UNIVERSIDAD

NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

BRUCELOSIS
BOVINA

FACULTAD DE INGENIERA ZOOTECNIA

 DEDICATORIA

Queremos dedicar esta monografa en

primer lugar a nuestro DIOS por
permitirnos hacer este trabajo y por la
sabidura e inteligencia que nos dan da a
da y darnos lo necesario para seguir
adelante da a da para lograr nuestros
objetivos.

A nuestros padres por darnos la

oportunidad y el apoyo de salir adelante.
Y finalmente a nuestro docente del curso:
M.V. Sc. Vsquez Snchez Edgar con
mucho respeto, un agradecimiento por
ser un gua en nuestro aprendizaje e
inculcarnos nuevos conocimientos.

1
 RESUMEN
La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos
frecuentemente por B. melitensis y en ocasiones por B. suis. La infeccin est
muy extendida por el mundo, aunque algunos pases del norte y del centro de
Europa, as como Canad, Japn, Australia y Nueva Zelanda se consideran
libres de este agente etiolgico.
La enfermedad se caracteriza clnicamente por uno o ms de los siguientes
signos: aborto, retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, en ocasiones muy
infrecuentes, artritis, con excrecin de los microorganismos en las secreciones
uterinas y en la leche. El diagnstico se basa en el aislamiento de Brucella a
partir de los abortos, de las secreciones de la ubre y de los tejidos tomados en
el examen postmortem. Se puede realizar un diagnstico preliminar
determinando la respuesta especfica celular o humoral frente a los antgenos de
Brucella.
Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patgenos para el hombre y,
por lo tanto, todos los tejidos infectados, como los cultivos y el material
potencialmente contaminado, deben manipularse en condiciones apropiadas de
contencin.
Identificacin del agente: La evidencia preliminar de Brucella la proporciona la
observacin de la morfologa de Brucella mediante la tincin de microorganismos
cido alcohol resistentes en material abortado o secrecin vaginal, sobre todo si
est respaldada por pruebas serolgicas. La reaccin en cadena de la
polimerasa constituye otro medio de deteccin.
Cuando sea posible, se debe aislar Brucella spp. en medios normales o
selectivos cultivando secreciones uterinas, los fetos abortados, las secreciones
de las ubres o los tejidos escogidos, como ganglios linfticos u rganos
reproductores masculinos o femeninos.
Las especies y biovariedades deben identificarse mediante fagolisis y segn
criterios de cultivo, bioqumicos y serolgicos. La reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) puede constituir un mtodo tanto complementario como de
biotipificacin basado en secuencias especficas del genoma.
Pruebas serolgicas y de alergias cutneas: Las pruebas con el antgeno
tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala y la prueba de
aglutinacin tamponada en placa, as como la fijacin del complemento, el
enzimoinmunoanlisis (ELISA) o el ensayo de polarizacin de la fluorescencia,
son pruebas adecuadas tanto para analizar rebaos como animales individuales.
Sin embargo, ninguna prueba serolgica es adecuada por s misma para todas
y cada una de las situaciones epidemiolgicas. Por tanto, la reactividad de las
muestras que son positivas en las pruebas de anlisis debe evaluarse utilizando
una estrategia confirmativa y/o complementaria establecida.
2
La prueba de ELISA indirecto o la del anillo de leche, realizadas con muestras
de leche de tanque colectivo, son eficaces para analizar y controlar la brucelosis
en las vacas lecheras, pero la prueba del anillo de leche es menos fiable en los
grandes rebaos.
Otra prueba inmunolgica es la prueba cutnea de la brucelina, que puede
utilizarse como prueba de deteccin o confirmativa en los rebaos cuando
aparecen casos serolgicamente positivos en ausencia de factores evidentes de
riesgo en rebaos no vacunados.
Requisitos para las vacunas y el material biolgico de diagnstico: La cepa
19 de Brucella abortus contina siendo la vacuna de referencia con la que se
comparan otras vacunas. Debe prepararse a partir de cultivos de inculo de EE.
UU. con virulencia e inmunogenicidad residual suficientes para proteger a los
ratones frente a la exposicin a una cepa virulenta de B. abortus. Adems, cada
lote debe cumplir las exigencias mnimas de viabilidad, fase lisa y UFC (unidades
formadoras de colonias) designadas por dosis.
La vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus se produjo a partir de una cepa
mutante rugosa de laboratorio, derivada de la cepa lisa 2308 de B. abortus. Se
ha convertido en la vacuna oficial para la prevencin de la brucelosis en el
ganado bovino en ciertos pases.
Las preparaciones de brucelina para la prueba intradrmica deben estar libres
de lipopolisacrido liso y no deben producir reacciones inflamatorias
inespecficas ni interferir con pruebas serolgicas. Los antgenos para el
diagnstico deben prepararse a partir de cepas lisas de B. abortus, las cepas
1119-3 o 99, y bien cumplir un estndar mnimo de pureza, sensibilidad y
especificidad. (1)

3
 INDICE

DEDICATORIA........01

RESUMEN.02

NDICE...04

INTRODUCCIN.....05

CAPTULO I: INTRODUCCIN A LA BRUCELOSIS BOVINA

1. DEFINICIN.07
2. ETIOLOGA...08
3. EPIDEMIOLOGA.09
4. PATOGENIA.11
CAPTULO II: DIAGNSTICO DE LA BRUCELOSIS
1. DIAGNSTICO BACTERIOLGICO...12
2. PRUEBAS SEROLGICAS...14
3. OTRAS PRUEBAS..33
CAPTULO III: INMUNIDAD Y VACUNACIN
1. INMUNIDAD..40
2. VACUNAS.41
3. PROBLEMTICA DETECTADA EN LOS PROGRAMAS DE
VACUNACIN PARA LA PREVENCIN Y ERRADICACIN DE LA
BRUCELOSIS BOVINA......44
CAPTULO IV: CONTROL Y ERRADICACIN DE LA BRUCELOSIS BOVINA
1. PRINCIPALES MEDIDAS DE CONTROL DE BRUCELOSIS A NIVEL
INTERNACIONAL....48
2. PRINCIPALES MEDIDAS DE CONTROL DE BRUCELOSIS A NIVEL
NACIONAL....51
3. LEGISLACIN SOBRE BRUCELOSIS BOVINA...51
4. POSIBLES ESTRATEGIAS DE CONTROL Y ERRADICACIN DE
BRUCELOSIS BOVINA EN EL PER..53
CONCLUSIONES....57
ANEXOS...58
BIBLIOGRAFA...63

4
 INTRODUCCIN
En el ganado bovino, la brucelosis suele estar causada por biovariedades de
Brucella abortus. En algunos pases, en concreto en el sur de Europa y en el
oeste de Asia, donde el ganado bovino se cra junto a ovejas o cabras, la
infeccin tambin puede estar causada por B. melitensis. En ocasiones, B. suis
puede causar una infeccin crnica de la glndula mamaria en el ganado bovino,
pero no se ha descrito que origine abortos ni se transmita a otros animales. En
las hembras no gestantes la enfermedad suele ser asintomtica. Despus de la
infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas gestantes
desarrollan una placentitis que, por lo general, provoca el aborto entre el quinto
y el noveno mes de gestacin. Incluso en ausencia de aborto se produce una
gran excrecin de microorganismos a travs de la placenta, los lquidos fetales
y las secreciones vaginales. Las glndulas mamarias y los ganglios linfticos
regionales tambin pueden infectarse y pueden aparecer microorganismos en la
leche. Las gestaciones posteriores llegan, por lo general, a trmino, pero la
infeccin uterina y la mamaria se repiten con un nmero reducido de
microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones
agudas, el microorganismo est presente en la mayora de los ganglios linfticos.
Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar la
esterilidad en ambos sexos. Los higromas, normalmente en articulaciones de las
extremidades, son un signo frecuente de brucelosis en algunos pases tropicales
y podran ser el nico indicio obvio de infeccin; el lquido del higroma suele
infectarse con Brucella.
La brucelosis se ha descrito tambin en el camello de una joroba (Camelus
dromedarius) y en el de dos jorobas (C. bactrianus), as como en los siguientes
camlidos de Sudamrica: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el
guanaco (Lama guinicoe) y la vicua (Vicugne vicugne) como consecuencia de
contactos con rumiantes grandes y pequeos infectados con B. abortus o B.
melitensis. Adems, se ha observado en el bfalo domstico (Bubalus bubalus),
el bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), el yak (Bos
grunniens), el alce o wapiti (Cervus elaphus), as como en el bfalo africano
(Syncerus caffer) y en varias especies de antlopes africanos. Los signos clnicos
de la brucelosis en estos animales son similares a los del ganado bovino.
En el manual de bioseguridad para los laboratorios elaborado por la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS) se clasifica a los microorganismos del
gnero Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite fcilmente
al hombre y causa una enfermedad febril aguda, la fiebre ondulante, que puede
convertirse en una forma ms crnica y producir complicaciones graves que
afectan al sistema musculoesqueltico y cardiovascular, y al sistema nervioso
central. Deben tomarse precauciones para prevenir la infeccin humana. A
menudo la infeccin se debe a una exposicin profesional y se contrae por va
oral, respiratoria o conjuntival, pero el riesgo mayor para la poblacin general es
la ingestin de productos lcteos contaminados en las zonas en las que la
enfermedad es endmica.

5
Los veterinarios y los ganaderos que manejan animales infectados, fetos
abortados o placentas, estn expuestos a este riesgo laboral. La brucelosis es
una de las enfermedades que con mayor facilidad se contraen en el laboratorio,
y se deben observar precauciones de seguridad muy estrictas al manipular
cultivos y muestras intensamente infectadas, como lo son los productos del
aborto.
La manipulacin de los cultivos vivos o del material animal contaminado en el
laboratorio es peligrosa y debe realizarse en un nivel de contencin 3 o superior.
Es esencial que se utilice un nivel de contencin 3 en los lugares en los que se
realicen cultivos de Brucella a gran escala (por ejemplo, para la produccin de
antgeno o de vacunas).
La evidencia gentica e inmunolgica indica que todos los miembros del gnero
Brucella estn estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta
que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto a la
preferencia por el hospedador y a la epidemiologa, as como evidencias
moleculares de variaciones genmicas, el Comit Internacional de Sistemtica
de Procariotas, Subcomit de Taxonoma de Brucella, adopt en 2005 una
decisin firme sobre la vuelta a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a
la taxonoma de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la
reaprobacin de las seis especies tipo de Brucella con sus biovariedades
reconocidas.
Los nombres clsicos relacionadas con las seis especies tipo de Brucella estn
publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las
cepas tpicas designadas aparecen asociadas a esos nombres vlidos
publicados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B.
canis. Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus caractersticas
de cultivo y serolgicas.
En la ltima dcada se han aislado cepas de Brucella de mamferos marinos que
no pueden adscribirse a ninguna de las anteriores especies reconocidas. Hay
estudios en curso destinados a establecer su posicin correcta en la taxonoma
de ese gnero y se ha propuesto que podran clasificarse en dos nuevas
especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa,
denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) en
Europa Central. Por ltimo, Brucella muestra una estrecha relacin gentica con
patgenos y simbiontes de plantas de los gneros Agrobacterium y Rhizobium,
as como con patgenos animales (Bartonella) y con bacterias oportunistas o del
suelo (Ochrobactrum). (1)

6
 CAPTULO I: INTRODUCCIN A LA BRUCELOSIS
BOVINA

1. DEFINICIN:
La Brucelosis bovina es causada por una bacteria denominada Brucella
abortus y en la gran mayora de los casos puede aparecer por primera vez
en un establecimiento, luego de la introduccin de animales infectados.
La Brucelosis es una zoonosis, donde el ser humano puede infectarse tanto
de forma directa por contacto y/o manipulacin de animales infectados, as
como de forma indirecta por ingestin de productos contaminados
principalmente la leche y derivados lcteos elaborados con leche sin
pasteurizar. (4)
La brucelosis es una enfermedad de animales sexualmente maduros. Los
animales jvenes son muy poco susceptibles y es muy raro observarla por
debajo de los seis meses de edad. Si bien estos animales pueden infectarse
por el calostro y por la leche, la infeccin se acantona en los ganglios y se
elimina espontneamente, en la mayora de los casos.
Normalmente la enfermedad es asintomtica en hembras no gestantes.
Despus de la infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras
adultas en gestacin desarrollan una placentitis que conduce al aborto entre
el quinto y el noveno mes de gestacin. En ausencia de aborto se produce
gran excrecin de microorganismos a travs de la placenta, los lquidos
fetales y las descargas vaginales. (3)
La principal fuente de infeccin son las secreciones vaginales, desde
aproximadamente 15 das antes del aborto o parto hasta 4 semanas
posteriores al mismo. Los animales infectados excretan miles de millones de
bacterias que contaminan el medio ambiente y facilitan la diseminacin de la
enfermedad.
Una de las vas ms sutiles y peligrosas para la transmisin y mantenimiento
de la Brucelosis, lo constituye el fenmeno de latencia. La latencia es la
existencia de hembras nacidas de madres infectadas que se infectaron in
tero o a travs de consumir leche infectada durante el perodo de lactancia.
Estos animales no muestran ninguna sintomatologa hasta que son
vaquillonas y llega el momento del aborto o primer parto. (4)

7
2. ETIOLOGA

El gnero Brucella est constituido por bacilos Gram negativos pequeos,

inmviles y aerobios estrictos, de crecimiento lento que no poseen cpsulas
ni forman esporas. A diferencia de muchas otras bacterias, su genoma est
constituido por dos cromosomas circulares y carece de plsmidos. Tienen un
metabolismo oxidativo, basado en la utilizacin de nitratos como aceptores
de electrones. Son catalasa y oxidasa positivos, no atacan la gelatina ni
modifican la leche y en general no fermentan los azcares.
El gnero Brucella incluye siete especies diferentes:
- Brucella melitensis (infectan cabras, bovinos, caninos y al hombre),
- B. abortus (infecta bovinos, caninos y al hombre),
- B. suis (infectan cerdos, caninos y al hombre),
- B. canis (infecta a caninos y al hombre),
- B. ovis (infectan ovinos),
- B. neotomae (infecta roedores) y
- B. maris (infecta mamferos marinos). (5-6)
En base al aspecto de las colonias obtenidas en medio slido, las diferentes
especies de Brucella se clasifican habitualmente como lisas o rugosas.
- Dentro de las primeras se encuentran B. abortus, B. melitensis, B. suis y
B. neotomae y dentro de las segundas B. ovis y B. canis. El aspecto que
adquieren las colonias se debe a la expresin del lipopolisacrido LPS en
la superficie bacteriana, LPS-S en las lisas y LPS-R en las rugosas,
aunque durante su crecimiento en los medios de cultivo pueden
experimentar mutaciones que afectan la expresin del LPS.
- Las cepas de Brucella en fase lisa son las ms virulentas y su
ultraestructura es semejante a la de algunas enterobacterias (Yersinia
enterocoltica, Salmonella Iandau, Pseudomona maltophilia, Escherichia
coli), aunque presenta ciertas diferencias en las caractersticas de su
membrana externa. (5)

8
3. EPIDEMIOLOGA
La fuente principal de la infeccin bovina son los fetos, las envolturas fetales
y las descargas vaginales que contienen gran nmero de brucelas. En menor
grado, pueden contribuir a la contaminacin del campo las materias fecales
de terneros que se alimentan de leche contaminada, ya que no todas las
brucelas se destruyen en el tracto digestivo.
La va de invasin de brucelosis en el bovino es generalmente por el tracto
gastrointestinal causada por la ingestin de pastos, forrajes, y agua
contaminados por brucelas. Adems, las vacas tienen la costumbre de lamer
membranas fetales, fetos y terneros recin nacidos, que contienen todos ellos
gran nmero de brucelas y constituyen una fuente de infeccin muy
importante. El hbito de las vacas es lamer los rganos genitales de otras
vacas contribuye tambin a la transmisin de la infeccin. (2)
La conjuntiva, la va aergena y la cutnea pueden jugar tambin un papel
como va de recepcin de la infeccin. Actualmente no se acepta la va
venrea como de importancia en la transmisin de la enfermedad; s, la
introduccin de semen infectado en el proceso de inseminacin artificial.
La leche constituira una forma natural de excrecin de organismos en las
vacas infectadas, y de gran importancia en la transmisin.
La presencia de abortos, cuando ste se produce en lecheras, corrales o
cualquier otro sitio que implique concentracin de animales, significa sin lugar
a duda el principal factor para la diseminacin de la enfermedad. El producto
de aborto no slo infecta piso, alimento y agua, sino que los animales
mantenidos en el lugar donde se produjo el aborto acostumbran a lamer este
producto, adquiriendo as la infeccin.
Factores inherentes al microorganismo han sido considerados como de
relativa importancia en la presentacin de brucelosis. La distribucin de
biotipos podra tener alguna importancia para conocer el origen de algunas
infecciones.
El diferente grado de virulencia de algunas cepas, ha sido comprobado
cuando stos actan naturalmente. Se ha tratado de encontrar mtodos para
conocer estas caractersticas con varios recursos de laboratorio, o trabajos
en animales de experimentacin sin resultados confiables.
El clima, la ubicacin geogrfica y los sistemas de alimentacin, al parecer
no participan como tales, en la mayor o menor frecuencia de presentacin,
de la brucelosis. Encontramos la enfermedad en altas y bajas incidencias,
tanto en las reas ms fras de los continentes (Norte de Rusia), como en
climas tropicales y subtropicales (Florida, USA).

