas: no se necesita
tener un conocimiento previo de las secuencias en el genoma a analizar, el iniciador utilizado
se puede hibridar al azar en cualquier regin del cromosoma, permite asegurar una buena
interpretacin de la diversidad gentica al usar un nmero alto de iniciadores, y permite
obtener un gran nmero de fragmentos con poca cantidad de ADN (Palumbi 1996; Bardakci
2001).
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De acuerdo a los planteamientos descritos, se tom como objetivo principal del presente
estudio la evaluacin de variabilidad y estructura gentica en poblaciones naturales de Brycon
henni (Eigenmann 1913) aisladas por barreras fsicas (embalses y represas del Oriente
Antioqueo) presentes en la cuenca media de los ros Nare y Guatap, Antioquia, con la
utilizacin de marcadores moleculares especficos -regiones de ADN microsatlite - e
inespecficos (Polimorfismos de ADN Amplificados Aleatoriamente RAPD), con el fin de
aportar herramientas y elementos tiles para la toma de decisiones relacionadas con el manejo
de este recurso pesquero endmico.
METODOLOGA
rea de estudio
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bajo nmero de ejemplares presentes en cada uno de ellos. En la Tabla 1 se pueden observar
las estaciones de muestreo y su ubicacin y altura sobre el nivel del mar, as como el nmero
de ejemplares estudiados en cada una de ellas.
Los ejemplares de B. henni se capturaron utilizando diferentes artes de pesca (pesca elctrica,
atarraya, nasa, anzuelo), contando con los respectivos permisos de la autoridad ambiental
local, la Corporacin Autnoma Regional de las Cuencas de los Ros Negro y Nare -
CORNARE. De cada uno de los ejemplares capturados se colect aprox. 1 gr de tejido
muscular, y/o 0.5-1 ml de sangre perifrica, en viales para microcentrfuga (AMERICAN
SCIENTIFIC, USA) de 2.0 ml, los cuales contenan solucin buffer de colecta (0.1 M Tris, 0.1
M EDTA, 0.01 M NaCl y 0.5% p/v SDS). Se refrigeraron a 4C, y se transportaron a los
Laboratorios de Ecologa Aplicada LECA- rea de Fauna Silvestre, Departamento de
Ciencias Forestales, y de Biologa Molecular, Escuela de Bio-Ciencias, de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelln, en donde se almacenaron a -20C antes de someterse a
procesos de extraccin de ADN.
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Extracciones de ADN Genmico
Para la extraccin de ADN a partir de los tejidos de los ejemplares de sabaleta capturados
(sangre y msculo) se utilizaron diferentes mtodos, de acuerdo al tipo de tejido (sangre y
msculo). El objetivo de este tem fue obtener ADN de buena calidad y en alta concentracin,
para lo cual se realizaron modificaciones de varios mtodos de extraccin (Taggart et al. 1992;
Sambrook et al. 1989), as como se evalu el protocolo de precipitacin de ADN con una
solucin concentrada de NaCl, descrito por Lopera-Barrero et al. (2006). La utilizacin de los
dos mtodos de extraccin se debi a la necesidad de trabajar con reactivos de baja
peligrosidad para su manipulacin y descarte.
Protocolo de precipitacin de ADN con una solucin concentrada de NaCl (modificado por
Lopera-Barrero et al. 2008): Se toman aproximadamente 0,3 g. de msculo macerado, y se
adicionan 550 ul de solucin de lisis (50 mM de Tris-HC1, pH 8.0, 50 mM de EDTA, 100
10
mM de NaC1), 1% de SDS y 7 L de 200 gmL-1 de proteinasa K, y las muestras se
incuban a 50C por 12 h. Luego, se adicionan 600 L de NaCl 5M a cada muestra antes de
centrifugar por 10 min a 12000 rpm. El sobrenadante se transfiere, se precipita el ADN con
700 L de etanol absoluto fro y se incuba a -20C por 2 h. Se centrifuga, se lava con 700 L
de etanol 70% y se resuspende en solucin tampn TE 10:1 (10mM de Tris pH 8.0 y 1 mM de
EDTA). SE incuba con 2 ul RNasa a 37C por 30 minutos. Se almacena a 4C.
