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AO DEL SERVICIO AL BUEN CIUDADANO 2017
PROYECTO:
BIORREMEDIACIN DE
SUELOS CONTAMINADOS CON
HIDROCARBUROS UTILIZANDO
LA BACTERIA Pseudomona
Curso: CONTAMINACION Y
UNIVERSIDAD NACIONAL RECUPERACION DE SUELOS
TECNOLOGICA DE LIMA SUR
ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERIA AMBIENTAL
ALUMNOS:
BUENO RAMOS, Maril
CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

DE SUELOS
INDICE GENERAL
CAPITULO I: GENERALIDADES ................................................................................. 4
1.1. TITULO DEL PROYECTO .............................................................................. 4
1.2. RESPONSABLE DEL PROYECTO................................................................ 4
1.3. ASESOR DEL PROYECTO............................................................................ 4
1.4. COLABORADORES DEL PROYECTO.......................................................... 4
1.5. TIPO DE INVESTIGACION ............................................................................ 4
1.6. LUGAR DE INVESTIGACION ........................................................................ 4
1.7. DURACION .................................................................................................... 4
1.8. RESUMEN DE PROYECTO ........................................................................... 5
CAPITULO II: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................... 6
2.1. SITUACION PROBLEMTICA ...................................................................... 6
2.2. FORMULACION DEL PROBLEMA................................................................ 7
2.2.1. Problema General.................................................................................... 7
2.2.2. Problemas Especficos ............................................................................ 7
2.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION ........................................................... 8
2.3.1. Objetivo General ...................................................................................... 8
2.3.2. Objetivos Especficos .............................................................................. 8
2.4. JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION .................................................... 8
2.4.1. Justificacin Terica ................................................................................ 8
2.4.2. Justificacin Prctica ............................................................................... 9
2.4.3. Justificacin Metodolgica ....................................................................... 9
2.4.4. Justificacin Socio Econmica ............................................................ 10
2.5. IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACION .................................................... 10
2.5.1. Aporte a la Ciencia ................................................................................ 10
2.5.2. Aporte a la Tecnologa ........................................................................... 11
2.5.3. Aporte Prctico ...................................................................................... 11
2.6. ALCANCES DE LA INVESTIGACION ......................................................... 12
2.7. LIMITACIONES DE LA INVESTIGACION .................................................... 12
CAPITULO III: MARCO TEORICO ............................................................................. 12
3.1. ANTECEDENTES DEL PROBLEMA ........................................................... 12
3.1.1. ANTECEDENTES INTERNACIONALES............................................... 12
A. USO DE LA BIORREMEDIACIN PARA EL SANEAMIENTO DE
SUSTRATOS CONTAMINADOS POR PETRLEO EN EL ORIENTE DE
VENEZUELA. ...................................................................................................... 12

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DE SUELOS
B. DIVERSIDAD DE BACTERIAS CULTIVABLES CON CAPACIDAD DE
DEGRADAR HIDROCARBUROS DE LA PLAYA DE CALETA CRDOVA,
ARGENTINA. ...................................................................................................... 19
3.1.2. ANTECEDENTES NACIONALES ......................................................... 34
A. REMEDIACION DE SUELOS Y AGUAS SUBTERRANEAS POR
CONTAMINACION DE HIDROCARBUROS EN LOS TERMINALES DE
MOLLENDO Y SALAVERRY DE LA COSTA PERUANA. .................................. 34
3.2. MARCOS CONCEPTUALES ....................................................................... 41
CAPITULO IV: HIPOTESIS Y VARIABLES ............................................................... 64
4.1. HIPOTESIS GENERAL ................................................................................ 64
4.2. HIPOTESIS ESPECFICAS .......................................................................... 64
4.3. IDENTIFICACION DE VARIABLES ............................................................. 64
4.3.1. Variable independiente .......................................................................... 64
4.3.2. Variable Dependiente ............................................................................ 64
4.4. MATRIZ DE CONSISTENCIA ...................................................................... 65
Operacionalizacin de variables .......................................................................... 65
CAPITULO VI: CRONOGRAMA, PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO ................. 66
1.1. CRONOGRAMA ........................................................................................... 66
1.2. PRESUPUESTOS ........................................................................................ 67
1.3. FINANCIAMIENTO ....................................................................................... 68
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................... 68
INDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustracin 1: Aspecto de una fosa inundada con Agua y Petrleo. ............................. 15

Ilustracin 2: Excavacin de la Fosa para extraer el sustrato contaminado por Petrleo.
................................................................................................................................... 15
Ilustracin 3: Arreglo del sustrato contaminado en pilas adyacentes al rea afectada. 16
Ilustracin 4: Recuperacin de la vegetacin en el rea afectada, despus de la
disposicin final del sustrato tratado. .......................................................................... 18
Ilustracin 5: Valor del CO2. ....................................................................................... 26
Ilustracin 6: Anlisis de PCA de FAME ..................................................................... 29
Ilustracin 7: Anlisis de PCA de FAME ..................................................................... 29
Ilustracin 8: Anlisis del Componente Principal de FAME de las identificaciones
bacterianas con los sitios. ........................................................................................... 32
Ilustracin 9: Vista area del Terminal de Mollendo .................................................... 36
Ilustracin 10: Mezcla Suelo Cal Cemento ............................................................ 38

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DE SUELOS
Ilustracin 11: Excavacin del Sitio Contaminado ....................................................... 40

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DE SUELOS
CAPITULO I: GENERALIDADES
1.1. TITULO DEL PROYECTO

BIORREMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS CON
HIDROCARBUROS UTILIZANDO LA BACTERIA Pseudomona
1.2. RESPONSABLE DEL PROYECTO

Proyecto No profesional
1.3. ASESOR DEL PROYECTO

Mg. Ing. Marcelino Tarmeo, Edgar Avelino
1.4. COLABORADORES DEL PROYECTO

Ing. Lino Mucha Pecho
Mg. Apesteguia Infantes, Jos Alfonso
1.5. TIPO DE INVESTIGACION

Investigacin Experimental.- consiste en la manipulacin de una
variable experimental no comprobada, en condiciones rigurosamente
controladas, con el fin de describir de qu modo o por qu causa se
produce una situacin o acontecimiento en particular.
1.6. LUGAR DE INVESTIGACION

Laboratorio de Suelos de la Universidad Nacional Tecnolgica de
Lima Sur (UNTELS).
1.7. DURACION
La duracin del proyecto tendr una duracin del semestre
acadmico
2017 II.

