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CORPORACIN UNIVERSITARIA LASALLISTA

INSTITUCIN CORPORACIN UNIVERSITARIA LASALLISTA


UNIDAD CENTRO DE LABORATORIOS
LABORATORIO Qumica
ASIGNATURA Bioqumica de los Alimentos
PROGRAMA Ingeniera de Alimentos
NOMBRE DE LA Anlisis de protenas por mtodo
PRCTICA colorimtrico
CDIGO DE LA P RCTICA

INVESTIGACIN PREVIA

En esta prctica, el estudiante del curso de bioqumica de los alimentos, deber aplicar los
conocimientos tericos adquiridos en clase para explicar un fenmeno ocurrido en una situacin
real. Para esto, el estudiante deber seleccionar una matriz alimentaria y plantear una hiptesis
relacionada con el contenido de protena de este alimento y que pueda ser comprobada en el
laboratorio mediante la utilizacin del mtodo de Biuret.

1. Consultar el principio de funcionamiento, ventajas, desventajas, de los siguientes


mtodos para anlisis de protenas:

Mtodo de kjeldahl
Mtodo de biuret
Mtodo de lowry
Mtodo del cido bicinconnico (BCA)
Mtodo de absorcin UV a 280nm
Mtodo de adhesin de colorante
Mtodo de bradford
Mtodo de la ninhidrina
Mtodo turbidimtrico

FUNDAMENTOS TERICOS

Las protenas son molculas de alto peso molecular, que contienen carbono, hidrgeno, oxgeno
y con frecuencia, azufre. Las unidades fundamentales de las protenas son los aminocidos,
compuestos orgnicos que contienen grupos amino y carboxilo y que por lo tanto, tienen
propiedades anfotricas; los aminocidos se unen por enlaces peptdicos para formar dipptidos,
oligopptidos y polipptidos. Se considera que las protenas estn formadas por polipptidos que
adquieren diferentes configuraciones espaciales. Las propiedades fisicoqumicas de las
protenas estn determinadas por la secuencia de aminocidos (estructura primaria), su
configuracin espacial, las fuerzas interinicas, puentes de hidrgeno (estructuras secundaria y
terciaria).
Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las
protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no
establecen fuertes interacciones intermoleculares, como si lo hacen las protenas fibrosas. De tal
manera que las protenas globulares son solubilizadas generalmente en forma de suspensiones
coloidales.

En general, existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos


mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b)
la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos
colorantes. Especficamente, el mtodo de Biuret es uno de los mtodos ms utilizados debido a
su simplicidad. Se basa en la formacin de un complejo coloreado en medio bsico entre el Cu 2+
y los grupos NH de los enlaces peptdicos. 1Cu 2+ se acompleja con 4 NH (Figura 1). La
intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. Sin
embargo, la sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de
protenas en preparados muy concentrados.

Figura 1. Principio de funcionamiento del mtodo de Biuret para determinacin de protenas.


El cobre (Cu2+) se une a los grupos NH de los enlaces peptdicos, formando un complejo de color violeta

La cantidad de complejo Cu-Protena puede ser determinado mediante espectrofotometra. De


manera general y como se muestra en la Figura 2, la luz blanca se puede dividir en cada uno de
los colores (longitudes de onda) que la componen, de tal manera que al interactuar con la
protena (especficamente complejo Cu-Protena), algunas de esas longitudes de onda sern
absorbidas por la muestra y otras se transmitirn fuera de ella.

Figura 2. Representacin esquemtica de la interaccin de la luz (longitudes de onda) con una


protena.
Como se puede apreciar en el esquema de la Figura 2, la muestra recibe todas las longitudes de
onda visibles (400 700 nm), pero deja pasar solamente las longitudes de onda
correspondientes al violeta, el naranja y el rojo; de tal manera que la longitud de onda
correspondiente al color verde y parte del amarillo (500-600) fueron absorbidas por la muestra.

Especficamente, el complejo Cu-Protena formado en el ensayo de Biuret, absorbe la luz a una


longitud de onda de 540 nm y la intensidad de esa absorcin (que se mide como absorbancia) es
directamente proporcional a la cantidad de complejo Cu-Protena (Figura 3).

Figura 3. Curva de calibracin. Relacin lineal entre concentracin y absorbancia

En general, en el caso de anlisis de protenas, se acostumbra preparar una curva de calibracin


con un estndar, es decir, una protena de concentracin conocida (generalmente albmina), la
cual se hace reaccionar con el reactivo de Biuret y se determina su absorbancia, construyendo
una grfica (curva de calibracin) como la que se muestra en la Figura 3, sobre la cual es posible
interpolar algn valor de absorbancia y relacionarlo con un valor de concentracin, siendo el
principio para el anlisis de protenas (comparacin de la muestra con un estndar mediante una
curva de calibracin)

OBJETIVOS

Determinar el contenido total de protena en una muestra de alimento utilizando el


mtodo espectrofotomtrico de Biuret.