La cantidad y calidad del ADN extrado se evalu en geles de agarosa (0.8%) teidos con
bromuro de etidio, se verific en transiluminador de luz U.V., y se cuantific con ayuda de un
espectrofotmetro (ThermoScientific, USA), para lo cual la concentracin del ADN genmico
se determin mediante un anlisis de absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.
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volumen final de 25 l por reaccin. Se estandarizaron las concentraciones de ADN, de
cloruro de magnesio y las temperaturas de hibridizacin de los cebadores. Las reacciones de
PCR se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones: temperatura 95C durante 5 minutos,
30 ciclos de un minuto a 95C, un minuto a una temperatura ptima de alineamiento (entre 50-
56C, de acuerdo a la Tm ideal para cada pareja de cebadores usados), y un minuto a 72C.
Finalmente, cinco minutos a 72C. Los productos de amplificacin se almacenaron a -20C
(Barbosa et al. 2006; Carvalho-Costa et al. 2006; Sanches & Galetti 2006).
12
RESEARCH, USA) en microtubos de 200 l, en los cuales se adicion la mezcla de reaccin
que contena para cada tubo, 1 l de ADN molde (60-100 ng), 0.5 U de Taq polimerasa
(FERMENTAS UAB, CANAD), 0.2 mM de una solucin de los cuatro deoxinucletidos
trifosfatados (dNTPs; FERMENTAS UAB, CANAD), 2.0 mM MgCl2 (FERMENTAS UAB,
CANAD), 10 mol de cebador decmero (primer) y 2.5 ul de solucin buffer 10X (200 mM
Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl y 1.5mM MgCl2). El volumen final fue de 25 l por reaccin.
Se estandarizaron las concentraciones de ADN, de cloruro de magnesio y las temperaturas de
hibridizacin de los cebadores. El perfil trmico para las reacciones de PCR incluy
denaturacin inicial a 94C durante 5 minutos, seguida de 40 ciclos de un minuto a 95C,
entre 35-45 segundos a una temperatura ptima de alineamiento (36C), y un minuto a 72C.
Finalmente, un paso de extensin final de dos minutos a 72C, y enfriamiento a 4C durante
30 minutos. Los productos de amplificacin se almacenaron a -20C.
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Anlisis de datos
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matrices de distancias gentica y geogrfica. Esta prueba de Mantel puede mostrar patrones de
aislamiento por distancia (Wright 1943), mediante la medicin de la independencia entre las
distancias genticas y geogrficas, por lo que se plantearon dos hiptesis:
Por otra parte, se llevaron a cabo anlisis de distancia e identidad gentica insesgados, segn
lo descrito por Nei (1978). Todos los anlisis mencionados se realizaron con el programa
GENAlEx (Peakall & Smouse 2006), versin 6.2, (2008), el cual es una aplicacin para el
programa Microsoft Office Excel. Puede descargarse gratuitamente en el sitio URL
http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/ .
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RESULTADOS
Los valores medios de oxgeno disuelto y porcentaje de saturacin en superficie son altos para
la mayora de las estaciones localizadas aguas arriba de los embalses (7.28-8.28 mg/l O2 ; 86-
105.3 % sat.O2), a excepcin de la quebrada San Lorenzo (4.6mg/l O2 ; 58.2% sat. O2). No se
hallaron valores que indicaran condiciones de anoxia en ninguna de las estaciones de
muestreo. Los valores medidos de temperatura y pH del agua son muy similares en todas las
estaciones de muestreo. Sin embargo, los valores ms altos de temperatura se presentaron en
las estaciones ubicadas en el ro Nare, la cual es la estacin ubicada a menor altura sobre el
nivel del mar (694 m.s.n.m). Por ltimo, los valores de conductividad de las aguas tuvieron sus
mximos en las estaciones localizadas aguas abajo de cada una de las cuencas evaluadas (ro
Nare-cuenca ro Nare y quebrada El Cardal- cuenca ro Guatap; 61.1 y 62.7 S/cm,
respectivamente) (Tabla 4).