9
La cantidad de agua cada tendra alguna importancia en el drenaje y lavado
de los terrenos contaminados.
Un factor de importancia en la transmisin de la infeccin, lo constituye la
resistencia de Brucella a los factores del medio. Aunque sensible a los rayos
directos del sol, las Brucellas permanecen viables largo tiempo en pastos y
excretas contaminadas, siempre que exista un adecuado grado de humedad.
La resistencia es mayor cuando estn recubiertas por abundante material
orgnico. Hay autores que han encontrado Brucellas viables luego de 100
das, en el estircol y cama de lecheras contaminadas. (8)
La brucelosis suele aparecer por primera vez en un rebao tras la compra de
animales infectados. Es muy importante retener que solamente cuando los
animales excretan la bacteria por la leche (los ganglios supra mamarios
constituyen uno de los rganos de localizacin preferente) o a travs de los
exudados vaginales tras el aborto o parto (o el semen en caso de machos),
son peligrosos para el resto de animales y para el hombre. Por tanto, un
animal infectado que no excreta la bacteria difcilmente intervendr en el ciclo
epidemiolgico.
Aunque la luz solar directa las destruye en pocas horas, en determinadas
condiciones de humedad y temperatura puede sobrevivir durante varios
meses (por ejemplo, en el estircol fluido), lo que dificulta todava ms el
control de la infeccin.
Otras especies animales que pueden convivir con ellos, tales como perros,
gatos y roedores, tambin son susceptibles de padecer la infeccin, aunque
no existen evidencias de que ello sea muy relevante desde el punto de vista
epidemiolgico.
Sin embargo, un problema bien distinto lo constituye la fauna silvestre
(jabales, venados y liebres, sobre todo), que pueden padecer la enfermedad
y mantenerla a travs de un ciclo silvestre especfico (particularmente B.
suis), constituyendo un reservorio y un riesgo de transmisin potencial tanto
para el hombre como los rumiantes domsticos. Salvo en el caso del ganado
porcino en el que el jabal se ha mostrado como un agente transmisor de B.
suis muy importante, la importancia del posible papel transmisor de B. abortus
y B. melitensis desde la fauna silvestre a los rumiantes domsticos es
totalmente desconocida. (7)

10
4. PATOGENIA
Las especies de Brucella son patgenas intracelulares facultativas, propiedad
que las mantiene protegidas de la accin de los antibiticos, y de los
mecanismos efectores dependientes de anticuerpos; esto justifica la
naturaleza crnica de la infeccin ya que son capaces de adherirse, penetrar
y multiplicarse en una gran variedad de clulas eucariotas tanto fagocticas
como no fagocticas.
Cuando estas bacterias ingresan al organismo pueden ser fagocitadas por
los polimorfonucleares (PMN) y macrfagos como parte de la inmunidad
innata. Si no son eliminadas llegan por va linftica a los ganglios regionales
correspondientes pudiendo desde all invadir el torrente sanguneo, donde
son fagocitadas por los PMN y macrfagos circulantes y transportadas, de
esta manera, a los diversos rganos donde pueden sobrevivir y multiplicarse
dentro de las vacuolas de los fagocitos circulantes y tisulares. Los
mecanismos de ingreso de la bacteria a estas clulas no estn
suficientemente aclarados, aunque se presume que el LPS y las protenas de
la membrana externa podran participar en los mismos, mediante receptores
tipo manosa o integrinas, respectivamente. Las clulas de la placenta son
ricas en receptores de manosa y en un factor de crecimiento conocido como
eritritol, presente en tejidos placentarios animales, lo que explica la avidez de
Brucella por los mismos.
La supervivencia de Brucella dentro de las clulas se ha asociado con la
sntesis de enzimas antioxidantes y a la produccin de GMP (guanosina 5-
monofosfato) y adenina, que inhiben la fusin fagosoma-lisosoma, la
desgranulacin, la activacin del sistema mieloperoxidasa-haluro y la
produccin del TNF-.
El cuadro clnico y la evolucin de la infeccin varan en funcin de la especie
animal afectada. En los mamferos rumiantes y en el ganado porcino la
manifestacin clnica es el aborto. En el hombre presenta una gran tendencia
a la cronicidad y se caracteriza por fiebre y localizacin de las bacterias en
distintos tejidos (articulaciones, hueso, endocardio, sistema nervioso). (5)
En la Brucella abortus tienen tambin accin productiva de granulomas, los
que pueden confluir para formar lesiones mayores. Centralmente comenzar
un proceso de necrosis hialina. Igualmente se puede formar abscesos en
diferentes rganos. La ubicacin de los procesos inflamatorios y
granulomatosos de origen brucelar, tiene importancia con relacin al efecto
negativo que producen.
Tambin las vaquillas vrgenes afectadas, pueden eliminar Brucella en sus
secreciones vaginales. Se ha detectado la presencia de eritritol jugando un
papel en el tropismo de la Brucella por tejidos placentarios, hecho discutido
por algunos autores. (8)

11
 CAPTULO II: DIAGNSTICO DE LA BRUCELOSIS

En los bovinos el diagnstico se basa sobre todo en la serologa. En la actualidad

se dispone de un gran nmero de diferentes pruebas serolgicas. Tanto la
reaccin de una prueba serolgica como su utilidad en cada circunstancia se
basan en la sensibilidad que tiene para los anticuerpos de las diferentes clases
de inmunoglobulinas y por la concentracin srica del anticuerpo de cada clase
(Acha, 1991). (9)
Adems de las observaciones clnicas realizadas por los veterinarios, el
diagnstico de la brucelosis animal puede basarse en pruebas de laboratorio
directas, mediante el aislamiento bacteriolgico, o indirectas, mediante la
demostracin de una respuesta serolgica o celular especficas.
Sin embargo, debido a la posibilidad de reacciones cruzadas con otras bacterias
gramnegativas, la presencia de anticuerpos en un determinado animal no
significa necesariamente que esta sufra una infeccin activa por Brucella. Por
ello, los resultados del diagnstico indirecto deben siempre interpretarse a la luz
de los datos clnicos y bacteriolgicos. (7)
Es difcil el diagnstico de la causa del aborto y la orquitis en un animal aislado
debido a la multiplicidad de las causas que pueden intervenir, para el diagnstico
seguro que se recurrir al laboratorio y entre las pruebas que podemos realizar
tenemos las siguientes: Demostracin directa del agente etiolgico
(bacteriolgicas), serolgicas y alrgicas (Brunner y col., 1970). (9)

1. Diagnstico Bacteriolgico
La brucelosis animal puede diagnosticarse presuntivamente mediante el
examen microscpico de frotis de escobillones vaginales, de placenta, de
fetos abortados o de semen, coloreados por los procedimientos de Gram,
Kster o Stamp. Una persona experimentada puede realizar este diagnstico
presuntivo con una cierta garanta, debiendo confirmarlo siempre mediante el
aislamiento bacteriolgico sobre un medio de cultivo, que es la prueba de
diagnstico ms especfica.
La utilizacin de muestras correctas y la disponibilidad de medios selectivos
adecuados permiten realizar el diagnstico bacteriolgico con garanta en la
mayor parte de los casos. La muestra ms recomendable es el escobilln
tomado directamente de la vagina de los animales abortados.
Adems, la leche es una muestra muy recomendable ya que ms del 80% de
los animales infectados excretan Brucella por la leche. El cultivo en agar
sangre en una atmsfera conteniendo un 10% de CO2 (salvo para el caso de
B. canis que no crece en presencia de este gas) es el ms simple y utilizado
de los procedimientos bacteriolgicos.

12
Sin embargo, en Veterinaria, se hace indispensable la utilizacin de medios
selectivos, ya que las muestras proceden de lugares normalmente
hospedados por una rica flora comensal (vagina, leche, fetos abortados, etc.).
Para el aislamiento de B. abortus se usa el medio selectivo de Farrell, que
contiene una serie de antibiticos a los que dicha especie es resistente.
Sin embargo, un significativo porcentaje de cepas de B. melitensis no crece
debido a la presencia en este medio de una alta concentracin de bacitracina.
Por ello, para el aislamiento de B. melitensis se recomienda usar, adems del
medio de Farrell, el medio semiselectivo de Thayer-Martin modificado, que
permite aumentar la sensibilidad del cultivo. Las colonias de Brucella en
aislamiento primario no suelen ser visibles hasta los 3-5 das de incubacin.
Ante un crecimiento caracterstico sobre un medio selectivo, una tincin de
Gram (cocobacilos gramnegativos) y las pruebas de oxidasa y ureasa son
suficientes para garantizar un diagnstico certero de brucelosis. Para la
identificacin a nivel de especie y para la tipificacin en biovariedades, lo ms
conveniente es enviar las cepas aisladas a un laboratorio especializado.
Es preciso tener en cuenta que estas bacterias son unas de las ms
peligrosas hablando en trminos de capacidad para transmitirse a la especie
humana. Por lo tanto, todos los trabajos de manipulacin de muestras,
siembras, etc., deben realizarse adoptando las mximas precauciones. La
utilizacin de guantes, gafas de seguridad y mascarilla es la precaucin
mnima que debe adoptarse, incluso cuando se manipulan las vacunas vivas
B19 y Rev 1 (usadas para la vacunacin de los animales), que pueden
producir infecciones en el hombre. (7)
En resumen, consiste en aislar las Brucellas de rganos de mayor
concentracin como ser: puntos de fijacin de la placenta, rganos del feto
(hgado, pulmn, estomago), ganglios, leche, secreciones vaginales, plasma
seminal y sangre. A veces no se puede realizar el diagnstico bacteriolgico
de la infeccin por Brucella; por ejemplo, en las campaas de control cuando
hay que examinar la situacin de un elevado nmero de animales.
Se recurre entonces al diagnstico indirecto, basado en la deteccin de una
respuesta inmunitaria humoral (anticuerpos, mediante pruebas serolgicas)
o celular (pruebas alrgicas o blastognesis linfocitaria) frente a antgenos
especficos de Brucella. De estos dos tipos de diagnstico indirecto, el
basado en la 19 deteccin de anticuerpos es el que se utiliza
mayoritariamente en las campaas de control (Blasco y Gamazo, 1994). (9)

13
2. PRUEBAS SEROLGICAS

No existe ninguna prueba serolgica que sea adecuada en todas las

situaciones epidemiolgicas; todas tienen limitaciones, sobre todo cuando se
trata de detectar la enfermedad en animales aislados. Se deben tener en
cuenta todos los factores que influyen en la relevancia del mtodo analtico y
en los resultados de la prueba para una interpretacin o aplicacin
diagnstica concreta. En unidades epidemiolgicas en las que se practique
la vacunacin con Brucella lisa, pueden esperarse falsos positivos en
animales vacunados, porque los anticuerpos presentan reaccin cruzada con
la infeccin por la cepa natural.
Los mtodos serolgicos son mtodos estandarizados y validados, con
caractersticas de realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas
obligadas o alternativas para el comercio internacional. Esto no impide el uso
de pruebas modificadas o similares ni la utilizacin de reactivos biolgicos
diferentes. Sin embargo, los mtodos y reactivos descritos en este captulo
suponen un estndar de comparacin en cuanto al rendimiento diagnstico
esperado.
Debe resaltarse que la prueba de la seroaglutinacin en tubo (SAT) se
considera en general inadecuada a efectos del comercio internacional. La
prueba de la fijacin del complemento (FC) es ms especfica que la SAT
para el diagnstico, y adems posee un sistema estandarizado de unidades.
Las caractersticas de rendimiento diagnstico de algunos
enzimoinmunoanlisis (ELISA) y la prueba de la polarizacin de fluorescencia
(FPA) son similares o superiores a la CF y, como son tcnicamente ms
fciles de realizar y ms robustas, pueden ser preferibles a otras. Se ha
comparado el rendimiento de varias de estas pruebas.
Para el control de la brucelosis en un pas o regin, son adecuadas para el
anlisis las pruebas con antgeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba
con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en placa
(BPAT), as como el ELISA y la FPA. Las reacciones positivas deben volverse
a comprobar utilizando una estrategia confirmativa adecuada y/o
complementaria.
En otras especies, como por ejemplo en bfalos (Bubalus bubalus), bisonte
americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens),
elk/wapiti (Cervus elaphus) y camellos (Camelus bactrianus y C.
dromedarius), y camlidos sudamericanos, la infeccin por Brucella sp. sigue
un curso similar que en el ganado bovino. Para estos animales pueden
utilizarse los mismos procedimientos serolgicos, pero cada uno debe ser
validado para la especie de animal estudiada. (1)

14
2.1. PRUEBAS DE ANTGENO TAMPONADO DE BRUCELLA (PRUEBA
PRESCRITA PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL)

2.1.1. Prueba del rosa de bengala

Esta es una prueba sencilla de aglutinacin puntual que utiliza

antgeno coloreado con rosa de bengala y tamponado a pH bajo,
normalmente 3,65 + 0,05.

Produccin de antgeno:
El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas
muertas de las cepas de B. abortus S99 o S1119-3, recogidas
por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a 4C, y
suspendindolas uniformemente en una solucin salina
fenicada estril (0,5%) a razn de 1 g por cada 22,5 ml. (Nota:
si se utiliza carboximetilcelulosa sdica como agente
sedimentador durante la preparacin del concentrado celular,
los residuos insolubles deben eliminarse antes de la tincin
filtrando la suspensin por un prefiltro AMF-CUNO Zeta-plus
[Tipo CPR 01A]). A cada 35 ml de esta suspensin se aade 1
ml de rosa de bengala al 1% (p/v) (CI N 45440) en agua
destilada estril, y la mezcla se agita durante 2 horas a
temperatura ambiente. La mezcla se filtra a travs de una gasa
estril y se centrifuga a 10.000 g para depositar las clulas
teidas, que a continuacin se suspenden uniformemente a
razn de 1 g de clulas por 7 ml de diluyente (21,1 g de
hidrxido de sodio disueltos en 353 ml de solucin salina
fenicada estril ms 95 ml de cido lctico, que se ajusta a
1.056 ml con solucin salina fenicada estril). El color de esta
suspensin debe ser un rosa intenso y el sobrenadante de una
muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser
3,65 + 0,05. Despus de la filtracin a travs de una gasa, la
suspensin se filtra dos veces a travs de un prefiltro de fibra
de vidrio Sartorius N 13430, se ajusta a un PCV de
aproximadamente el 8%, dependiendo de la estandarizacin
final frente a un suero calibrado contra el OIEISS, y se guarda
a 4 C en la oscuridad. El antgeno debe almacenarse siguiendo
las recomendaciones de los fabricantes, pero normalmente no
debe congelarse. Cuando se utiliza en la prueba estndar, el
antgeno para la RBT debe dar una reaccin positiva clara con
dilucin 1/45 del OIEISS diluido en solucin salina con fenol al
0,5%, pero no a una dilucin de 1/55. Tambin se aconseja
comparar la reactividad de los lotes de los antgenos nuevos
con los estandarizados previamente utilizando un juego de
sueros definidos.