PALABRAS CLAVES

Protenas, espectrofotometra, mtodo de Biuret

EQUPOS E INTRUMENTRAL

EQUIPO CAPACIDAD CANTIDAD


Micropipeta 20-200 1
Micropipeta 100-1000 1
Micropipeta multicanal 30-300 1
Plato 96 pozos 1
Tubos de reaccin 1.5 mL 5 (por grupo)
Agitador mecnico - 1
Sonicador - 1
Microcentrfuga 10.000 rpm 1
Mortero -- 1
Tabla para picar y cuchillo -- 1 (por grupo)
Espectrofotmetro Lector de platos 1
REACTIVOS Y MUESTRAS

SUSTANCIA CONCENTRACIN CANTIDAD


Estndar de albmina 40 mg/mL 5 mL
Reactivo de Biuret (Disolver 0.19 g de CuSO4.5H2O y 0.34 g de Na2EDTA en -- 50 mL
35 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitacion
constante 10 ml de solucin fresca de NaOH 5 M. Aforar a 50 ml con agua
destilada)
Solucin salina (NaCl 2.12 g / 250 mL) 0.85 % p/v 250 mL

PRECAUCIONES O RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD

Reciba las recomendaciones acerca del manejo del espectrofotmetro y las micropipetas
Consulte la ficha de seguridad de cada reactivo
Utilice los implementos de seguridad de acuerdo con el perfil de riesgo de cada muestra

PROCEDIMIENTO

ETAPA 1 Explicacin general del procedimiento del laboratorio (15 minutos)

ETAPA 2 Preparacin de la muestra (Trabajo preliminar, consulte el procedimiento ms


adecuado dependiendo su muestra)

Para muestras slidas: tome una cantidad suficiente de muestra, disulvala en


solucin salina, de tal manera que se asegure una concentracin de protena alrededor
de 150 mg/mL, de acuerdo con el valor que se espera. Proceda a macerar la muestra y
posteriormente somtala a sonicacin en 3 ciclos de 30 segundos cada uno, para
asegurar el rompimiento de las clulas y la liberacin de las protenas. Transfiera 1 mL
del homogenizado a un tubo de reaccin y centrifugue a 10.000 rpm durante 10 minutos.

Para muestras lquidas: centrifugue 1 mL de la muestra a 10.000 rpm durante 10


minutos para garantizar la separacin de cualquier material particulado.

ETAPA 3 Anlisis de protenas

1. Prepare una dilucin de la muestra obtenida en el punto anterior tomando 100 l del
sobrenadante y mezclndolos con 900 l de solucin salina.
2. Prepare la curva de calibracin a partir de la solucin de albmina (40 mg/mL), tomando
en cada tubo de reaccin 0, 25, 125, 250, 500 y 1000 l y diluyndolos con solucin
salina hasta 1 mL, obteniendo as concentraciones de 0 (blanco), 1, 5, 10, 20 y 40
mg/mL.
3. Dispense 270 l de reactivo de Biuret en todos los pozos del plato que se vayan a
utilizar.
4. Tome 30 l, ya sea de la muestra diluida o de cada una de las concentraciones de
albmina y dispnselos en el pozo indicado.
5. Mantenga el plato en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras
se desarrolla el color del complejo Cu-Protena.
6. Lea a 540 nm
Siga este esquema para la correcta ubicacin de las muestras y el estndar en el plato.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Blanco Blanco Blanco M3 M3 M3 M11 M11 M11 M19 M19 M19

B STD1 STD1 STD1 M4 M4 M4 M12 M12 M12 M20 M20 M20

C STD5 STD5 STD5 M5 M5 M5 M13 M13 M13 M21 M21 M21

D STD10 STD10 STD10 M6 M6 M6 M14 M14 M14 M22 M22 M22

E STD20 STD20 STD20 M7 M7 M7 M15 M15 M15 M23 M23 M23

F STD40 STD40 STD40 M8 M8 M8 M16 M16 M16 M24 M24 M24

G M1 M1 M1 M9 M9 M9 M17 M17 M17 M25 M25 M25

H M2 M2 M2 M10 M10 M10 M18 M18 M18 M26 M26 M26

STD: Estndar, M: Muestra

APLICACIONES

Consulte acerca del contenido de protenas de los alimentos ms comunes de la dieta tpica de
varias regiones colombianas.

ELABOR

Julin Londoo Londoo, QF, PhD. Docente Programa de Ingeniera de Alimentos, Corporacin
Universitaria Lasallista.

BIBLIOGRAFIA

Bernal de Ramrez,I. 1993. Anlisis de alimentos, Academia Colombiana de ciencias exactas,


fsicas y naturales Coleccin Julio Carrizosa Valenzuela, No 2. Bogot.

Copeland RA (2000) Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols, 2nd
edn. New York: Chapman and Hall.

Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett
Publishers. U.S.A. pp 209-212.

REGISTRO DE RESULTADOS Y PREINFORME

Tome los datos de absorbancia vs concentracin del estndar de albmina y grafique la


curva de calibracin.
Utilizando la ecuacin de la recta, interpole el valor de concentracin de su muestra.
Concluya con respecto a la hiptesis planteada al iniciar el experimento.