Extraccin de ADN genmico total: Con los dos mtodos de extraccin evaluados, se
obtuvieron concentraciones similares de ADN. En la figura 2 se puede apreciar una de las
extracciones de ADN obtenida en algunos de los individuos provenientes de los sitios de
muestreo Antes embalse Peol-Guatap y Santa Gertrudis.
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Amplificacin de regiones de ADN
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Para las parejas de cebadores mencionados, las variaciones realizadas incluyeron cambios
sucesivos en las temperaturas de alineamiento de acuerdo a cada pareja de cebadores. Se
comenz con 56C, y se continu con 57, 58, 60, 55, 54, 52 y 50C. Con estas variaciones, no
hubo cambios en los patrones de amplificacin, solo aparecieron amplificados inespecficos y
monomrficos y de bandas mltiples, en lugar de una o dos bandas como es normal en
amplificacin de microsatlites de especies diploides. Sin embargo, el caso ms comn fue la
desaparicin total de seales de amplificacin.
Otra modificacin realizada fue el cambio en las concentraciones de cloruro de magnesio, Taq
polimerasa, y concentraciones de ADN incorporado como molde. Ninguna de estas
modificaciones tuvo efecto, adems se resalta el hecho de que no haba problemas de
contaminacin, puesto que en cada reaccin de amplificacin se inclua una muestra control
(sin ADN). Se corrobor por el corrido electrofortico, puesto que las bandas de control no
reaccionaban a la tincin (EtBr). As mismo, se tomaron muestras aleatoriamente, y se realiz
una evaluacin preliminar de amplificacin y secuenciacin de la regin 16S del ADN
ribosomal, encontrndose que las secuencias amplificadas correspondan a peces y no a
potencial contaminacin de las extracciones de ADN de Brycon henni.
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Amplificacin aleatoria de Polimorfismos de ADN
Entre el total de bandas amplificadas, solo se encontr un alelo privado para los sitios de
muestreo localizados aguas arriba del embalse Peol-Guatap (estacin de muestreo Antes
Peol). As mismo y tambin reseado en la Tabla 7, aparece el nmero de bandas comunes
localmente con una frecuencia menor o igual al 50 %, para cada poblacin. En las figuras 7-9
se pueden observar algunos de los geles de los amplificados obtenidos de secuencias RAPD en
geles de agarosa.
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Distribucin de la variabilidad gentica: Cuando se evaluaron todos los sitios de muestreo de
las cuencas de los ros Nare y Guatap en conjunto, el anlisis de varianza molecular AMOVA
arroj que el 30 % de la variabilidad se atribuy a diferencias entre los sitios de muestreo, y
que el 70 % restante de la variabilidad se deba a diferencias dentro de los sitios de muestreo.
Sin embargo, cuando se realiz un anlisis de varianza molecular solo para los sitios de la
cuenca del ro Nare, se encontr que solo el 16 % de la variabilidad se explicaba por
diferencias entre los sitios de muestreo, y que el resto (84%) de la variabilidad era explicada
por diferencias dentro de sitios.
Test de Mantel: En el presente trabajo, tanto para todas las poblaciones evaluadas en las
cuencas de los ros Nare y Guatap, as como para la cuenca del ro Nare, se hall una
correlacin positiva significativa entre la distancia gentica y la geogrfica (coeficiente de
correlacin Rxy=0.431, p<0.001, ambas cuencas; Rxy=0.377, p<0.001, cuenca del ro Nare).
(Figura 10). Estos resultados sugieren que la especie estudiada presenta aislamiento por
distancia, descrito inicialmente por Wright (1943) (Hartl y Clark 1997; Peakall & Smouse
2006).
21
DISCUSIN
Los valores de polimorfismo gentico hallados en este estudio son similares a los hallados por
otros autores, cuando se han usado esta misma clase de marcadores aleatorios en especies
relacionadas. Wasko et al. (2004) encontraron valores de polimorfismo de 85% en cuatro
poblaciones amaznicas de Brycon cephalus. Lopera-Barrero et al. (2008) evaluaron
diferentes poblaciones de la especie relacionada Brycon orbygnianus en el suroeste del Brasil,
hallando niveles de polimorfismo entre 54-59%. Para otras especies de peces tambin se han
realizado dichas evaluaciones de polimorfismo con esta tcnica. En tilapia niltica
(Oreochromis niloticus) en el Brasil, se han hallado niveles entre 47-80 % de polimorfismo.