15
 Procedimiento de la prueba:
a) Se colocan las muestras de suero y el antgeno a
temperatura ambiente (22 4C). Debe sacarse de la
nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del
da.
b) Se colocan 2530 l de cada muestra de suero en una
baldosa blanca, placa esmaltada o de plstico, o en una
placa para hemaglutinacin de la OMS.
c) Se agita bien el frasco de antgeno, pero suavemente, y
se coloca el mismo volumen de antgeno prximo a cada
gota de suero.
d) Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de
antgeno en la placa, se mezclan cuidadosamente el
suero y el antgeno (usando una porta limpio o una varilla
de plstico para cada prueba) hasta producir una zona
circular u oval de aproximadamente 2 cm de dimetro.
e) La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a
temperatura ambiente en un agitador circular o
tridimensional (si la zona de reaccin es oval o circular,
respectivamente).
f) Se comprueba la aglutinacin, justo a los 4 minutos.
Cualquier reaccin visible se considera positiva. Debe
analizarse un suero control que d una reaccin positiva
mnima antes de comenzar las pruebas de cada da para
comprobar la sensibilidad de las condiciones de la
prueba.
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica,
a veces puede originar una reaccin positiva debido a vacunacin con
S19 o a reacciones serolgicas positivas falsas (FPSR). Por tanto, las
reacciones positivas deben confirmarse con estrategias confirmativas
y/o complementarias (que incluyan tanto la realizacin de otras
pruebas como la investigacin epidemiolgica). En ocasiones muy
infrecuentes se producen falsos negativos, sobre todo debido a los
fenmenos de prozona, y en ocasiones se pueden detectar diluyendo
la muestra de suero o volviendo a analizarla despus de 46
semanas. Sin embargo, la RBT parece adecuada como prueba para
detectar rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin
en rebaos libres de brucelosis.

16
2.1.2. Prueba de aglutinacin tamponada en placa

Produccin de antgeno:
El antgeno para la BPAT se prepara a partir de la cepa S1119-
3 de B. abortus.

Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2

g/100 ml) y cristal violeta (1 g/100 ml) de calidad garantizada
disueltos en agua destilada. Una vez preparadas, las dos
soluciones se almacenan por separado durante 24 horas, y
luego se mezclan en volmenes iguales en una botella opaca y
se guardan en una nevera durante no menos de 6 meses antes
de uso. La mezcla de colorantes solo puede utilizarse entre 6 y
12 meses despus de su preparacin inicial.

El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente

hidrxido de sodio (150 g) en 3 4 litros de solucin salina
estril con fenol. A esta solucin se aade cido lctico (675 ml)
y el volumen final se ajusta a 6 litros aadiendo solucin salina
estril con fenol. El pH de la solucin debe estar comprendido
entre 3,63 y 3,67.

Las clulas concentradas de B. abortus S1119-3 se diluyen a

una concentracin de 250 g/litro en solucin salina con fenol; se
aaden 6 ml de colorante por litro de suspensin celular, y la
mezcla se agita antes de ser filtrada por algodn absorbente
estril. Las clulas se centrifugan a 10.000 g a 4C y las clulas
concentradas se suspenden a continuacin a una
concentracin de 50 g/100 ml en diluyente tamponado.

La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y despus

se diluye aadiendo 300 ml de diluyente tamponado por cada
100 ml de clulas suspendidas. La mezcla se agita a
temperatura ambiente durante 20 24 horas antes de que la
concentracin celular se ajuste al 11% (p/v) con diluyente
tamponado. Esta suspensin se agita durante toda la noche
antes de ser analizada. El antgeno tiene un periodo de validez
de 1 ao y no se debe congelar.

El pH del antgeno tamponado en placa debe ser de 3,70 0,03,

y el pH de una mezcla de suero/antgeno a una proporcin de
8:3 debe ser de 4,02 0,04. La suspensin al 11% de clulas
teidas debe ser azul verdoso. Sin embargo, no se dispone de
ningn procedimiento establecido de estandarizacin
internacional para uso con el OIEISS.

17
 Procedimiento de la prueba:
a) Se colocan las muestras de suero y el antgeno a
temperatura ambiente (22 4C); Debe sacarse de la
nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del
da.
b) Se agita bien la muestra. Se colocan 80 l de cada
muestra de suero en una placa de vidrio marcada con
cuadros de 4 4 cm.
c) Se agita bien la botella de antgeno, pero con suavidad,
y se colocan 30 l de antgeno cerca de cada gota de
suero.
d) Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de
antgeno a la placa, se mezclan completamente el suero
y el antgeno (utilizando un vaso limpio o una varilla de
plstico para cada prueba) hasta producir una zona
circular de unos 3 cm de dimetro.
e) Despus de la mezcla inicial, la placa se mueve tres
veces para asegurar la dispersin homognea de los
reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente
en una cmara hmeda.
f) Se extrae la placa y se mueve como antes, y se vuelve
a incubar otros 4 minutos.
g) Se lee de inmediato la aglutinacin una vez transcurridos
8 minutos. Cualquier reaccin visible se considera
positiva. Debe analizarse un suero control que d una
reaccin positiva mnima antes de comenzar las pruebas
de cada da para comprobar la sensibilidad de las
condiciones de la prueba.
Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la
deteccin de anticuerpos inducidos por la vacuna, y las muestras
positivas deben volverse a analizar con pruebas confirmativas y/o
complementarias.
Pueden producirse falsos negativos, debidos por lo general a
fenmenos de prozona, la cual puede eliminarse diluyendo el suero o
volviendo a analizarlo despus de cierto tiempo.

18
2.2. PRUEBA DE LA FIJACIN DEL COMPLEMENTO (PRUEBA
PRESCRITA PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL)

La FC est ampliamente aplicada y aceptada como prueba

confirmativa pese a la complejidad de su ejecucin y a la necesidad
de unas buenas instalaciones y de personal formado para titular y
mantener los reactivos adecuadamente. Existen muchas variaciones
de la FC, pero esta prueba se suele realizar de forma ms cmoda en
formato de microtitulacin.

Para la incubacin de suero, antgeno y complemento, se puede

utilizar la fijacin en caliente o en fro: 37 C durante 30 minutos o 4 C
durante 14 18 horas. Varios factores influyen en la eleccin del
mtodo: la actividad anticomplementaria de muestras de suero de baja
calidad es ms evidente con la fijacin en fro, mientras que a 37 C
aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas, y se deben probar
varias diluciones para cada muestra.

Se han propuesto varios mtodos para la FC en los que se utilizan

diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (SRBC) frescos o
conservados (normalmente se recomienda una suspensin al 2, 2,5 o
3%). Los SRBC estn sensibilizados con un volumen igual de suero
de conejo anti-SRBC diluido hasta contener varias veces (en general
de dos a cinco) la concentracin mnima necesaria para producir un
100% de lisis de SRBC en presencia de una solucin titulada de
complemento de cobaya.

El ltimo se titula independientemente (en presencia o ausencia de

antgeno, segn el mtodo) para determinar la cantidad de
complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de los
SRBC sensibilizados por unidad de volumen de una suspensin
estndar; estas se definen como la unidad hemoltica de complemento
al 50% o al 100%/ dosis hemoltica mnima (CH o MHD50 o CH o
MHD100), respectivamente. Se suele recomendar titular el
complemento antes de cada serie de pruebas, siendo preferible un
micromtodo para la determinacin ptima de C'H50. Normalmente se
utilizan en la prueba 1,25 2 CH100 o 56 CH50.

El diluyente estndar para la FC es una solucin salina tamponada con

barbital (veronal). Se prepara con comprimidos comerciales; como
alternativa, se puede preparar a partir de una solucin madre de
cloruro sdico (42,5 g), cido barbitrico (2,875 g), dietil barbiturato
sdico (1,875 g), sulfato magnsico (1,018 g) y cloruro clcico (0,147
g) en 1 litro de agua destilada, y se diluye antes de utilizarla aadiendo
cuatro volmenes de una solucin de gelatina al 0,04%.

19
 Produccin de antgeno:

Existen numerosas variaciones de la prueba, pero sea cual sea

el procedimiento debe emplearse un antgeno preparado a
partir de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la S99 o
la S1119-3, y que est estandarizado frente al OIEISS.

El antgeno para la FC puede prepararse mediante

procedimientos especiales, o bien deben utilizarse clulas
enteras diluyendo la suspensin madre de modo que el PCV de
la suspensin de antgeno concentrado para la FC sea
aproximadamente del 2% antes de la estandarizacin frente al
OIEISS.

El antgeno debe estandarizarse para dar una fijacin del 50%

a una dilucin 1/200 del OIEISS y debe mostrar tambin una
fijacin completa a diluciones ms bajas de suero, porque una
concentracin demasiado baja (o demasiado alta) de antgeno
puede no producir un 100% de fijacin a diluciones de suero
ms bajas. Cuando son adecuadas dos diluciones de antgeno,
debe escogerse la suspensin de antgeno ms concentrada
para evitar el fenmeno de prozona.

El aspecto del antgeno a una dilucin de 1/10 debe ser el de

una suspensin blanca, uniforme y densa, sin agregacin
visible ni formacin de depsito despus de incubar a 37C
durante 18 horas. No debe producir efectos
anticomplementarios a la concentracin de trabajo utilizada
para la prueba. El antgeno se guarda a 4 C y no debe
congelarse.

Procedimiento de la prueba (ejemplo):

Los sueros problema sin diluir y los estndares de trabajo

adecuados se inactivan durante 30 minutos en un bao de agua
a 60C 2C. Si previamente se han diluido a la mitad con una
solucin salina tamponada con veronal, se pueden inactivar a
58C 2C durante 50 minutos. En general, solo se analiza
sistemticamente una dilucin del suero (generalmente a 1/4 o
1/5, dependiendo del procedimiento de CF escogido), pero se
recomiendan diluciones seriadas a efectos de detectar la
existencia de prozona.

20
Con el empleo de placas de microtitulacin estndar de 96
pocillos de fondo redondeado (en U), la tcnica se suele realizar
del siguiente modo:

a) En el pocillo de la primera, segunda y tercera filas, se

colocan 25 l de suero problema inactivado diluido. La
primera fila es un control anticomplementario para cada
suero. Se aaden a los pocillos de la primera fila 25 l
de tampn de FC (controles anticomplementarios) para
compensar la falta de antgeno. A todos los otros pocillos
se aaden 25 l de tampn de FC excepto a los de la
segunda fila. A continuacin, se hacen diluciones
seriadas a la mitad transfiriendo volmenes de 25 l de
suero de la tercera fila en adelante. Se descartan 25 l
de la mezcla resultante en la ltima fila.
b) A cada pocillo, excepto en la primera fila, se aaden 25
l de antgeno, diluido a la concentracin de trabajo.
c) Se aaden a cada pocillo volmenes de 25 l de
complemento diluido hasta el nmero de unidades
exigido.
d) Se establecen controles con diluyente solo,
complemento + diluyente, antgeno + complemento +
diluyente, que contengan en cada caso 75 l de volumen
total. En cada serie de pruebas debe analizarse un suero
control que d una reaccin positiva mnima para
comprobar la sensibilidad en las condiciones de la
prueba.
e) Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos o
durante toda la noche a 4C y se aade a cada pocillo un
volumen de SRBC sensibilizados (25 o 50 l
dependiendo de la tcnica). Las placas se incuban a 37
C durante 30 minutos.
f) Los resultados se leen despus de centrifugar las placas
a 1.000 g durante 10 minutos a 4C o de dejarlas en
reposo a 4C durante 23 horas para permitir que
sedimenten las clulas no lisadas. El grado de hemlisis
se compara con los estndares que correspondan a una
lisis del 0, 25, 50, 75 y 100% de lisis. La ausencia de
actividad anticomplementaria se comprueba en la
primera fila para cada suero.
g) Estandarizacin de los resultados de la CF: Existe un
sistema de unidades basado en el OIEISS. Este suero
contiene 1000 UIFC (unidades internacionales de la
prueba de fijacin de complemento) por ml.

21
 Si este suero se analiza mediante un mtodo
determinado y origina un ttulo de, por ejemplo, 200 (50%
de hemlisis), entonces el factor de un suero problema
analizado por el mismo mtodo se deduce de la frmula:
1000 1/200 ttulo del suero problema = nmero de
UIFC de anticuerpos en el suero problema por ml. El
OIEISS contiene IgG especfica; los sueros estndar
nacionales tambin deben depender de este isotipo para
su actividad especfica de fijacin de complemento.

Surgen dificultades en la estandarizacin porque

diferentes tcnicas favorecen selectivamente la CF
mediante diferentes isotipos de las inmunoglobulinas. Se
recomienda que cualquier pas que use la CF a escala
nacional acuerde un mtodo concreto entre los diversos
laboratorios que realizan la prueba, para obtener el
mismo nivel de sensibilidad.

Para facilitar la comparacin entre pases, los resultados

deben expresarse siempre en UIFC, calculadas en
relacin con las obtenidas en una titulacin paralela con
un suero estndar, que a su vez se puede calibrar frente
al OIEISS.
h) Interpretacin de los resultados: Los sueros con un ttulo
equivalente a 20 UIFC/ml o ms, se consideran
positivos.
Este procedimiento es un ejemplo y se pueden escoger otros
volmenes y cantidades de reactivos con tal de que la prueba se
calibre frente al OIEISS como se ha descrito anteriormente, y que los
resultados se expresen en UIFC /ml.
La prueba de la CF suele ser muy especfica. Sin embargo, como
todas las pruebas serolgicas, a veces da resultados positivos debido
a vacunacin con S19 o como consecuencia de la FPSR.
En consecuencia, las reacciones positivas deben investigarse
mediante estrategias confirmativas y/o complementarias. Las
hembras que se han vacunado con B. abortus S19 entre los 3 y 6
meses se consideran generalmente positivas si los sueros dan una
fijacin positiva con un ttulo de 30 o ms UIFC/ml cuando los
animales se diagnostican a una edad de 18 meses o superior.

22
2.3. ENZIMOINMUNOANLISIS (PRUEBAS PRESCRITAS PARA EL
COMERCIO INTERNACIONAL)

2.3.1. ELISA indirecto

Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA)

utilizando diferentes preparaciones antignicas, diversos conjugados
de antiglobulinas con enzimas, y varios sustratos/cromgenos. Se
dispone de varios I-ELISA comerciales en los que se utiliza clula
entera, lipopolisacrido liso (sLPS) o el Opolisacrido (OPS) como
antgenos que han sido validados en extensos ensayos de campo, y
se utilizan mucho. A efectos de una armonizacin internacional, los
laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros
Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el
mtodo de la prueba en cuestin.

