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TECHNIQUES:

Principes de la
chromatographie

Dfinition
La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur
les diffrentes affinits dun ou plusieurs composs lgard de deux
phases (stationnaire et mobile).
L'chantillon est entran par la phase mobile au travers de la phase
stationnaire qui a tendance retenir plus ou moins les composs de
l'chantillon l'aide de diffrentes interactions. Lchantillon est adsorb
puis dsorb sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins soluble dans
la phase mobile.

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Types de chromatographies

Type Critre de sparation

Adsorption Polarit

Partage Solubilit

Exclusion Taille des molcules

changeuse dions Charge ionique

Affinit Structure des protines


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Il est rare de pouvoir associer une mthode chromatographique un seul phnomne.

Types de chromatographies

Chromatographie
changeuse dions

Chromatographie
dexclusion

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Chromatographies dadsorption

Phase mobile Nom


Gaz Chromatographie en phase
vapeur (CPV) ou en phase
gazeuse (GC)
Liquide Chromatographie couche mince
(CCM ou TLC) ou clair
Liquide Chromatographie liquide haute
performance (CLHP ou HPLC)

Utilit de la chromatographie
Selon la quantit de produit appliqu en chromatographie, on sen sert pour:

Analyser < 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV

Sparer ou purifier les produits dune raction par chromatographie clair


ou HPLC (50 mg 15 g)

Doser des produits. Lanalyse quantitative se fait avec un talon interne ou


aprs prparation dune courbe de calibration.

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Chromatographie dadsorption: principe

La chromatographie dadsorption est base sur le partage des soluts


entre ladsorbant solide fixe et la phase mobile. Chacun des soluts
est soumis une force de rtention par adsorption et une force
dentranement par la phase mobile. Lquilibre qui en rsulte aboutit
une migration diffrentielle des soluts de lchantillon analyser, ce
qui permet leur sparation.

Les sparation sont bases sur le principe de polarit, cest--dire


lexistence de diples dans une structure molculaire.

Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire):


Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine,
charbon activ.

Adsorbants
Les adsorbants sont sous forme de granules
calibrs. La sparation est meilleure, mais
plus lente si les grains sont fins.

Plus un adsorbant est actif, plus il retient


fortement les composs polaires. La
sparation se fait par ordre croissant de leurs
forces dinteraction avec les composs
polaires.

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Polarit des groupements
fonctionnels neutres
R-H

Le gel de silice est polaire, il R-X


a par consquence une plus
grande affinit pour les

Polarit croissante
R-NO2
composs polaires: O O O
O
R R R OR R R R H
Un compos peu polaire
est peu adsorb. O

R NR2
Un compos polaire est
trs adsorb. R-NH2 R-OH Ar-OH

R OH

Les molcules charges ne migreront habituellement pas sur gel de


silice, elles sont trop polaires. 9

Phase mobile
Hexanes

CCl4
Une phase mobile liquide est appele luant.
Cest elle qui fait migrer les composs, son Benzne, Tolune
Polarit croissante

choix est donc important.


Et2O
Il faut que le solut soit soluble dans lluant.
CH2Cl2
Il est possible de faire des mlanges de
solvants pour changer sa polarit. AcOEt

MeOH, EtOH

AcOH

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Choix de lluant
Deux facteurs interviennent lors de linteraction entre lluant et le solut
(mlange de composs sparer):
la solubilit: on doit tre en mesure de dissoudre le solut dans lluant
pour que la migration se fasse.

la polarit de lluant va dterminer quelle vitesse le compos migre.

Moins un compos est polaire, moins il saccroche ladsorbant, plus il


migre avec lluant. Choix dun luant peu polaire
Plus un compos est polaire, plus il saccroche ladsorbant, moins il
migre avec lluant. Choix dun luant polaire

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Chromatographie sur couche mince


Ladsorbant (silice, 250 m dpaisseur) est fix sur une plaque (Al, verre)
commercialement disponible.

Le produit/mlange de produits est dpos sur la plaque laide dun


capillaire.

Les produits sont rvls aprs lution.

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Prparation dun capillaire
Au laboratoire, les capillaires sont prpars au dpart de pipettes Pasteur:
Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme dune torche au
propane en tournant le tube jusqu ce quil soit mou.
Retirer de la flamme et tirer la pipette.
Laisser refroidir et couper la partie fine du milieu.

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Utilit des CCM

1. CCM analytiques (250 m, 2.5 x 7.5 cm)

Vrifier la puret dun produit, quelques microgrammes suffisent


Suivre lavancement dune raction
Vrifier lefficacit dune extraction liquide-liquide
Dterminer lluant pour la chromatographie clair sur gel de silice

2. CCM prparatives (1000 m, 20 x 20 cm)

Purification de petites quantits de produit (jusqu ~100 mg sur une


plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifi est
gratte, puis la silice est extraite avec un solvant.

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Prparation de la CCM

1. On trace un trait ~1 cm du bord infrieur de la plaque.


On marque les futur dpts, espacs denviron 0.5 cm.
On identifie chaque produit quon fera luer.
A B C

2. Le produit/mlange doit toujours tre dilu dans


un solvant (Et2O, CH2Cl2, AcOEt) assez volatil.

Dans un vial, dposer 1 goutte ou 2-3 cristaux de


produit + ~0.5 mL solvant.
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lution de la CCM

3. On utilise un capillaire pour dposer le produit sur la


plaque puis on laisse vaporer le solvant. On peut spotter
2-3 fois si lchantillon est trs dilu.

4. lution: prparer une cuve dlution avec


Bcher de 250 mL avec un papier absorbant lintrieur
Verre de montre
Y verser 10 mL dluant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt)
Placer la CCM dans la cuve en veillant ce que la ligne
soit au-dessus du liquide.
Faire luer jusqu ~5 mm du bord et tracer un trait pour
marquer le front de solvant.
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Rvlation de la CCM

lil nu: si le produit est color

la lampe UV: les molcules qui absorbent les UV 254 nm seront


visibles (noyaux aromatiques par exemple).

Avec un rvlateur chimique: liode est le premier rvlateur tester,


car il est non destructif. Il permet de rvler des doubles liaisons et les
halognures. Liode est vapor chaud ou dans la hotte.
De nombreux autres existent: KMnO4, acide phosphomolybdique,
vanilline, ninhydrine

UV KMnO4 17

Mesure du Rf

Le Rf (rapport frontal ou rtention frontale) est caractristique dun produit


dans un luant donn et pour une phase stationnaire donne.

Produit moins polaire, moins accroch


L
l1
l2 Produit plus polaire, plus accroch

Hauteur de migration
Rf valeur entre 0 et 1
Hauteur du front de solvant

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Influence de lluant

Lorsque la polarit du solvant augmente, le Rf augmente. Le Rf


augmente, puis diminue.
Pour faire une sparation de deux produits par chromatographie, on
cherche un luant qui donne le plus grand Rf possible, avec un Rf pour
le produit le moins polaire autour de 0,3.

100% Hexane 95% Hexane 90% Hexane 80% Hexane 70% Hexane
5% A cOEt 10% AcOEt 20% AcOEt 30% AcOEt

Polarit de lluant
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CCM bidirectionnelles

Cest une exprience qui permet de prouver si un produit dcompose sur


la silice, ou si un spot de la CCM contient en fait deux produits.

Si lu dans un autre solvant

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