La amplitud en los rangos obtenidos en esta especie se relaciona con el hecho de que las
poblaciones con menores valores de variabilidad gentica provienen de criaderos, y debido a
que las tilapias han tenido introducciones en sus linajes en los sitios de cra, ya que es una
especie que se adapta muy bien a los efectos del mejoramiento gentico. En trabajos de ese
tipo, los menores valores de polimorfismo gentico estn directamente relacionados con el
tiempo de introduccin de nuevos linajes (Vieira et al. 2005).
23
Con relacin a los datos obtenidos de estructura gentica con el anlisis de varianza molecular
(AMOVA), se encontr una gran diferenciacin gentica entre las poblaciones muestreadas
(ambas cuencas), de acuerdo al valor de ST obtenido (0,297; g.l.=194; p<0,001).
Adicionalmente, los valores de estructuracin gentica cuando se evaluaron solo las
poblaciones de la cuenca del ro Nare son relativamente altos de ST (0.163; g.l.=133;
p<0.001). Estos datos pueden dar luces de lo que est sucediendo en los ecosistemas de la
regin de los embalses. Inicialmente, se debe tener en cuenta que la sabaleta se afecta por
cambios extremos en las condiciones cualitativas del agua, con respecto al contenido de
oxgeno disuelto, slidos suspendidos, entre otros (Montoya et al. 2006). Dichas condiciones
fsico-qumicas del agua podran afectar las rutas de migracin de esta especie.
Sin embargo, los movimientos de migracin que realiza esta especie son migraciones laterales
cauce principal-quebradas-cauce principal, y movimientos ro arriba. Los movimientos de la
sabaleta entre el cauce principal y tributarios pequeos, pueden considerarse como
movimientos de proteccin, ya que se considera que se desplaza en busca de condiciones
ideales del agua (temperatura, transparencia), y podran considerarse movimientos de
proteccin y no necesariamente de migracin reproductiva (Perdomo 1978). Estas
afirmaciones estn de acuerdo con lo encontrado por Mancera-Rodrguez et al. (2008),
quienes para los peces evaluados en este estudio hallaron tallas ms altas (expresadas como
longitud estndar) en los ros, comparadas a las halladas para las quebradas y afluentes de
caudal ms bajo. Para la cuenca del ro Nare los valores hallados de longitud estndar
estuvieron entre 38.7 y 147.8 mm (quebrada San Lorenzo y ro Nare, respectivamente). Para
la cuenca del ro Guatap dichos valores estuvieron entre 107.2 y 177.8 mm (quebrada El
Cardal y ro Guatap, respectivamente) (Mancera-Rodrguez et al. 2008).
Dentro del contexto anterior, podra esperarse que los desplazamientos de la sabaleta se
realicen solo para buscar mejores condiciones de las caractersticas del agua. Esto ayudara a
explicar la estructura poblacional anteriormente descrita, lo cual tambin tiene sustento en el
24
trabajo realizado por Mancera-Rodrguez et al. (2008), del cual se desprendieron los
muestreos para el presente trabajo. Estos autores evaluaron la presencia de B. henni y de las
especies de peces acompaantes en las quebradas afluentes de los ros Nare y Guatap,
encontrando una gran cantidad de individuos de pequeo tamao en los sitios ms
conservados de las cuencas estudiadas. Las condiciones de dichos sitios no difirieron
significativamente en cuanto a parmetros fsico-qumicos del agua, sin embargo se pudo
apreciar que uno de los sitios con menos capturas de B. henni y de otras especies de peces
estaba localizado a una mayor altitud sobre el nivel del mar (2094 msnm, quebrada La
Compaa, San Vicente).