La prueba debe calibrarse de modo que la densidad ptica del Suero

Estndar de la OIE para ELISA fuertemente positivo represente un
punto de la parte lineal de una curva tpica de dosis-respuesta, justo
por debajo de la meseta. El Suero Estndar dbilmente positivo de la
OIE para ELISA debe dar siempre una reaccin positiva que est
situada en la parte lineal de la misma curva dosis-respuesta, justo por
encima del umbral positivo/negativo. El suero negativo y el control de
tampn deben originar reacciones que estn siempre por debajo del
umbral positivo/negativo. Por ltimo, debe establecerse el punto de
corte de la prueba con tcnicas adecuadas de validacin.

El I-ELISA que utiliza sLPS u OPS como antgenos es muy sensible

para la deteccin de anticuerpos anti Brucella, pero no permite
resolver por completo el problema de diferenciacin respecto a
anticuerpos originados por la vacunacin con S19.

El problema con las FPSR podra resolverse en parte llevando a cabo

un I-ELISA utilizando LPS rugoso (rLPS) o antgenos del citosol. La
mayor parte de las FPSR son resultado de la reaccin cruzada con la
porcin del polisacrido OPS de la molcula sLPS; sin embargo, son
menos frecuentes las reacciones cruzadas entre las regiones
centrales del PLS.

Para el I-ELISA de deteccin sistemtica, deben utilizarse

preparaciones ricas en sLPS u OPS como antgeno ptimo. Hay varios
protocolos para preparar un antgeno adecuado.

En funcin de la disponibilidad y de las necesidades de rendimiento,

se pueden emplear antiglobulinas mono o policlonales o protena A/G
conjugadas con enzimas.

23
Un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 bovina puede
mejorar la especificidad an a costa de perder sensibilidad, mientras
que una protena A o AG conjugada con enzimas puede proporcionar
un reactivo til para las pruebas con diferentes especies de
mamferos.

El mtodo analtico que se describe a continuacin es un ejemplo que

ha sido validado internacionalmente y utilizado por todo el mundo en
proyectos de cooperacin tcnica e investigacin cientfica con
financiacin internacional.

El tampn para antigenar es el carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6,

formado por bicarbonato de sodio (2,93 g) y carbonato de sodio (1,59
g) en 1 litro de agua (el azida sdico [0,20 g/litro] es opcional). El
tampn de dilucin del conjugado y de los sueros problema es PBS
0,01 M, pH 7,2, que contiene ortofosfato bisdico (1,4 g), fosfato
monopotsico (0,20 g), cloruro sdico (8,50 g) y Tween 20 al 0,05%
disuelto en 1 litro de agua destilada (PBST). Este tampn tambin se
usa como tampn de lavado.

El conjugado utilizado en este ejemplo es un MAb especfico para la

cadena pesada de la IgG1 conjugado a peroxidasa de rbano (HRPO).
La solucin base de sustrato es perxido de hidrgeno al 3%. La
solucin base de cromgeno es 0,16 M de 2,2-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolina-6-sulfnico) (ABTS) en agua destilada. El tampn
del sustrato es tampn citrato, pH 4,5, compuesto por citrato trisdico
hidratado (7,6 g) y cido ctrico (4,6 g) disueltos en 1 litro de agua
destilada. La solucin para detener la reaccin enzimtica es dodecil
sulfato sodio (SDS) al 4%.

Produccin de antgeno (ejemplo):

El sLPS de B. abortus S1119-3 o S99 se extrae calentando 5 g
de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de clulas suspendidas
a 66C en 170 ml de agua destilada y aadiendo 190 ml de fenol
al 90% (v/v) a 66C. La mezcla se agita continuamente a 66 C
durante 15 minutos, se enfra y se centrifuga a 10.000 g durante
15 minutos a 4C. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae
con una cnula larga y los restos celulares grandes pueden
eliminarse por filtracin (utilizando un filtro de papel Whatman
N 1) si es necesario.

El sLPS se precipita aadiendo 500 ml de metanol fro que

contenga 5 ml de metanol saturado con acetato de sodio.
Despus de 2 horas de incubacin a 4 C, el precipitado se
recoge por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos.

24
 El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18
horas y se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. La
solucin de sobrenadante se mantiene a 4C. El precipitado se
suspende en 80 ml de agua destilada y se agita otras 2 horas a
4C. El sobrenadante se recoge mediante centrifugacin como
antes y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente.

A continuacin, se aaden 8 g de cido tricloroactico a los 160

ml del LPS crudo. Despus de agitar durante 10 minutos, el
precipitado se elimina por centrifugacin y la solucin traslcida
que constituye el sobrenadante se dializa frente a agua
destilada (dos cambios de al menos 4000 ml cada uno) y luego
se liofiliza.

El LPS liofilizado se pesa y se reconstituye a 1 mg/ml en tampn

carbonato 0,05 M, pH 9,6, y se sonica en un bao de hielo
aplicando unos 6 vatios tres veces durante 1 minuto cada vez.
A continuacin, el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se
guarda a temperatura ambiente.

Procedimiento de la prueba (ejemplo):

a) El sLPS liofilizado se reconstituye hasta 1 ml de agua
destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato
0,05 M, pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se
aaden a todos los pocillos 100 l de la solucin de
sLPS, se cubren las placas y se incuban durante 18
horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se
pueden usar o mantener selladas y congeladas a 20C
hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan
antes de su uso sometindolas durante 30 45 minutos
a 37C.
b) El antgeno no unido se elimina lavando todos los
pocillos de la microplaca cuatro veces con PBST. A los
pocillos especificados se aaden 100 l de suero diluido
a 1/50 a 1/200 con PBST, pH 6,3, que contiene 7,5 mM
de EDTA y 7,5 mM de cido etilnglicoltetraactico
(EGTA) (PBST/EDTA), y se incuban a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
c) Se aaden a las placas los sueros problema y se
analizan por separado o de dos en dos. Los controles,
calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA,
se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero
control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un
suero control negativo y un control del tampn.

25
 d) El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con
PBST (no debe usarse PBS que contenga EDTA/EGTA
con HRPO, ya que inactiva el enzima). A cada pocillo se
aaden 100 l de conjugado (MAb M23) especfico para
un eptopo de la cadena pesada de la IgG1 bovina
conjugado con HRPO y diluido en PBST y las placas se
incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
e) El conjugado no unido se elimina con cuatro lavados. A
cada pocillo se aaden 100 l de sustrato/cromgeno
(1,0 mM de H2O2 [100 l/20 ml de tampn citrato] y 4
mM de ABTS [500 l/ 20 ml de tampn citrato]), las
placas se agitan durante 10 minutos y el color que
aparece se valora en un espectrofotmetro a 414 o 405
nm. Si se desea, se pueden aadir directamente a todos
los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada
de la reaccin.
f) Los pocillos control que contienen el suero fuertemente
positivo se considera que son un 100% positivos y todos
los datos se calculan a partir de estas lecturas de
absorbancia (entre 1,000 y 1,800) empleando la
ecuacin:

Porcentaje de positividad (%P) = absorbancia (muestra

problema) /absorbancia (control fuertemente positivo)
100.

Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran

disponibles el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb especfico
para la cadena pesada de la IgG1 bovina, programas para la
generacin de datos empleando espectrofotmetros particulares y un
protocolo estandarizado para la prueba I-ELISA.

Utilizando este u otro I-ELISA similar calibrado contra los Sueros

Estndar de la OIE para ELISA descritos anteriormente, la sensibilidad
diagnstica debe ser igual o superior a la de las pruebas BBAT
(RBT/BPAT) en el anlisis del ganado bovino infectado. Sin embargo,
como todas las pruebas serolgicas, puede dar resultados positivos
debido a vacunacin con S19 o como consecuencia de la FPSR. Las
reacciones positivas deben estudiarse utilizando estrategias
confirmativas y/o complementarias adecuadas, igual que para la FC.

26
2.3.2. ELISA de competicin

Se ha observado que el ELISA de competicin (C-ELISA) en el que se

emplea un MAb especfico para uno de los eptopos del OPS de
Brucella tiene mayor especificidad, pero menor sensibilidad que el I-
ELISA. Esto se lleva a cabo escogiendo un MAb que tenga mayor
afinidad que el anticuerpo que presenta reaccin cruzada. No
obstante, se ha comprobado que el C-ELISA elimina algunas, aunque
no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reaccin
cruzada.

El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las reacciones

debidas a los anticuerpos residuales que se producen como respuesta
a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular
especificidad y afinidad influirn de forma clara en el rendimiento
diagnstico de la prueba. Como en cualquier prueba basada en el
MAb, para determinar su aceptacin internacional y su utilizacin
generalizadas tambin se debe tener en cuenta la disponibilidad
general del MAb o del hibridoma.

Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA, como antgenos

preparados a partir de otras cepas lisas de Brucella. El C-ELISA
tambin est disponible comercialmente. Algunos protocolos son
menos sensibles que otros, y por tanto los resultados obtenidos
mediante pruebas distintas no siempre son comparables. Con vistas a
una unificacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia
deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para el ELISA a fin
de comprobar o calibrar el mtodo analtico en cuestin.

La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del

Suero Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto en
la parte lineal de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima
de la meseta (es decir, prximo a la mxima inhibicin). El Suero
Estndar de la OIE dbilmente positivo para ELISA debe dar una
reaccin que caiga en la parte lineal de la misma curva de dosis-
respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo (es decir,
inhibicin moderada).

El suero negativo y el control de tampn/MAb deben dar reacciones

siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin
mnima). Adems, el punto de corte debe establecerse en la poblacin
problema con tcnicas de validacin adecuadas.

27
El mtodo analtico que se describe a continuacin es un ejemplo de
prueba que se ha validado internacionalmente y utilizado con a nivel
mundial en proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica
con financiacin internacional.

Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la
prueba I-ELISA.

Produccin de antgeno (ejemplo):

El sLPS de la cepa S1119-3 de B. abortus se prepara y se utiliza
como para el I-ELISA.

Procedimiento de la prueba:
a) El sLPS liofilizado se reconstituye hasta 1 ml de agua
destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato
0,05 M a pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se
aaden a todos los pocillos 100 l de la solucin de LPS,
se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a
4C.

Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o

mantener selladas y congeladas a 20C hasta 1 ao.
Las placas congeladas se descongelan antes de su uso
sometindolas durante 30 45 minutos a 37C.

b) El antgeno no unido se elimina lavando todos los

pocillos cuatro veces con PBST. A cada pocillo se
aaden 50 l de MAb adecuadamente diluido en
PBST/EDTA e inmediatamente otros 50 l de suero
diluido a 1/10 en PBST/EDTA. Las placas se incuban a
temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin,
por lo menos durante los 3 minutos iniciales.

c) Se aaden a las placas los sueros problema y se

analizan por separado o de dos en dos. Los controles,
calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA,
se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero
control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un
suero control negativo y un control del tampn.

d) El suero no unido y los MAb se eliminan lavando la placa

de microtitulacin cuatro veces con PBST. A cada pocillo
se aaden 100 l de suero comercial de cabra anti IgG
de ratn (cadena H y L) conjugado con HRPO y diluido
en PBST (predeterminado por titulacin) y las placas se
incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.

28
 e) El conjugado no unido se elimina con cuatro lavados. A
cada pocillo se aaden 100 l de substrato/cromgeno
(1,0 mM de H2O2 y 4 mM de ABTS), se agitan las placas
durante 10 minutos y el color desarrollado se evala con
un espectrofotmetro a 414 o 405 nm.
Si se desea, se pueden aadir directamente a todos los
pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de
la reaccin.

f) Los pocillos control que contienen el suero fuertemente

positivo se considera que dan un 0% de inhibicin y
todos los datos se calculan a partir de estas lecturas de
absorbancia (entre 1.000 y 1.800) empleando la
siguiente ecuacin:

Porcentaje de inhibicin (%I) = 100 (absorbancia

[muestra problema]/absorbancia [control de tampn]
100).
Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran
disponibles el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb,
programas para la generacin de datos empleando espectrofotmetros
particulares y un protocolo estandarizado para la prueba C-ELISA.
Mediante este protocolo descrito para C-ELISA, u otro similar calibrado
frente a los Sueros Estndar de la OIE para ELISA, la sensibilidad
diagnstica podra ser equivalente a las pruebas BBAT y el I-ELISA en
pruebas con ganado bovino infectado.
Sin embargo, como todas las pruebas serolgicas, puede dar
resultados positivos debido a vacunacin con S19 o como
consecuencia de la FPSR. Las reacciones positivas deben estudiarse
utilizando estrategias confirmativas y/o complementarias adecuadas,
igual que para la FC.

29
2.4. PRUEBA DE POLARIZACIN DE LA FLUORESCENCIA (PRUEBA
PRESCRITA PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL)

La FPA es una tcnica sencilla para determinar la interaccin

antgeno/anticuerpo y puede realizarse en instalaciones de laboratorio
o en el campo. Es una prueba homognea que no requiere la
separacin de los compuestos analizados y que, por tanto, es muy
rpida.

El mecanismo de la prueba se basa en la rotacin aleatoria de las

molculas en solucin. El tamao molecular es el factor que ms
influye en la velocidad de rotacin, con una relacin de
proporcionalidad inversa. As, una molcula pequea gira ms deprisa
que una grande. Si una molcula se marca con un fluorocromo, se
puede determinar el tiempo de rotacin por un ngulo de 68,5 C
midiendo la intensidad de la luz polarizada en planos verticales y
horizontales. Una molcula grande emite ms luz en un nico plano
(ms polarizada) que una pequea que gira ms deprisa y emite luz
ms despolarizada.

En la mayora de las FPA, se marca con un fluorocromo un antgeno

de pequeo peso molecular, inferior a 50 kD, y se aade al suero u
otro lquido problema en el que tenga que detectarse la presencia de
anticuerpos. Si hay anticuerpos, la unin con el antgeno marcado
provocar un descenso en su velocidad rotacional que puede medirse.

Para el diagnstico de la brucelosis, se emplea como antgeno un

fragmento de bajo peso molecular (de 22 kD de media) del OPS del
sLPS de la cepa 1119-3 de B. abortus y se marca con isotiocianato de
fluorescena (FITC). Este antgeno se aade a suero diluido o a sangre
completa y 2 minutos (en el caso del suero) o 15 segundos (en el caso
de la sangre) despus de aadir el antgeno se obtiene una medida
del contenido de anticuerpos mediante un analizador de la polarizacin
de la fluorescencia.

La FPA se puede realizar en tubos de vidrio o en formato de placa de

96 pocillos. El suero bovino se diluye a 1/10 en el caso de la prueba
en placa o a 1/100 en el caso de la prueba en tubo; si se emplea sangre
tratada con EDTA, la dilucin para la prueba en tubo es de 1/50, y de
1/5 para la prueba en placa (la sangre tratada con heparina aumenta
la variabilidad de la prueba). El diluyente utilizado es Tris 0,01 M (1,21
g) que contiene 0,15 M de cloruro sdico (8,5 g), 0,05% de Igepal
CA630 (500 l) (antes denominado NP40) y 10 mM de EDTA (3,73 g)
por litro de agua destilada, pH 7,2 (tampn Tris). Despus de mezclar,
se obtiene una lectura inicial para determinar la dispersin de la luz
con un analizador de polarizacin de fluorescencia (FPM).

30
Se aade un antgeno titulado marcado adecuadamente (que por lo
general origine una intensidad de 250.000 300.000), se mezcla y se
obtiene con el FPM una segunda lectura a los 2 minutos en el caso del
suero y a los 15 segundos en el caso de la sangre. Una lectura superior
al nivel del umbral establecido (en miliunidades de polarizacin, mP)
indica una reaccin positiva. Un nivel umbral tpico es 90100 mP,
aunque la prueba debe calibrarse localmente contra un Suero
Estndar de Referencia Internacional. Deben incluirse controles de
suero fuertemente positivo, dbilmente positivo, y negativo, as como
un suero de animal vacunado con S19.