Los sitios en que se capturaron las mayores cantidades de ejemplares juveniles de sabaleta
eran quebradas correntosas y bien oxigenadas, afluentes de los ros Nare y Guatap. Este
hecho, se suma al problema de contaminacin en algunos cauces de agua muestreados, visible
y perceptible en todas las campaas de muestreo realizadas aunque no evaluada en los anlisis
realizados (slidos suspendidos, coliformes totales y fecales, entre otros). Dichos factores
hacen suponer que la sabaleta tiene varias clases de barreras que evita, por lo que la
conformacin de unidades discretas podra ser una salida para soportar dichas condiciones
adversas. A esto se le puede agregar la presencia de especies exticas y depredadoras de peces
(Micropterus salmoides), las cuales pueden estar obligando a las poblaciones de sabaleta a
replegarse en las quebradas, pudiendo realizar sus migraciones laterales y manteniendo su
acervo gentico como unidades discretas. Esto se apoya en el trabajo de Mancera-Rodrguez et
al. (2008), quienes para el presente proyecto realizaron muestreos de las especies presentes de
pesca acompaante. Sin embargo, las capturas de esta especie en los muestreos de este
depredador extico fueron bajas y no se encontraron en todas las estaciones de muestreo (solo
un ejemplar en cada una de las estaciones Agua arriba Peol-Guatap, quebradas El Nusito y
San Lorenzo). Hacen falta ms datos de la ecologa trfica de la especie bajo estudio y de los
depredadores presentes para afirmar esta hiptesis.
25
Distancias genticas: Es evidente la diferencia existente entre las dos cuencas muestreadas,
con relacin a los valores obtenidos de distancias genticas. Los datos muestran bajos valores
entre las poblaciones de la cuenca del ro Nare (0.054-0.077), as como altos niveles de
distancia gentica en la cuenca del ro Guatap (0.144-0.210). La explicacin al parecer es
sencilla ya que no hay flujo gentico entre ambas cuencas.
Aunque en el presente informe no se estim de forma directa el nmero de migrantes entre las
poblaciones evaluadas debido al carcter dominante del marcador molecular usado, para
obtener el nmero estimado de individuos migrantes (Nm) se puede utilizar la siguiente
1
ecuacin (Wright 1931): Fst . A partir de esta frmula, se puede tomar como
1 4 Nm
anlogo al valor Fst el valor obtenido en los clculos de estructuracin gentica (ST para las
poblaciones de las dos cuencas muestreadas=0.297; ST cuenca del ro Nare=0.163). Al
despejar de la ecuacin el nmero de migrantes, arroj un valor bajo para todas las
poblaciones en las dos cuencas bajo estudio (ros Nare y Guatap, 0.59), as como para el caso
de la cuenca del ro Nare (1), lo cual apoya los resultados obtenidos de estructuracin
gentica, y ayuda a suponer un bajo flujo gentico entre las poblaciones bajo estudio. No
obstante, para confirmar estos clculos es necesario evaluar marcadores codominantes, que
adems puedan hablar de los posibles efectos de la endogamia (microsatlites), as como
posibles problemas tales como cuellos de botella, efecto Wahlund, deriva gentica, entre otros
(Frankham et al. 2002). Adicional a esto, para aportar nuevos datos para una discusin al
respecto, pueden ser tiles mtodos directos de dispersin mediante marca-recaptura, los
cuales pueden proveer elementos para un uso ms adecuado de estimados de estructura
gentica en la bsqueda de indicadores de flujo gentico (Whitlock & McCauley 1999).
El test de Mantel estima la correlacin existente entre dos matrices de distancia, tpicamente
una matriz de distancias genticas y una matriz de distancias geogrficas, con test de
significancia por permutacin. De acuerdo a los resultados obtenidos al correlacionar las
26
matrices triangulares de distancias gentica y geogrfica, la significancia de este test fue alta,
demostrado por la correlacin positiva hallada (coeficiente de correlacin Rxy=0.431,
p<0.001, ambas cuencas; Rxy=0.377, p<0.001, cuenca del ro Nare) (Peakall et al. 2003), lo
cual puede indicar evidencias de procesos de aislamiento por distancia en las poblaciones
evaluadas. En el modelo de aislamiento por distancia de Wright (1943), la poblacin no est
subdividida en subunidades donantes o receptoras de migrantes, ni es una unidad panmctica.
Los cruzamientos al azar estn limitados por la distancia, de modo que los individuos tendrn
una mayor probabilidad de aparearse con vecinos que con individuos ms lejanos. De este
modo se pueden agrupar a los individuos en "vecindarios", reas definidas por "individuos
centrales" cuyos progenitores se pueden tratar como extrados al azar (Wright 1943).
Este aislamiento por distancia asume la discontinuidad en las poblaciones, por diversas causas.
Como un supuesto, entre las causas que pudieran crear tal discontinuidad en las poblaciones
de sabaleta del presente trabajo se podran mencionar barreras geogrficas, barreras biticas,
pendientes muy altas, condiciones fsico-qumicas del agua muy diferentes, temperatura y
altura sobre el nivel del mar, entre otras. Esto puede ser fcil de entender, si se tiene en cuenta
la amplia distribucin de la sabaleta en los andes colombianos -cuencas de los ros Cauca,
Magdalena, San Juan, Dagua, Pata y San Jorge- (Montoya et al. 2006). Al respecto, en los
muestreos realizados en el trabajo de Mancera-Rodrguez et al. (2008), de los cuales se
capturaron los ejemplares evaluados en el presente estudio, el menor nmero de individuos se
colect en las estaciones localizadas en el sitio con mayor gradiente de altitud sobre el nivel
del mar (sitio de muestreo 1, aguas arriba del embalse Peol-Guatap, 2094 m.s.n.m., 19
capturas en dos quebradas muestreadas vs. ro Nare, 694 m.s.n.m., 101 capturas; Tabla 1)
(Mancera-Rodrguez et al. 2008).
La anterior informacin tiene sustento de diversos trabajos con poblaciones naturales de peces
y otros vertebrados. Soto-Marambio (2003), quien evalu parmetros morfomtricos y
genticos en Bufo spinulosus, confirm la diferenciacin entre las poblaciones bajo un modelo
27
de aislamiento por distancia. Este autor evalu las poblaciones de Bufo spinulosus del norte y
centro del Chile, considerando las condiciones desrticas imperantes entre ellas, teniendo en
cuenta datos morfomtricos, genticos y ambientales (Soto-Marambio 2003). En otro trabajo,
Mulvey et al. (2002) realizaron test de Mantel de tres vas usando distancia gentica, distancia
geogrfica y distancia de contaminantes entre pares de sitios. Este test se utiliz para intentar
correlacionar diferencias en contaminacin de sedimentos con PAH (polycyclic aromatic
hydrocarbons; hidrocarburos policclicos aromticos), con la distancia gentica entre las
poblaciones evaluadas del pez Fundulus heteroclitus en diferentes sitios del estuario del ro
Elizabeth (Virginia, USA). El test de mantel indic una correlacin positiva pero no
significativa estadsticamente (r=0.47; =0.05), entre la diferencia en contaminacin de PAH
en sedimentos y la distancia gentica entre poblaciones de nueve sitios evaluados. No
obstante, coeficientes de correlacin muy bajos y no significativos estadsticamente indicaron
que no exista relacin entre la distancia gentica y geogrfica en peces capturados a una
escala geogrfica inferior (Mulvey et al. 2002).
Tambin puede citarse el trabajo de Bay et al. (2008), quienes evaluaron diversidad gentica y
estructura gentica entre regiones y arrecifes en el pez arrecifal Acanthochromis polyacanthus,
el cual tiene amplio rango de distribucin en la Gran Barrera de Coral de Australia. En este
estudio se evaluaron mediante test de Mantel (1000 permutaciones), correlaciones entre
matrices de distancias genticas y geogrficas de pares de poblaciones, utilizando para ello el
programa GenAlEx 6 (Peakall & Smouse 2006). Los resultados de anlisis para el modelo de
aislamiento por distancia (Wright 1943), indicaron que se hall correlacin entre distancias
genticas y geogrficas solo para algunas de las reas muestreadas (ST vs. km: r =0.77; p
=0.001). Sin embargo, esta correlacin permaneci estadsticamente significativa cuando el
nmero de arrecifes muestreados se redujo a seis (dos de cada una de las regiones evaluadas -
norte, centro y sur), para obtener un nmero de comparaciones similar al evaluado dentro de
regiones (ST vs. km: r =0.91; p =0.02). En contraste, las distancias genticas y geogrficas no
se correlacionaron dentro de regiones (P > 0.05 para todos los casos) (Bay et al. 2008).