Produccin de antgeno (ejemplo):

El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso
hmedo) de B. abortus S1119-3 aadiendo 400 ml de cido
actico al 2% (v/v), esterilizando en autoclave la suspensin
durante 15 minutos a 121C y eliminando los restos celulares
mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C.
A continuacin, la solucin de sobrenadante se trata con 20 g
de cido tricloroactico para precipitar las protenas y los cidos
nucleicos. El precipitado se elimina de nuevo mediante
centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. El
sobrenadante se dializa frente a un mnimo de 100 volmenes
de agua destilada y se liofiliza.

Se disuelven 3 mg de OPS en 0,6 ml de hidrxido de sodio 0,1

M (4 g NaOH/litro) y se incuban a 37 C durante 1 hora.
Despus se aaden 0,3 ml de ismero 1 de FICT a una
concentracin de 100 mg/ml en dimetilsulfxido y se incuban
otra vez durante 1 hora a 37C. El OPS conjugado se aplica a
una columna de 1 10 cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex
A 25 equilibrada con tampn fosfato 0,01 M, pH 7,4. La primera
fraccin (despus de 10 15 ml de elucin con tampn) es
verde fuerte, y despus se cambia el tampn a fosfato 0,1 M,
pH 7,4. Esto da lugar a la elucin de 10 15 ml de tampn
seguidos de 25 40 ml de material verde fluorescente. Este
ltimo material es el antgeno utilizado en la FPA.

La preparacin de antgeno se puede aumentar

proporcionalmente. La cantidad de antgeno utilizada por
prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta
lograr una intensidad de fluorescencia de 250.000 300.000
utilizando el FPM.

El antgeno se guarda como un lquido durante varios aos a

4C en un frasco opaco o se puede liofilizar en frascos opacos.

31
 Se puede disponer de pequeas cantidades de antgeno
marcado para la investigacin y estandarizacin de
procedimientos operativos relacionados con la obtencin de
antgeno y la realizacin de la FPA.

Procedimiento de la prueba:
a) Se aade 1 ml de tampn Tris a tubos de vidrio de
borosilicato de 10 75 mm y despus 10 l de suero o
20 l de sangre tratada con EDTA. Para el formato de 96
pocillos, se aaden 20 l de suero a 180 l de tampn.
Es importante mezclar bien. Se obtiene una lectura en el
FPM para determinar la dispersin de la luz.
b) Se aade al tubo un volumen de antgeno que
corresponda a una intensidad total de fluorescencia de
250-300 103 y se mezcla bien. Este volumen puede
variar de un lote a otro, pero en general es de unos 10
l. Se obtiene una segunda lectura en el FPM despus
de una incubacin a temperatura ambiente de 2 minutos
para suero y de 15 segundos para sangre tratada con
EDTA.
c) Una lectura superior al umbral predeterminado indica
una reaccin positiva.
d) En cada lote de pruebas se incluye lo siguiente: un suero
estndar fuertemente positivo, uno dbilmente positivo y
uno de trabajo negativo (calibrados contra los Sueros
Estndar de la OIE para ELISA).

La sensibilidad y la especificidad diagnstica de la FPA en la

brucelosis bovina son casi idnticas a las de C-ELISA. La especificidad
diagnstica en ganado bovino recientemente vacunado con la cepa
S19 supera el 99%. Sin embargo, se desconoce en la actualidad la
especificidad de la FPA en condiciones de FPSR. Como en otras
pruebas serolgicas, las reacciones positivas deben estudiarse
mediante estrategias adecuadas confirmativas y/o complementarias.

La FPA debe estandarizarse de modo que los sueros fuertemente

positivos y dbilmente positivos de la OIE den siempre resultados
positivos. Adems, en la poblacin problema debe establecerse el
punto de corte con tcnicas de validacin adecuadas. (1)

32
3. OTRAS PRUEBAS

3.1. PRUEBA CUTNEA DE LA BRUCELINA

Una prueba inmunolgica alternativa es la prueba cutnea de la

brucelina, que puede utilizarse para el diagnstico en rebaos no
vacunados siempre que se utilice una preparacin antignica
purificada (libre de LPS) y estandarizada (como la brucelina INRA).

La prueba cutnea de la brucelina tiene una especificidad muy

elevada, de modo que los animales sin vacunar que son
serolgicamente negativos y reaccionan positivamente en la prueba
de la brucelina deben considerarse animales infectados. Adems, los
resultados de esta prueba pueden ayudar a interpretar reacciones
serolgicas que se consideran como FPSR debidas a una infeccin
por bacterias que presentan una reaccin cruzada, especialmente en
reas libres de brucelosis.

No todos los animales infectados reaccionan, por lo que esta no es

recomendable como prueba nica a efectos del comercio
internacional.

Procedimiento de la prueba:

a) Se inyecta por va intradrmica 0,1 ml de brucelina en el

pliegue caudal, en la piel del flanco, o en la de un lado
del cuello.
b) La prueba se lee despus de 4872 horas.
c) El grosor de la piel en el sitio de la inyeccin se mide con
un calibrador Vernier antes de la inyeccin y en el
momento de volver a examinar al animal.
d) Una reaccin positiva fuerte se reconoce fcilmente
porque es una hinchazn local con induracin. No
obstante, las reacciones dudosas requieren una
interpretacin cuidadosa. Un engrosamiento de la piel de
1,5 2 mm debe considerarse como una reaccin
positiva.

Aunque la prueba intradrmica de la brucelina es una de las ms

especficas de la brucelosis (en animales no vacunados) el diagnstico
no puede basarse solamente en reacciones intradrmicas positivas en
unos cuantos animales del rebao, sino en una prueba serolgica
fiable. La inoculacin intradrmica de la brucelina puede originar una
anergia temporal de la respuesta inmunitaria celular. Por tanto, en
general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas
realizadas en el mismo animal.

33
3.2. PRUEBA DE AGLUTINACIN DEL SUERO

Aunque no se considera una prueba obligada ni alternativa, la SAT se

ha utilizado con eficacia durante muchos aos en programas de
vigilancia y control de la brucelosis bovina. Su especificidad mejora
notablemente si se aade EDTA al antgeno.

El antgeno es una suspensin bacteriana en solucin salina fenolada

(NaCl al 0,85% [p/v] y fenol al 0,5% [v/v]). No debe usarse
formaldehdo. Los antgenos pueden presentarse en forma
concentrada siempre que el factor de dilucin a utilizar se indique en
la etiqueta del frasco.

Para reducir los falsos positivos se puede aadir EDTA a la suspensin

antignica a una concentracin final en la prueba de 5 mM. En
consecuencia, el pH de 7,2 debe reajustarse en la suspensin de
antgeno.

El OIEISS contiene 1000 UI de aglutinacin. El antgeno debe

prepararse sin referencia a la concentracin celular, pero su
sensibilidad debe estandarizarse con relacin al OIEISS de modo que
el antgeno produzca el 50% de aglutinacin con una dilucin srica
final de 1/600 a 1/1000, o el 75% con una dilucin srica final de 1/500
a 1/750. Tambin se aconseja comparar la reactividad de los lotes de
los antgenos nuevos con los estandarizados previamente, utilizando
un juego de sueros definidos.

La prueba se realiza en tubo o en microplaca. La mezcla de antgeno

con las diluciones de suero debe incubarse 16 24 horas a 37 C. Si
la prueba se realiza en microplaca, el tiempo de incubacin puede
acortarse a 6 horas.

Para cada suero debe prepararse un mnimo de tres diluciones para

evitar respuestas negativas debidas a los fenmenos de prozona. La
dilucin de sueros sospechosos debe llevarse a cabo de modo que la
lectura de la reaccin al lmite de la positividad se haga en un tubo
medio (o pocillo en el mtodo de microplaca).

Interpretacin de los resultados: El grado de aglutinacin de Brucella

en un suero debe expresarse en UI por ml. Un suero con 30 UI o ms,
se considera positivo.

34
3.3. PRUEBAS BASADAS EN EL HAPTENO NATIVO Y EN LA
PROTENA DEL CITOSOL

Las pruebas basadas en el hapteno nativo son muy especficas en

contextos de vacunacin con S19, y se han utilizado con xito en un
programa de erradicacin junto con la RBT como prueba de deteccin
sistemtica.

La sensibilidad ptima (cercana a la de la CF, pero inferior a la de la

RBT y la del I-ELISA basado en la sLPS) se obtiene en un sistema de
inmunodifusin radial inversa (RID) en el que el suero difunde hacia
un gel hipertnico que contiene el polisacrido.

No obstante, el procedimiento de la doble difusin en gel tambin

resulta til. Los terneros vacunados subcutneamente con la dosis
estndar de la cepa S19 a los 35 meses de edad son negativos a los
2 meses de la vacunacin, y el ganado adulto vacunado
subcutneamente 45 meses antes con dosis reducida de la cepa S19
no da reacciones positivas a menos que resulten infectados y excreten
la vacuna en la leche.

La vacunacin conjuntival (tanto en animales de corta edad como en

adultos) reduce el tiempo de obtencin de una respuesta negativa en
las pruebas con hapteno nativo.

Una caracterstica notable de la prueba RID es que un resultado

positivo se correlaciona con la excrecin de Brucella, como se ha
demostrado en ganado bovino infectado experimentalmente y en
ganado bovino con infeccin natural sometido a tratamiento
antibitico.

Se ha demostrado que las pruebas con precipitina o protenas del

citosol de Brucella tambin eliminan, en la mayora de los casos, las
reacciones FPSR causadas por Yersinia enterocoltica O:9 y las FPSR
de origen desconocido.

35
3.4. PRUEBAS EN LA LECHE

Un medio eficaz de examinar los rebaos de vacas lecheras es

analizar la leche de los tanques colectivos. Hay que recordar que, en
la ltima fase de la gestacin, las vacas gestantes se secan y su leche
no est incluida en la muestra del tanque colectivo. Por el contrario,
ser ms probable que estos animales, en el caso de que estn
infectados, den resultados positivos en las pruebas de diagnstico
serolgico.

Por tanto, inmediatamente despus del parto debe volver a analizarse

la leche del tanque colectivo. De estos tanques se puede obtener leche
de forma ms barata y frecuente que las muestras de sangre, y
habitualmente estn disponibles en las centrales lecheras. Cuando se
obtiene un resultado positivo, deben realizarse anlisis de sangre en
todas las vacas que aportan leche.

La prueba I-ELISA en leche es sensible y especfica, y resulta

particularmente til para analizar grandes rebaos. La prueba del
anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se
dispone de ELISA.

3.4.1. I-ELISA en leche

Como ocurre en el caso del I-ELISA para suero, se utilizan numerosas

variaciones del I-ELISA para leche. Se han comercializado varios I-
ELISA que se han validado en grandes ensayos de campo y que se
utilizan mucho. A efectos de una armonizacin internacional, los
laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros
Estndar de la OIE para ELISA para comprobar o calibrar el mtodo
analtico en estudio.

El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estndar fuertemente

positivo de la OIE para ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y
diluido despus a 1/10 en leche negativa d siempre resultados
positivos. Las muestras de leche de tanque colectivo se analizan
generalmente a diluciones mucho ms bajas que el suero, es decir, de
1/2 a 1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es similar a
lo descrito para el suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con
leche completa, pero puede usarse con muestras de suero lcteo.

36
3.4.2. Prueba del anillo de leche

En los animales lactantes, la prueba del anillo de leche o MRT puede

utilizarse para el diagnstico de la brucelosis en rebaos. En rebaos
grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene
menos fiabilidad. La MRT puede ajustarse para compensar el factor
de dilucin de las muestras de leche de tanque colectivo procedentes
de rebaos grandes. Las muestras se ajustan de acuerdo con la
siguiente frmula: con un tamao del rebao <150 animales se usa 1
ml de leche de tanque colectivo, de 150 450 animales, se usa una
muestra de leche de 2 ml, y de 451 700 animales, se usa una
muestra de leche de 3 ml. Pueden obtenerse falsos positivos en
ganado bovino vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras
de leche anormal (como el calostro) o en casos de mamitis. Por tanto,
no se recomienda la utilizacin de esta prueba en explotaciones muy
pequeas, donde estos problemas presentan un mayor impacto en los
resultados de la prueba.

Produccin de antgeno:

El antgeno para MRT se prepara a partir de suspensiones

concentradas de bacterias muertas de B. abortus S99 o S1119-
3, cultivadas como se ha descrito con anterioridad. Se
centrifugan, por ejemplo, a 23.000 g, durante 10 minutos a 4C
y se suspenden en una solucin de la colorante hematoxilina.
Se emplean varios mtodos satisfactorios; un ejemplo es el
siguiente: se aaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl N
75290), disuelta en etanol al 95%, a una solucin de sulfato
amnico alumnico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de
glicerol. A la solucin se aaden 2 ml de yodato sdico al 10%
(p/v) recin preparado. Despus de 30 minutos de reposo a
temperatura ambiente, la solucin de color prpura oscuro se
aade a 940 ml de sulfato amnico alumnico al 10% (p/v) en
agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solucin
se deja envejecer mantenindola a temperatura ambiente en la
oscuridad durante 45 90 das.

La solucin de colorante se agita antes de utilizarla y se filtra a

travs de una gasa. Las clulas concentradas se suspenden en
la solucin de colorante a razn de 1 g por cada 30 ml de
colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48
horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar a
80 C durante 10 minutos).

37
 Las clulas teidas se concentran por centrifugacin y se lavan
tres veces con una solucin de cloruro sdico (6,4 g), cido
lctico al 85% (1,5 ml) e hidrxido de sodio al 10% (4,4 ml) en
1,6 litros de agua destilada, a pH final de 3,0. Las clulas
lavadas se suspenden a razn de 1 g en 27 ml de un diluyente
que consiste en solucin salina con fenol al 0,5%, ajustada a
pH 4,0 por adicin de cido ctrico 0,1 M (aproximadamente 2,5
ml) y ortofosfato monosdico 0,5 M (aproximadamente 1 ml), y
se mantiene a 4 C durante 24 horas. La mezcla se filtra a travs
de una gasa, se comprueba el pH, y se determina el PCV
ajustndolo aproximadamente al 4%.

La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un

lote previamente estandarizado utilizando un juego de muestras
de varios grados de reaccin preparado diluyendo un suero
positivo en leche. El antgeno debe estandarizarse frente al
OIEISS de modo que una dilucin a 1/500 sea positiva y una
dilucin a 1/1000 sea negativa. El antgeno debe almacenarse
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero
generalmente debe guardarse a 4 C.

El pH del antgeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe

ser azul oscuro. Se permite la existencia de un poco de
colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada.
Cuando se diluye en leche de un animal sin brucelosis, el
antgeno debe producir una coloracin uniforme de la capa de
leche sin formar depsitos ni coloracin en la capa cremosa.

Procedimiento de la prueba:

La prueba se lleva a cabo con las muestras del tanque colectivo

de leche. Si es necesario, las muestras se pueden pretratar con
un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante
2 3 das a 4 C antes de su utilizacin.

i. Las muestras de leche y el antgeno se deben conservar

a temperatura ambiente (20 3C). Debe sacarse de la
nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del
da.
ii. Se agita suavemente la botella de antgeno.
iii. La prueba se lleva a cabo aadiendo 3050 l de
antgeno en un volumen de 12 ml de leche completa.
iv. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser
como mnimo de 25 mm. Las muestras de leche no
deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a
agitacin violenta ni guardadas durante ms de 72 horas.

38
 v. Normalmente, las mezclas de leche y antgeno se
incuban a 37C durante 1 hora junto con los estndares
de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la
incubacin durante la noche a 4 C aumenta la
sensibilidad de la prueba y permite una interpretacin
ms fcil.
vi. Una reaccin fuertemente positiva viene indicada por la
formacin de un anillo azul oscuro por encima de la
columna blanca de leche. Cualquier capa azul en la
interfase de leche y de crema debe considerarse como
positiva y podra ser significativa, especialmente en el
caso de rebaos grandes.
vii. La prueba se considera negativa si el color de la leche,
en la parte inferior, supera al de la capa cremosa.
viii. Cuando se ajusta la MRT para aplicarla en rebaos de
gran tamao (utilizndose 2 o 3 ml de leche), se aaden
0,1 ml de una mezcla de nata negativa al tubo de ensayo
y a continuacin 3050 l del antgeno de la prueba del
anillo. Despus de mezclar, la prueba se incuba y se lee
de la misma forma que para la MRT no ajustada. La
mezcla de nata negativa se recoge mediante la
separacin de la leche compuesta por varias muestras y
sin pasteurizar correspondiente a un rebao de 25 o ms
vacas que sean negativas a la brucelosis.

3.5. Prueba del interfern gamma

A medida que disminuye la prevalencia de la brucelosis, aumenta la

importancia de la precisin de las pruebas serolgicas. Los falsos
positivos conllevan estudios de trazabilidad y epidemiolgicos que son
caros y requieren mucho tiempo para su aplicacin. De ah que las
pruebas que eliminen la FPSR sern cada vez ms tiles.

En general, la prueba del interfern gamma implica la estimulacin de

los linfocitos en sangre completa con un antgeno adecuado; en este
caso, se ha demostrado que la brucelina da buenos resultados, y luego
se mide la produccin de interfern gamma resultante mediante un
ELISA de captura. Esta prueba podra ser til en la discriminacin de
la FPSR, pero se necesitan antgenos ms especficos y el protocolo
se tiene que estandarizar. (1)

39
 CAPTULO III: INMUNIDAD Y VACUNACIN
1. INMUNIDAD

La respuesta inmunitaria en el curso de la infeccin brucelar es conocida

principalmente en la Brucelosis bovina. Los conocimientos inmunolgicos
tienen mucha importancia para interpretar el diagnostico serolgico. La
respuesta humoral depende de la produccin de inmunoglobulina de
varias clases. Poco despus de la infeccin aparece la IGM, la cual puede
detectarse por aglutinacin en parte por medio de la reaccin de fijacin
de complemento de la prueba de anillo en leche.

Despus son demostrables las ig G 1 con la reaccin de la fijacin de

complemento (eventualmente con la prueba de anillo) y la ig G2 por
aglutinacin. Sigue ms tarde la produccin de IgA (comprobable con
aglutinacin y la prueba de anillo). El nivel de Ig M baja paulatinamente
en tanto que la G y la A persisten en las concentraciones altas.

1.1. Inmunidad Natural

Los terneros infectados por tero o por contagio despus del
nacimiento generalmente permanecen infectados solo un corto
tiempo, a menos que se le cre con leche afectada o se mantenga
en un ambiente infectado. El animal que ha abortado alguna vez o
que se ha infectado en estado adulto, an sin abortar no adquiere
fcilmente la infeccin por segunda vez. Eso indica el desarrollo de
un grado de inmunidad como resultado de la primera infeccin, a
menudo esta inmunidad no es tan intensa como para prevenir un
segundo o tercer aborto.

1.2. Inmunidad Artificial

Empleo de bacterias o cultivos muertos, han ensayado en forma
amplia los cultivos de Brucella abortus muertos por agentes
trmicos o qumicos como medios para aumentar la resistencia de
los animales frente a la enfermedad de Bang. El mtodo no es
peligroso, pero la inmunidad alcanzada no es slida ni duradera.

Empleo de cultivos vivos virulentos, desde hace mucho tiempo se

han usado cultivos vivos de Brucella abortus como medio de
inmunizacin artificial para los animales contra la enfermedad de
Bang. Al principio se usaron cultivos completamente virulentos, que
eran administrados muchas veces antes que los animales fueran
cubiertos, con la esperanza de que los microorganismos fueran
eliminados antes de la concepcin. Estas vacunas dieron como
resultado infecciones de las ubres y convirtieron a los animales en
portadores permanentes. (9)

40
2. VACUNAS

Se realiza un programa de vacunacin en lo cual sus objetivos son:

prevenir, controlar y erradicar la brucelosis. En regiones donde la
prevalencia de la enfermedad es alta, el programa es adaptado a las
condiciones socioeconmicas de los ganaderos. En los animales las
vacunas vivas estimulan una respuesta inmune de tipo celular, la cual es
necesaria para controlar a las bacterias de vida intracelular como la
Brucella.

La capacidad para generar clulas de memoria despus de una primera

infeccin es el principio bsico para desarrollar una inmunidad
prolongada, que es el objetivo de la vacunacin. Por esta razn, los
biolgicos utilizados en la Campaa para el control de esta enfermedad
son vacunas vivas que deben ser aplicadas a hembras negativas a
brucelosis.

El propsito de cualquier programa de vacunacin es proporcionar al

animal una adecuada inmunidad mediada por anticuerpos y por clulas
para proteger ante la infeccin. El trmino vacuna se refiere
indistintamente a todos aquellos productos biolgicos o inmungenos que
son aplicados para proteger a los animales contra las enfermedades.

Por ejemplo, la aplicacin de vacunas de virus o bacterias atenuadas

(vivas) ofrece la ventaja de confortar al animal con una dosis antignica
mayor y ms duradera que genera una respuesta citotxica mediada por
linfocitos T de memoria. Adicionalmente, la respuesta inmune se origina
principalmente en el sitio natural de infeccin, lo que favorece la
inmunidad tanto a nivel sistmico como de mucosas.

Generalmente las vacunas de virus o bacterias atenuadas requieren de la

aplicacin de un solo refuerzo. Entre las desventajas del empleo de
vacunas atenuadas est la posibilidad (aunque remota) de que la vacuna
revierta a su forma virulenta, adems de la complejidad y el costo de
mantener una adecuada cadena fra. (10)

Finalmente, la vacunacin debe practicarse de forma regular durante un

perodo de tiempo suficientemente largo para obtener una disminucin de
las tasas de prevalencia tal que permita que el control sanitario, de forma
aislada, sea tcnica y econmicamente factible. Es posible que la
vacunacin casi exhaustiva de una poblacin bovina por el mtodo
conjuntival (por supuesto incluyendo una revacunacin que refuerce y
prolongue la inmunidad) conduzca, por s misma, a un control casi total
de la enfermedad en los prximos aos. (11)

41
2.1. Cepa 19 de Brucella abortus

Esta vacuna ha sido objeto de numerosos ensayos de campo, no

solo en los Estados Unidos de Amrica, sino en casi toda la
totalidad de los pases. Es un cultivo viable de una cepa que resulto
ser avirulenta para los cobayos y el ganado vacuno, pero que
posea excelentes propiedades de inmunizacin. La cepa 19 es
una variedad lisa, aglutingena de Brucella abortus. No esta
desprovista de virulencia por completo. Los cobayos son
susceptibles a infectarse, pero las lesiones que desarrollen son
mnimas o nulas, y en el organismo desaparece totalmente de los
tejidos sin dejar lesiones reconocibles. Las vacas preadas pueden
abortar se inocula con grandes dosis de cepa 19. En estos casos,
los organismos de la vacuna pueden encontrarse en dificultad en
las membranas fetales y en el mismo feto. El ganado es
susceptible, en contacto con las vacas que han abortado, como
resultado de la vacunacin con la cepa 19 no llega a infectarse.

La vacuna cepa 19 se aplica en terneras de 3 a 8 meses de edad

en forma de una sola inyeccin aplicada por va subcutnea. Esta
vacuna no debe usarse en los terneros machos, porque en realidad
se puede provocar la infeccin y afecta la fertilidad animal. Las
aglutininas empiezan a aparecer alrededor de unos 10 das
despus y aumentan a su mximo alrededor de los dos o tres
meses, despus de lo cual los ttulos sanguneos disminuyen. En
el 90% de los animales, despus de 12 meses, los ttulos estn por
debajo de los niveles diagnsticos. Por la poca en que las
vaquillas dan a luz sus primeros terneros, casi todas son negativas
a las pruebas de aglutinacin. La inmunidad conferida por
vacunacin no es absoluta, sin embargo, es lo bastante intensa
para proteger a los animales gestantes jvenes a travs del periodo
de mayor susceptibilidad par la enfermedad. La vacunacin de las
terneras con cepa 19 se practica con gran amplitud en muchas
partes del mundo y ha contribuido de manera considerable a
disminuir los daos causados por la Brucelosis en el ganado.

2.2. Cepa 45/20 Mcewen y Priestly de Brucella abortus

En las islas britnicas descubrieron una cepa rugosa de Brucella

abortus que se hizo progresivamente ms patgena a medida que
se propag en una serie de cobayos. Las variantes de propagacin
que sera como un buen agente inmunizante pero que no era
bastante virulenta para causar la enfermedad en el ganado, se
design como 45/20.

42
2.3. Cepa RB 51

Es un biolgico nuevo obtenido a partir de cepas mutantes de

Brucella abortus mediante multiplicaciones genticas, que tienen
caractersticas de ser rugosas, evita la formacin de anticuerpos
contra la cadena O del LPS y protegen adecuadamente a ambos
sexos. Esta vacuna RB 51, tiene la gran ventaja de aplicarse a
cualquier edad, (vaquillas en pleno desarrollo sexual, vacas
sexualmente maduras, vacas gestantes, y toros sexualmente
maduros), no produce aborto en las vacas gestantes, confiere una
proteccin al 93% en ambos sexos, no produce la infeccin en el
toro, no se eliminan por fluidos naturales, no coloniza ni causa
lesiones contraproducentes en el aparato genital de estos
animales. No interfiere en el serodiagnstico de rutina de la
enfermedad y produce la misma proteccin que la cepa 19.

En resumen, la vacuna B. abortus RB51 ha probado ser una

vacuna efectiva y probablemente ms efectiva que la cepa 19 bajo
condiciones de campo. Est altamente atenuada, es estable y
jams seroconvierte a los animales, evitando as las innecesarias
confusiones diagnsticas y disminuyendo el costo de los
programas de erradicacin.

Los animales vacunados como terneras o como adultos obtienen

una proteccin slida contra la infeccin y abortos. Ya que la
vacunacin con RB51 no seroconvierte, la revacunacin de
animales para aumentar su inmunidad individual y la inmunidad del
rebao puede llevarse a cabo en forma segura.
Actualmente, las vacunas: B. Abortus cepa 19, B. Melitensis Rev. 1 y B.
Abortus RB 51 parecen tener la ms difundida aceptacin y uso bajo
condiciones de campo. Todas parecen ser estables y capaces de inducir
proteccin duradera, pero los datos que caracterizan su duracin de
inmunidad parecen ser limitados.
En reas donde no se utilizan programas de brucelosis de diagnstico y
sacrificio, yo sugerira que el conocer la duracin de la inmunidad de estas
vacunas puede ser un factor crtico para asegurar que la mayora de la
poblacin ganadera permanezca protegida contra las cepas virulentas de
Brucella. Ya que las tres vacunas estn compuestas de bacterias vivas,
todas ellas tienen la capacidad de inducir el aborto en animales gestantes.
(9)

43
3. PROBLEMTICA DETECTADA EN LOS PROGRAMAS DE
VACUNACIN PARA LA PREVENCIN Y ERRADICACIN
DE LA BRUCELOSIS BOVINA

3.1. Falta de vacunacin en zonas endmicas

La falta de programas especficos de vacunacin en zonas

endmicas, o que estos se realicen de manera parcial, son algunas
de las razones del por qu no disminuye la prevalencia de
brucelosis en algunos hatos. Por ejemplo, cuando la vacunacin se
efecta solo en algunos animales, o cuando se aplica tardamente,
se propicia que el resto del ganado permanezca expuesto a la
enfermedad.

En una zona infectada en la cual se intercambian animales,

mercancas y productos, los animales del hato que no estn
vacunados corren un alto riesgo de contraer la enfermedad, de
manera que el contagio es un hecho comn no fortuito, el cual
provoca brotes de la enfermedad. Cuando se presentan casos
clnicos de brucelosis la vacunacin se vuelve necesaria, pero en
realidad debera ser una medida preventiva.

Los propietarios del ganado deben estar conscientes de que son

ellos los principales responsables de establecer un adecuado
programa de prevencin de enfermedades en sus Unidades de
Produccin Pecuaria (UPP).

Desafortunadamente es comn que algunos mdicos veterinarios

que participan en las campaas no acudan con regularidad a las
UPP para vacunar a las cras, por lo tanto, cuando alcanzan los 12
meses de edad o ms, no estn inmunizadas contra la
enfermedad, de tal forma que al ser vacunadas algunas llegan a
abortar uno o dos meses antes del parto.

Esta situacin ha provocado que el ganadero desconfe de la

vacuna, cuando en realidad el problema no radica en la calidad o
seguridad del biolgico, sino que al ser aplicado tardamente las
hembras pueden estar ya infectadas debido a la convivencia con
animales positivos.

44
3.2. Uso de combinacin de vacunas

Las cepas S19 y RB51 poseen caractersticas distintivas de las que

depende su uso; entre ellas destacan la prevalencia, el tipo de
explotacin y el estatus sanitario de la regin. Por tal razn Es
fundamental elegir con cuidado cul de las dos vacunas utilizar,
pero no ambas, para prevenir la enfermedad.

Por ejemplo, en algunos ranchos las becerras son vacunadas con

la cepa S19 y en la revacunacin se utiliza la RB51. Otro ejemplo
comn es cuando las becerras han sido vacunadas y revacunadas
con RB51, y las inmunizaciones posteriores se realizan con S19.
El uso combinado de ambas cepas dificulta la diferenciacin entre
los animales infectados y los vacunados, lo que complica la
segregacin y eliminacin de los animales del hato que resultaron
positivos, y por lo tanto obstaculiza el control de la enfermedad.

Al conocer esta problemtica, se recomienda a los productores no

mezclar vacunas para inmunizar a los animales.

3.3. Revacunaciones

En algunos establos los animales han sido revacunados con la

cepa RB51 hasta en 11 ocasiones en intervalos de tres a seis
meses. Algunos productores revacunan con RB51 cada cuatro a
seis meses como si se tratara de una bacterina y no de una vacuna
viva.

Otros casos de revacunacin con RB51 han sido detectados en

ranchos, donde revacunan anualmente a los animales mayores de
12 meses de edad, incluso usando la dosis becerra,
supuestamente porque proporciona mayor proteccin al ganado
adulto.

Las repercusiones de las revacunaciones son problemas de

fertilidad en los hatos, y tambin se ha observado que la cepa
vacuna RB51 se puede eliminar a travs de la leche y del exudado
vaginal. Adems, se ha encontrado ADN de esta cepa en vacas
que abortaron, aunque se desconoce si la colonizacin de la
bacteria en los tejidos y la eliminacin de esta cepa es resultado
del mal uso e inoculacin repetida del biolgico.

45
3.4. Abortos en animales vacunados

Uno de los inconvenientes de la vacunacin con la cepa S19 es

que puede provocar abortos cuando se aplica a hembras
gestantes, lo que no sucede al vacunar con la cepa RB51. Estudios
realizados en vacas gestantes a las que se aplic RB51 en dosis
reducida mostraron que esta cepa posee una virulencia residual
muy corta; sin embargo, es capaz de producir placentitis y aborto
cuando los animales son revacunados.

En cabras y ovejas gestantes vacunadas con la cepa Rev 1

tambin se han registrado abortos.

As que, para evitar abortos por efecto de la vacunacin lo correcto

es inmunizar a las hembras jvenes utilizando la dosis normal
recomendada.