28
CONCLUSIONES
De acuerdo a los datos arrojados por el presente trabajo, para Brycon henni se obtuvieron
estimados de variabilidad y estructura gentica en los siete sitios de muestreo ubicados en las
cuencas de los ros Nare y Guatap, utilizando la tcnica de amplificacin aleatoria de
polimorfismos de ADN (RAPD).
Al analizar las poblaciones de las cuencas de los ros Nare y Guatap, se hall que las
distancias genticas fueron diferentes cuando se compararon ambas cuencas. Se concluye con
base en el marcador molecular usado (RAPD), que ambas cuencas al parecer no han tenido
mezcla de individuos por barreras geogrficas existentes entre los sitios de muestreo. Esto
permitira realizar recomendaciones de manejo pesquero previas a las potenciales
reintroducciones de sabaleta que se realicen en la zona.
Un hecho que no se debe desconocer es que las barreras ocasionadas por los embalses del
oriente antioqueo, tienen un tiempo de establecimiento relativamente bajo. El embalse Peol-
Guatap se cre a partir de su llenado en 1971, y el embalse San Lorenzo, solo tiene 22 aos
desde su llenado inicial en 1987, as como el embalse Playas (FAO 1992). Por estas razones, y
debido a que los valores encontrados de variabilidad y estructura gentica estn de acuerdo
con trabajos realizados en el mismo gnero de peces y en otras especies de peces y organismos
relacionados evolutivamente, es posible que los fenmenos descritos en el presente trabajo se
deban mayoritariamente a la distribucin original de estos peces en el oriente antioqueo.
29
mejor calidad, los cuales no son necesariamente indicadores de rutas de migracin. Si ese
fuera el caso, probablemente se hubiera encontrado flujo gentico entre algunos de los sitios
de muestreo.
De acuerdo a los resultados obtenidos para los marcadores moleculares usados, al momento de
capturar animales para produccin de alevinos, estos se deberan manejar como lotes
separados y evaluar su variabilidad gentica, antes de liberarlos o mezclar las poblaciones de
los parentales indiscriminadamente. De realizarse reintroducciones de esta especie para esta
zona antioquea, los resultados obtenidos con los marcadores RAPD indican que se deberan
realizar repoblamientos en cada zona aislada con semilla obtenida en la misma zona o de
poblaciones con una constitucin gentica similar, y en algunos casos ms variable que la
poblacin original. Sin embargo, para realizar este tipo de reinserciones se debe contar con
informacin aportada por otros marcadores moleculares, as como por estudios de
comportamiento, marca y recaptura, entre otros.
Con relacin al trabajo con loci microsatlites, pueden plantearse opciones para estudios
posteriores. La falta de amplificaciones exitosas en este trabajo puede ser resultado del
desconocimiento del genoma de esta especie, y es inherente al trabajo con este marcador,
cuando no se tiene conocimiento previo del genoma de la especie y no se cuenta con
cebadores especficos. Una solucin podra ser disear cebadores especficos para Brycon
henni, sin embargo esto conllevara altos costos de tiempo y dinero. Otra opcin puede ser
evaluar regiones del DNA ribosomal, las cuales son regiones altamente conservadas en
vertebrados, las cuales se han utilizado para la reconstruccin de filogenias y la identificacin
de poblaciones en diferentes especies.
Se sugiere evaluar tcnicas que arrojen la mayor cantidad de informacin posible, por lo que
podran evaluarse otros marcadores moleculares que arrojen mayor cantidad de informacin
30
(AFLP, regiones especficas del genoma de vertebrados, etc.), sin necesidad de conocer el
genoma de esta especie.
31
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36
TABLAS
37
Tabla 2. Secuencias cebadoras para ADN microsatlite evaluadas en el presente estudio.
38
Tabla 3. Cebadores oligonucletidos para RAPD evaluados en este estudio
Tabla 4. Valores promedio de los parmetros fsico-quimicos del agua (pH, oxgeno
disuelto, % de saturacin de oxgeno, conductividad y temperatura) tomados en superficie para
las 7 estaciones de muestreo.
39
Tabla 5. Rangos de concentracin obtenidos en las extracciones de ADN de las muestras, a
partir de la absorbancia medida a 260 nm
Tabla 6. Cebadores para RAPD que amplificaron en todas las poblaciones evaluadas.
40
Tabla 7. Variabilidad gentica hallada con los marcadores RAPD utilizados.
Poblacin 1 2 3 4 5 6 7
Antes Peol --- 0,945 0,925 0,948 0,944 0,866 0,811
Santa Gertrudis 0,057 --- 0,963 0,965 0,941 0,881 0,810
El Nusito 0,077 0,038 --- 0,956 0,944 0,920 0,852
San Lorenzo 0,054 0,036 0,045 --- 0,969 0,898 0,853
Ro Nare 0,057 0,061 0,058 0,032 --- 0,901 0,874
Ro Guatap 0,144 0,127 0,083 0,107 0,104 --- 0,911
El Cardal 0,210 0,211 0,161 0,159 0,135 0,093 ---
41
FIGURAS
Figura 1. Ubicacin de las estaciones de muestreo con respecto a Colombia y Antioquia. (E1C: Quebrada La Compaa; E1E: Q.
La Magdalena; E2A: Q. Santa Gertrudis; E3A: Q. El Nucito; E3B/C: Q. San Jos/San Lorenzo; E4A: Ro Nare; E5A: Ro Guatap;
E6A: Q. El Cardal).
42
Figura 2. Gel de agarosa (0.8%) teido con EtBr para verificar calidad de extraccin de ADN
de B. henni. Pozos 1-12: individuos sitio Antes embalse Peol-Guatap; 21-30: individuos
quebrada Santa Gertrudis.
43
Figura 4. Amplificacin inespecfica y monomrfica obtenida con el cebador Bh6. Se
observan bandas con un peso aproximado de 1000 pb (5 veces lo esperado; 1-7 muestras sitio
antes Peol-Guatap; 21-26 muestras Santa Gertrudis; M: marcador de peso molecular 700
pb.)
Figura 5. Primer Pcos17, para el cual slo se pudo hallar una seal de muchas bandas
monomrficas y de un tamao 2-3 veces lo esperado en Characiformes (aproximadamente
1000 pares de bases 1kb).
44
Figura 6. Gel de poliacrilamida 6%, teido con nitrato de plata. Cada columna es un
individuo. Izq., Bh6, muestras 1-21; Der., Bh5, muestras 1-13. M: marcador de peso molecular
700 pb. (en el medio y a la derecha de la imagen)
45
Figura 8. Amplificacin de RAPD con el cebador OPBA10 en las muestras 20-47 (Sta
Gertrudis); 47-57 (El Nusito). Derecha arriba y abajo: M: marcador de peso molecular (100-
3000 pb).
Figura 9. Amplificacin de RAPD con el primer OPAN17 en las muestras 1-19 (Antes Peol)
y 20-38 (Santa Gertrudis). M: Marcador de peso molecular (100-3000 pb), derecha de la
imagen arriba y abajo.
46
Figura 10. Modelo de regresin obtenido a partir del Test de Mantel. GGD: Distancia
geogrfica. GD: Distancia gentica.
Figura 11. Dendrograma Neighbor-Joining de distancias genticas para las poblaciones de las
cuencas de los ros Nare y Guatap.
47
Figura 12. Dendrograma N-J de distancias genticas para las poblaciones del ro Nare.
Figura 13. Anlisis de Coordenadas Principales para todos los individuos y los sitios de
muestreo.
48