3.5. Falsos positivos por efecto de la vacunacin y las

revacunaciones

La vacunacin con la cepa S19 puede ocasionar problemas en el

diagnstico de la brucelosis debido a que en los primeros 8-12
meses postvacunacin los animales pueden resultar positivos en
las pruebas de tarjeta y rivanol. Por el contrario, la RB51 no
interfiere en las pruebas serolgicas oficiales ya que no presenta
respuesta a anticuerpos en la cadena O; de manera que cualquier
animal vacunado con esta cepa que presenta una reaccin positiva
debe ser considerado como infectado. Los animales revacunados
incorrectamente pueden dar lecturas positivas a la prueba de
tarjeta, pero negativos a la de rivanol durante varios meses. Sin
embargo, de acuerdo con la normatividad vigente, estos sern
considerados como infectados.

3.6. La vacunacin como riesgo de salud humana

Las vacunas para la prevencin de brucelosis son virulentas para

el ser humano, por lo tanto, representan un peligro de infeccin
para el personal que las aplica. En caso de la inoculacin
accidental con la vacuna RB51, las pruebas disponibles para el
diagnstico de la enfermedad en el humano darn resultados
negativos por lo que el diagnstico y tratamiento seran incorrectos.

Por otra parte, esta cepa es resistente a la rifampicina, que es uno

de los medicamentos de eleccin para el tratamiento de la
brucelosis en humanos, debido a ello, el diagnstico preciso del
tipo de cepa involucrada en el caso es imprescindible. (10)

46
 CAPTULO IV: CONTROL Y ERRADICACIN DE LA
BRUCELOSIS BOVINA
Las justificaciones para la prevencin y control de la brucelosis en las
poblaciones animales son las mismas que para el control de la enfermedad en
la poblacin humana: beneficios econmicos y la proteccin de la salud pblica.
Los costos de un programa de control incluyen: la compensacin por los
animales sacrificados, los honorarios del equipo de profesionales veterinarios,
los materiales utilizados, los costos de laboratorio y los costos administrativos.
El control de la brucelosis se apoya en la identificacin de los animales infectados
y en la eliminacin de los mismos. Asimismo, la vacunacin de los animales
indemnes constituye un importante pilar en un plan de control para que, en una
etapa posterior, la enfermedad pueda ser erradicad. Sin embargo, la vacunacin
sola no es suficiente y debe ser acompaada por otras medidas tales como la
restriccin y control del movimiento y comercio de animales, sacrificio de los
animales infectados y mejoramiento del estado sanitario de las granjas para
reducir la diseminacin de la enfermedad.
Las operaciones de certificacin de rebaos libres se apoyan en el
serodiagnstico, teniendo en cuenta la eleccin de las pruebas a ser aplicadas,
sus caractersticas intrnsecas, costo y la practicidad de la ejecucin. Se
establecen las pruebas de rutina, a intervalos regulares, con sacrificio de los
animales positivos, hasta la obtencin de tres o ms pruebas negativas para
todos los animales de reproduccin. Como el diagnstico positivo significa la
remocin del animal de la poblacin, las caractersticas de sensibilidad y
especificidad de las pruebas se tornan muy importantes, pues la obtencin de
resultados falso-positivos significa sacrificar animales sanos, y resultados falso-
negativos significa dejar fuentes de infeccin en contacto con animales sanos.
Primero se utilizan las pruebas de alta sensibilidad como pruebas tamiz y luego
las pruebas confirmatorias de menor sensibilidad, pero de mayor especificidad.
Idealmente, el control efectivo debe ser una combinacin de buen diagnstico,
vacunacin y tratamiento. Las creencias tradicionales y los hbitos pueden
interferir con el control de la enfermedad y prohibir su aceptacin debido a la falta
de conocimiento. Una educacin integrada sobre la enfermedad y la
participacin de la comunidad en el programa puede evitar este problema, e
incrementar la eficacia de las medidas de control. En ausencia de fuertes
medidas gubernamentales y medios para realizar una vacunacin en masa, el
establecimiento de otras medidas de control depender de la aceptacin
voluntaria de los propietarios del ganado. Es bastante seguro que ellos no
quieran cooperar en ausencia de incentivos y beneficios econmicos.
Dos factores fundamentales que afectan el xito de un programa de control y
erradicacin de la brucelosis bovina son la permanencia en el rebao de
animales positivos (fracaso de la estrategia de sacrificio inmediato de animales
reaccionantes) y las prevalencias de infeccin superiores al 17%.

47
1. PRINCIPALES MEDIDAS DE CONTROL DE BRUCELOSIS A
NIVEL INTERNACIONAL

En Venezuela se ha establecido el Programa de Control y Erradicacin

de Brucelosis. Este programa establece el control de salida de los
animales, el beneficio de los reactores serolgicamente positivos y la
vacunacin obligatoria de las terneras con la cepa 19. La prueba
diagnstica oficial es la prueba de aglutinacin rpida en placa y las
pruebas adicionales para la confirmacin del diagnstico incluyen la
aglutinacin en tubo, la prueba con 2-mercaptoetanol, la fijacin de
complemento y ELISA competitiva. El principal problema encontrado en
este programa de control es la carencia de cooperacin de los establos
en el beneficio de los animales reactores, ya que no hay un esquema de
indemnizacin para reemplazar a los bovinos afectados (Vargas, 2002).

El Servicio Nacional de Salud Animal (SENACSA) es la organizacin

encargada de los programas de brucelosis en Paraguay. En 1978 se
estableci la Campaa Nacional para el Control y Erradicacin de
Brucelosis con el uso obligatorio de la vacuna cepa 19 de en las terneras
de 3-8 meses de edad slo por una vez; el uso de la vacuna RB51 en
vaquillas de ms de 8 meses de edad, incluyendo vacas adultas con
resultados negativos a brucelosis; uso de un esquema de revacunacin
con RB51, una vez, incluyendo los animales vacunados previamente con
la vacuna cepa 19, con resultados negativos a brucelosis. Adicionalmente,
se establecieron otras medidas como el requerimiento en los establos de
un estado libre de brucelosis; uso de pruebas estndar para detectar
brucelosis en bovinos, identificacin de los animales vacunados y
positivos; control del movimiento de los animales incluyendo las
importaciones, ferias y subastas. (Baumgarten, 2002).

Las estrategias utilizadas para el control de la brucelosis bovina en Brasil

son: la vacunacin obligatoria de las terneras entre los 3 8 meses de
edad con la vacuna cepa 19, la nica vacuna oficial; la acreditacin
voluntaria de hatos libres de brucelosis de acuerdo con los estndares
internacionales; el monitoreo voluntario de los bovinos de carne con un
esquema de muestreo peridico; pruebas diagnsticas para el ganado
antes del movimiento interestatal o la entrada a ferias y exhibiciones de
ganado; beneficio obligatorio de los bovinos positivos en mataderos
aprobados; estandarizacin de los procedimientos de anlisis a travs de
cursos cortos para veterinarios acreditados. La prueba Rosa de Bengala
es el procedimiento tamiz estndar. Los animales que salen positivos son
sometidos a pruebas ms especficas como 2-mercaptoetanol o fijacin
de complemento. Hay una dificultad para implementar una poltica de
prueba y sacrificio ya que no hay disponibilidad de un fondo de
compensacin (Poester et al., 2002).

48
El actual programa de control y erradicacin de brucelosis bovina en
Argentina contempla los siguientes puntos: coordinacin de actividades a
nivel regional y local por la conformacin de unidades sanitarias locales;
revisin del programa de control 3 aos despus de haber iniciado,
evaluando serolgicamente la prevalencia de los hatos; registro de
veterinarios acreditados luego de haber aprobado un curso para el control
de brucelosis; acreditacin de laboratorios privados con el objetivo de
validar los resultados para las certificaciones de hatos libres de brucelosis;
implementacin de una red nacional de laboratorios acreditados donde se
realizan exclusivamente las pruebas oficiales para el diagnstico de
brucelosis; identificacin obligatoria de todos los animales; vacunacin
obligatoria de las terneras de 3 8 meses de edad con la vacuna cepa
19; categorizacin de los establos como hatos bajo control, hatos
controlados donde luego de analizados los animales no se han hallado
reactores y se espera una prueba oficial confirmatoria, y hatos libres de
brucelosis donde los establos tienen un certificado de estar libres de la
enfermedad; las granjas lecheras deben pasar por cuatro pruebas de
anillo en la leche al ao; el movimiento de los animales est restringido a
aquellos animales que puedan demostrar ser originarios de hatos libres
de brucelosis y que tienen un certificado de vacunacin (Samartino,
2002).

En Chile, las medidas de control se delinean en funcin a la epidemiologa

de la enfermedad. La estrategia tcnica aplicada en la erradicacin y
control de la brucelosis bovina se basa fundamentalmente en la deteccin
de los rebaos infectados, mediante vigilancia epidemiolgica, el
saneamiento de los rebaos infectados, con el objetivo de eliminar el foco
de infeccin, e impedir la diseminacin de la brucelosis, aplicando
medidas preventivas para aumentar la inmunidad colectiva (vacunacin)
y medidas de control (limitacin del movimiento de bovinos positivos,
establecimiento de cuarentenas, realizacin de chequeos en ferias y
exposiciones ganaderas) (Ramrez et al., 2002; Rosenfeld et al., 2007).

En Centroamrica las pruebas de aglutinacin en placa y Rosa de

Bengala son utilizadas comnmente como pruebas tamiz y
frecuentemente son las nicas disponibles en las reas rurales. Las
pruebas de rivanol y 2- mercaptoetanol son utilizadas como pruebas
confirmatorias. Debido a su relativa complejidad, la prueba de fijacin de
complemento es espordicamente utilizada. Debido a su poca
tecnificacin, los pases de Centroamrica estn iniciando programas de
control de brucelosis bovina con ayuda de agencias internacionales, sin
embargo, a pesar de haber instaurado la vacunacin en terneras con la
vacuna RB51, programas de vigilancia, cuarentena y eliminacin de
reactores, la falta de fondos para estos programas ha tenido
consecuencias desafortunadas sin disminucin alguna de la prevalencia
de brucelosis bovina (Moreno, 2002).

49
En los pases europeos se han realizados diversas estrategias para el
control y erradicacin de la brucelosis bovina. Austria y Gran Bretaa han
beneficiado a los animales positivos. En Blgica, debido a la baja
prevalencia de la enfermedad, se aplica la despoblacin de los establos
infectados (Godfroid y Ksbohrer, 2002).

En la India, el gobierno ha hecho obligatorio analizar regularmente para

brucelosis a todos los toros criados para inseminacin artificial y utilizar
toros libres de brucelosis para la produccin de semen. Frecuentemente,
los casos de fracaso reproductivo y abortos son analizados para detectar
brucelosis por la prueba Rosa de Bengala y la aglutinacin srica en tubo.
Tambin se ha desarrollado una prueba de ELISA en suero y leche con
gran aceptacin, sin embargo, estas actividades no han contribuido a
algn enfoque tangible hacia el control de la enfermedad (Renukaradhya
et al., 2002).

La mayora de pases del medio oriente, en especial Egipto, ya han

intentado controlar la brucelosis en bovinos utilizando variadas
estrategias, con la vacunacin como la principal medida de control.
Igualmente, otra medida de control en la regin es la vigilancia serolgica,
seguida por el sacrificio de los animales positivos y la vacunacin de
vaquillas con dosis completa o reducida con la vacuna B. abortus cepa
19. Los animales adultos pueden ser vacunados con la cepa 45/20.
Tambin se han establecido estrictas medidas de cuarentena y todos los
animales de un hato sospechoso son analizados peridicamente cada 21
das. La cuarentena es liberada si los animales son negativos a 3 pruebas
consecutivas (Refai, 2002).

En China, el Programa de Control de Brucelosis est basado en cuatro

fases distintivas: la vigilancia del rea de inters con el objetivo de
identificar la situacin epidemiolgica, recolectar y analizar datos sobre la
brucelosis; campaas de vacunacin; establecimiento de las medidas de
prevencin y 80 control de brucelosis y edicin de los estndares de
evaluacin del programa; eliminacin de los animales infectados y
vigilancia epidemiolgica de las reas controladas. Entre las principales
medidas de control establecidas en China tenemos: cuarentena,
separacin y eliminacin de los animales infectados con brucelosis, y la
vacunacin contra la brucelosis con la cepa 19 (Deqiu et al., 2002).

50
2. PRINCIPALES MEDIDAS DE CONTROL DE BRUCELOSIS A
NIVEL NACIONAL

En la cuenca lechera de Arequipa se ha desarrollado el Programa de

Control de Brucelosis. Desde 1987 se realiza un monitoreo con una
frecuencia de 3 veces por ao practicando la prueba de anillo en leche.
En caso de que hubiera animales reactivos, se toma muestras de sangre
de todo el hato y se realizan las pruebas de aglutinacin en placa, fijacin
de complemento y Rosa de Bengala (Olivera, 2001).

La baja prevalencia de brucelosis bovina en Arequipa (0.18%) permiti

recomendar que, para acelerar el programa de control, la vigilancia
debera extenderse hacia el ganado no-lechero, a los que se sacrifican en
camales, y fundamentalmente establecer un estricto control en el ingreso
de animales procedentes de reas no libres de brucelosis. Estas medidas
podrn permitir en corto plazo la erradicacin de esta enfermedad en la
regin del sur del pas (Lpez et al., 1994).

En la cuenca lechera de Cajamarca se realizan los Programas de Control

y Erradicacin de Brucelosis y Tuberculosis Bovina, por lo que la
incidencia de estas dos enfermedades es sumamente baja. Adems, se
ha creado un Fondo para la Reposicin de Animales Positivos (Escurra,
2001).

En el ao 2002 se han incorporado al programa tres nuevos

departamentos o Direcciones de SENASA: Chota y Madre de Dios en el
primer semestre y San Martn en el segundo semestre (SENASA, 2008).

3. LEGISLACIN SOBRE BRUCELOSIS BOVINA

En la mayora de pases, la brucelosis bovina es una enfermedad de

declaracin obligatoria. Los programas de control de cada regin deben
recibir la atencin merecida y cualquier plan o planes deben adaptarse a
dicha regin. Asimismo, es fundamental la cooperacin de todos los
organismos oficiales, desde el gobierno local hasta el nacional.

De ms est mencionar que la eliminacin de los animales infectados

puede suponer un problema econmico serio para el ganadero y se deben
considerar las posibilidades de pagar compensaciones econmicas. Otro
punto importante es el control de los movimientos de animales de una
zona a otra ya que un estricto programa de control se puede ver anulado
por las negligencias de una zona contigua (Radostits et al., 2002).

51
A nivel mundial, la Organizacin Panamericana de Salud (OPS/OMS/BID,
1986) ha establecido ciertos estatutos para el mejor control de la
brucelosis a nivel internacional:

Para la importacin de bovinos de cra y recra es necesario un

certificado zoosanitario internacional que indique que los bovinos
exportados no presentaron ningn signo clnico de brucelosis el da
del embarque y que proceden de un hato en el que no ha habido
ningn caso de brucelosis desde seis meses atrs. Si los bovinos
proceden de una zona que no es libre de brucelosis, deben ser
aislados y sometidos a dos pruebas serolgicas con resultados
negativos efectuadas con un intervalo de 30 das, con la segunda
prueba realizada 15 das antes del embarque.

Para la importacin de bovinos para consumo es necesaria la

presentacin de un certificado zoosanitario internacional que los
bovinos no estn eliminados dentro del marco de un programa de
erradicacin de brucelosis, proceden de un pas o una zona libre
de brucelosis bovina, proceden de un hato oficialmente libre de
brucelosis bovina o fueron sometidos a una prueba serolgica 30
das antes del embarque con resultados negativos.

Para la importacin de semen es necesaria la exhibicin de un

certificado zoosanitario internacional que indique que los animales
que proporcionan el semen proceden de un hato oficialmente libre
de brucelosis, que la prueba de seroaglutinacin efectuada en los
30 das antes de la emisin del semen fue negativa, que el semen
no contiene aglutininas anti-brucela y que los animales que
proporcionaron el semen permanecieron los 60 das anteriores a la
emisin del semen en un centro de inseminacin artificial cuyo
ganado est libre oficialmente de brucelosis bovina.

Para la importacin de embriones el certificado necesario debe

indicar que las hembras donantes proceden de un pas o de una
zona libre de brucelosis bovina o de un hato oficialmente libre de
brucelosis. Que las hembras donantes fueron sometidas a una
prueba serolgica de aglutinacin o fijacin de complemento en los
30 das anteriores a su salida hacia el lugar de recoleccin y
presentaron resultados negativos a brucelosis.

En nuestro pas, se aprob recin en el ao 2000 el Decreto supremo N

033-2000-AG que seala las directrices del Reglamento para el Control y
Erradicacin de la Brucelosis Bovina (SENASA, 2008).

52
4. POSIBLES ESTRATEGIAS DE CONTROL Y
ERRADICACIN DE BRUCELOSIS BOVINA EN EL PER
Para llevar a cabo las estrategias de control y erradicacin de la brucelosis
en el pas, es necesario aplicar nuestros conocimientos sobre la enfermedad,
tener en cuenta las pruebas diagnsticas de que disponemos, las formas de
prevencin y decidir el destino de los animales positivos. El primer paso para
implementar estas estrategias es conocer la prevalencia de la enfermedad a
nivel regional, local o de hato, dependiendo del nivel al que se va a trabajar.
Tambin hay que tener en cuenta que el nuestro pas no existe un fondo de
compensacin para los ganaderos que tienen animales infectados.
Asimismo, hay que destacar que el SENASA ha establecido un Programa de
Control y Erradicacin de la Brucelosis Bovina de carcter obligatorio en
todas las zonas donde se ha venido realizando dicho programa y que las
pruebas diagnsticas de campo son la prueba del anillo en leche y la prueba
Rosa de Bengala, ejecutadas slo por el mdico veterinario designado por el
programa. Las pruebas de confirmacin del diagnstico presuntivo son la
fijacin de complemento y ELISA.
En este contexto y para definir mejor los tipos de estrategias que podramos
utilizar para el control y erradicacin de la brucelosis bovina, a continuacin,
se van a esquematizar diversos escenarios hallados en los hatos lecheros.
Estos ejemplos podran hallarse en cualquier parte del pas.
4.1. Estrategias de control durante un brote de brucelosis

Durante un brote de brucelosis se deben tomar las siguientes medidas:

Ejecucin de la prueba Rosa de Bengala por un mdico

veterinario calificado designado por SENASA sobre la
poblacin total del hato. Dos primeras pruebas con 60 das de
diferencia a la totalidad del hato.

Separacin de todos los animales reactores positivos. Traslado

de estos animales a corrales aislados del resto de ganado, de
preferencia a un corral distante de los animales negativos para
su posterior eliminacin.

Administracin diaria de ciprofloxacina de manera preventiva a

todos los terneros recin nacidos.

Aplicar rigurosas medidas de bioseguridad en el

establecimiento, como la desinfeccin del personal y vehculos,
tanto al ingreso y salida del establo. Todo material utilizado con
animales seropositivos debe de ser incinerado despus de su
uso.

53
 Debe realizarse una limpieza y desinfeccin (de ser posible) de
todas las instalaciones incluyendo corrales, comederos,
bebederos, sala de ordeo y zona del tanque de leche. El
personal debe llevar una indumentaria apropiada para el trabajo
con los animales y que permita reducir el riesgo de
diseminacin de las bacterias.

Las placentas de las vacas deben ser incineradas o enterradas

y cubiertas con cal viva. Asimismo, debe intentarse tener
maternidades independientes para los animales, de ser posible
una por vaca, las cuales tambin deben desinfectarse una vez
que el animal las haya desocupado.

Es importante mencionar que la continua capacitacin del

personal del establo sobre la forma de transmisin y
consecuencias de la brucelosis sobre el establo minimizar el
impacto de esta sobre el hato.
La vacunacin de los animales debera ser de carcter obligatorio, con
la cepa RB51 o cepa 19, y en el supuesto que un gran porcentaje del
hato fuera seropositivo, se podran separar los animales intentando el
establecimiento del manejo en hatos paralelos o sistema Bang es
decir, los animales seropositivos y los animales seronegativos criados
en el mismo establecimiento, pero en diferentes ambientes para que
no haya un contacto directo con las posibles fuentes de infeccin.
Posteriormente, pueden irse eliminando paulatinamente los animales
del grupo seropositivo hasta la desaparicin del mismo o de ser
posible y necesario, eliminar al grupo seropositivo inmediatamente.
Para que este tipo de estrategia funcione realmente, no debe
descuidarse la higiene del establecimiento de crianza, las normas
bsicas de bioseguridad y el anlisis serolgico frecuente de los
animales. Igualmente deben aplicarse las pruebas confirmatorias,
como la prueba de Fijacin de Complemento la que casi nunca ofrece
resultados inesperados y es til para diferenciar ttulos debidos a la
vacunacin a no ser que se opte por el uso de la vacuna RB51.
4.2. Estrategias de control en zonas endmicas

Para el control de la brucelosis bovina en reas endmicas con alta

prevalencia de la enfermedad y pocos abortos, se puede recomendar
la vacunacin obligatoria de todas las terneras entre 3 y 8 meses de
edad, y la eliminacin paulatina de los animales seropositivos. Las
pruebas peridicas de anillo en leche, preferentemente con intervalos
de 2 meses, realizadas a animales individuales se podran
complementar con pruebas como fijacin de complemento y cultivos
microbiolgicos.

54
 Luego deben establecerse medidas de control de movimiento animal
para impedir la propagacin de la enfermedad desde este foco.

En el caso de ser un establo cercano a un foco de la infeccin se deben

redoblar las medidas de bioseguridad, restringir el ingreso del
personal, vehculos, etc. Luego de establecidas estas medidas se
deben establecer las pruebas diagnsticas de rutina y la vacunacin
debido al alto riesgo de contagio por vecindad. En este caso las
pruebas deben realizarse 3 veces consecutivas con un intervalo de 2
meses, y en todas ellas debe salir un 100% de animales negativos,
slo deben analizarse las vacas porque las terneras sern sometidas
a la vacunacin. Si se trabaja con RB51 se pueden vacunar terneras,
vaquillas y vaquillonas. Por otro lado, si se decide vacunar con la cepa
19, slo se vacunara a las terneras menores de 8 meses y el resto de
animales sera sometido a serologa. Cuando se obtiene la
certificacin de libre de brucelosis, las pruebas se realizan una vez por
ao y slo a las vacas.

Por otra parte, el gobierno ha incluido un sistema de bonificacin

correspondiente al 1% del precio base por cada kilogramo de leche
que recepcin en las plantas procesadoras en los establos libres de
brucelosis, con lo que el ganadero est ms predispuesto a cooperar
con el programa de control y erradicacin de esta enfermedad.

4.3. Estrategias de control y erradicacin en hatos levemente

infectados

Estos hatos pueden representar un problema especial dependiendo

de la zona en la que se encuentren establecidos. Si se encuentran
situados en una zona donde es probable que se propague la infeccin,
se debe vacunar a todas las terneras, se debe tener un estricto control
del movimiento animal y realizar pruebas diagnsticas con el fin de
eliminar la mayor cantidad de animales reactivos y disminuir lo ms
que se pueda la prevalencia. Cuando la prevalencia llega a ser
bastante baja (menos del 2%) podra intentarse la erradicacin. Sin
embargo, esto implica el inconveniente de la falta de un fondo de
compensacin por parte del estado.

Si los hatos con prevalencia baja estn situados en una zona donde
es poco probable que se propague la infeccin, debera intentarse la
erradicacin inmediata, adems de aplicar estrictas medidas de
control de movimiento animal y vigilancia epidemiolgica. Realmente,
estos son los hatos que pueden y deben ir erradicando porque si no
frenan rpidamente la infeccin esta se puede propagar dentro del
hato. Deben hacer las pruebas necesarias para ir detectando y
sacando a los animales positivos rpidamente.

55
4.4. Estrategias de control en hatos libres de brucelosis

Cuando se declara un hato libre de brucelosis en base a pruebas de

aglutinacin srica, se puede mantener en ese estado slo si se
introducen en el hato animales seronegativos procedentes de rebaos
libres de brucelosis. En este tipo de escenario se puede emprender el
control de la enfermedad aplicando pruebas serolgicas en esquemas
anuales o bianuales, ya sea pruebas sanguneas o en leche y
eliminando obligatoriamente a los eventuales reactores.

En las zonas donde predominan las vacas lecheras, las pruebas en

leche se pueden sustituir por pruebas sanguneas. El procedimiento
de sacrificio de animales reactores se podra utilizar solo o en
combinacin con la vacunacin de terneras si se est pensando
exportar animales. Asimismo, hay que destacar que en este caso es
muy importante el control del movimiento de animales y la vigilancia
epidemiolgica. (12)

56
CONCLUSIONES

Brucelosis es una zoonosis que no ha podido ser erradicada an en la

gran mayora de los pases a pesar de la aplicacin de agresivos
programas de vacunacin con vacunas basadas en bacterias vivas
atenuadas.

Existe una marcada diversidad en las medidas de control y erradicacin

de la brucelosis bovina por B. abortus en las distintas regiones a nivel
mundial. Por consiguiente, algunos pases permanecen endmicos
mientras que otros han logrado la erradicacin total de sus territorios.

En el pas existe muy poca informacin sobre la prevalencia nacional y las

medidas de control de brucelosis bovina. Lima, el departamento ms
tecnificado en cuanto a ganadera lechera, contina siendo un foco de
brotes de brucelosis bovina.

Debido al potencial zoontico y epidmico de Brucella abortus y la

eficiencia de la infeccin por diversas rutas de infeccin, este patgeno
es considerado un potencial riesgo para la salud pblica. (12)

El Per cuenta con un reglamento oficial para el control y erradicacin de

la brucelosis bovina desde 1985. Sin embargo, el reglamento est
desactualizado y no contempla mtodos y reglamentaciones adecuadas
para la lucha contra esta enfermedad. En este contexto, en el intento de
controlar la brucelosis bovina en las cuencas lecheras del sur se tuvo que
establecer el convenio LABVETSUR y los gremios de ganaderos
optndose por utilizar la prueba del anillo en leche juntamente con
pruebas de aglutinaciones en placa en sangre como pruebas de seleccin
y de confirmacin respectivamente. (13)

57
ANEXOS

Brucelosis bovina (Brucella abortus). Modo de transmisin.

Fuente: Pedro N. Acha y Boris Szyfres (2)

Exudados vaginales en una vaca con brucelosis.

Fuente: Dra. Deborah Cesar

58
 Prueba Rosa de Bengala, donde se muestra la reaccin de
aglutinacin. Fuente: Corbel (2006). (12)

Diagrama de ejecucin de la prueba de polarizacin fluorescente.

Fuente: Samartino et al. (2007). (12)

59
Prueba de fijacin de complemento. Fuente: Corbel (2006).

VACUNAS

Vacuna RB51. Fuente: bmeditores.

Vacuna CEPA 19. Fuente: tecnovax

60
PRUEBAS REALIZADAS EN AREQUIPA SOBRE BRUCELOSIS BOVINA.
(13)

Fuente: E. Pal Lpez, Luis Olivera, Rosa Perales y Ral Rosadio.

Cuadro 1. Resultados de la prueba de anillo en leche en hatos lecheros

del Departamento de Arequipa (1987-1993).
PROMEDIO DE RESULTADOS DE LA PRUEBA DE ANILLO
Ao HATOS POSITIVOS SOSPECHOSOS b NEGATIVOS
MUESTREADOS N % N % N %
1987 2,894 13 0.45 12 0.42 2,839 99.13
1988 5,222 59 1.13 100 1.91 5,063 97.0
1989 6,133 85 1.39 61 1.0 5,987 97.6
1990 6,827 61 0.89 117 1.7 6,649 97.4
1991 6,498 106 1.63 155 2.4 6,380 98.2
1992 6,676 63 0.94 69 1.0 6,624 99.2
1993 6,229 77 1.24 18 0.3 6,133 98.5

a Con excepcin 1987 (un muestreo), el muestreo de hatos fue realizado 3 veces
al ao.
b Muestras sospechosas a la prueba (1987-1990), muestras cidas (1991-1993).

Cuadro 2. hatos reactores positivos a pruebas de Aglutinacin en placa

Rosa de Bengala en bovinos lecheros del Departamento de Arequipa.
AO ANIMALES HATOS REACTORES POSITIVOS
MUESTREADOS NMERO %
1987 6,598 650 66 1.00
1988 3,133 321 33 1.05
1989 1,936 145 65 3.36
1990 3,295 204 35 1.06
1991 3,520 529 64 1.82
1992 2,273 382 4 0.35
1993 2,207 392 8 0.18

61
Cuadro 3. Animales reactores a brucelosis bovina en la regin de
Arequipa por zonas y/o irrigaciones.
ZONAS MONITORES ANUALES TOTAL
IRRIGACIONES 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 +
Caman - - - - - - - 0
Campia 17 15 2 2 8 - - 44
Castilla Alta - 4 - - 1 - - 5
Condesuyos - - - - - - - 0
Irrig. Majes - 2 5 3 5 - 1 16
La Joya - 1 7 - 2 - 1 11
Meja 4 - - - 3 - - 7
Pampacolca 26 7 43 NM 36 8 2 122
San Camilo 9 - 8 22 7 - - 46
San Isidro - - - 2 1 - - 3
Santa Rita - 4 - - - - - 4
Valle Majes - - - - - - - 0
Valle Vtor 10 - - - 1 - - 11
TOTAL 66 33 65 29 64 8 4 269

NM= No Muestreados

Cuadro 4. Nmero de hatos libres de Brucelosis bovina en el

Departamento de Arequipa verificadas en planta lechera.
PLANTA LECHERA NMERO DE HATOS LIBRES
1988 1989 1990 1991 1992 1993
Gloria S. A 2320 3841 4060 3924 4307 5031
Prolacsur NM NM 39 26 NM NM
Laive NM NM 22 32 43 287
TOTAL HATOS LIBRES 2320 3841 4121 3982 4340 5318

62
BIBLIOGRAFA

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http//web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/2.04.03.%20Brucelo
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2. Pedro N. Acha y Boris Szyfres. Zoonosis y enfermedades transmisibles

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en: http://bvs1.panaftosa.org.br/local/file/textoc/Acha_v1_brucelosis.pdf

3. SENASA.2015. Disponible en: http://www.senasa.gob.ar/que-es-la-

brucelosis-bovina

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9. Manrique, S.J.J.; Ramos S. R.; Guzmn C.J. Estudio epizootiolgico de

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http://www.fcv.uagrm.edu.bo/sistemabibliotecario/doc_tesis/JUAN%20JO
SE%20MANRIQUE%20S-20101105-161902.pdf

63
10. Prevencin de Brucelosis en Rumiantes. Manual de capacitacin. Primera
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http://apptestrvc.itvara.net/documentos/PROGAN/P_manual_brucelosis.
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de Medicina Veterinaria. 2009. 117h. Disponible en:
http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/747/1/Calle_lj.pdf

13. E. Pal Lpez, Luis Olivera, Rosa Perales y Ral Rosadio. Vigilancia
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http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/veterinaria/v07_n2/vigilanciae.htm

64