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DE SUELOS
1.8. RESUMEN DE PROYECTO
La contaminacin por hidrocarburos en suelos como resultados de

fugas o descargas accidentales de petrleo, conduce a daos a nivel
del subsuelo y de los mantos freticos generando un fuerte problema
ambiental debido a su toxicidad hacia la vida terrestre.
En la mayora de los casos el saneamiento de los suelos es complejo

debido a que los contaminantes se presentan en forma de mezclas.
La bioremediacion es una alternativa para disminuir la cantidad de

los contaminantes en el suelo usando seres vivos adaptados al
medio y que puedan degradar de manera natural los hidrocarburos
volviendo al suelo a su estado natural. En el presente trabajo de
investigacin se utiliz la bacteria Pseudomona la cual contiene
enzimas del tipo oxigenasas.
Palabras Claves: Bioremediar, Pseudomona, Oxigenasa e

Hidrocarburos.

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DE SUELOS
CAPITULO II: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
2.1. SITUACION PROBLEMTICA

El consumo de las sociedades contemporneas de los combustibles
fsiles ha resultado perjudicial desde el punto de vista ecolgico, ha
provocado atraso en materia tecnolgica, adems de que es
econmicamente costoso y con muchas prcticas innecesarias, lo
que implica un desafo y una oportunidad para mejorar y limpiar el
camino hacia la eficiencia energtica.
En nuestro pas y el mundo existen refineras de petrleo que

producen compuestos derivados que son producidos y transportados
para su uso en diferentes actividades industriales, (grifos, cisternas y
otros) que contaminan el suelo y a pesar del cuidado que puede
tenerse en su manejo y almacenamiento, existe la posibilidad de que
estos compuestos ingresen al suelo en cantidades que superen el
cinco por ciento que es el nivel establecido por el 1 MEM.
Sobre estos suelos contaminados, no existe informacin Estadstica

oficial sobre la ubicacin y extensin de las reas afectadas y su
disposicin adecuada de los productos y residuos de la industria del
petrleo, a pesar de la lgida tarea del Ministerio de Energa y Minas
(MEM), autoridad ambiental competente para las actividades
petroleras en nuestro pas. Esto es un problema muy importante que
requiere que los suelos contaminados con hidrocarburos sean
remediados con tecnologas de bajo costo y de fcil acceso y evitar
la contaminacin de las aguas subterrneas. Por un lado, la
contaminacin del suelo por hidrocarburos afecta la flora, fauna y
microorganismos del suelo , la fertilidad de los suelos, el crecimiento
de las plantas, as como la existencia y sobrevivencia de los
animales que se alimentan de stas (Infante, 1998).

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DE SUELOS
Adems, tambin puede haber una afectacin en el mbito social
que incluye los sistemas de produccin, la salud, la economa y las
formas de vida de las poblaciones, debido a los efectos de estos
compuestos, los cuales son txicos para los humanos (mutagnicos
y carcinognicos) y para los seres vivos en sus diversas formas
(microflora, mesofauna y fauna).
Por ello este trabajo de investigacin desarrollar la recuperacin de

suelos contaminados con hidrocarburos mediante la
biorremediacin. Existen otras tcnicas biolgicas que se basan en
la capacidad de los microorganismos y las plantas para degradar,
transformar o remover compuestos orgnicos txicos y
transformarlos en productos metablicos inocuos o menos txicos.
2.2. FORMULACION DEL PROBLEMA
2.2.1. Problema General

De qu manera la utilizacin de bacterias Pseudomonas
ayuda a la biorremediacin de los suelos contaminados por
hidrocarburos?
2.2.2. Problemas Especficos

Cmo influye la Concentracin de Hidrocarburos en la
utilizacin de la Pseudomona en la Biorremediacin de
los Suelos contaminados?
Cmo influye la actividad enzimtica de la
Pseudomona en la biorremediacin de Suelos
contaminados con Hidrocarburos?

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DE SUELOS
2.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
2.3.1. Objetivo General
Evaluar la utilizacin de las bacterias Pseudomonas en la
biorremediacin de los suelos contaminados por
hidrocarburos.
2.3.2. Objetivos Especficos

Evaluar el nivel de concentracin ptima de los
Hidrocarburos para la utilizacin de la Pseudomona en
la Biorremediacin de los Suelos contaminados .
Evaluar la influencia de la Actividad Enzimtica de la
Pseudomona en la biorremediacin de Suelos
contaminados con Hidrocarburos.
2.4. JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION
2.4.1. Justificacin Terica
Esta investigacin se realiza con el propsito de recuperar

aquellos suelos que por dcadas han sido afectados por las
actividades de perforacin, explotacin, refinacin y
comercializacin de hidrocarburos que generan diversos
tipos de residuos, debido a un inadecuado manejo e
insuficiente sensibilizacin ambiental.
La aplicacin de la biorremediacin y restauracin de

suelos contaminados con hidrocarburos de petrleo, surge
como una alternativa viable, ecolgica y de gran
aceptacin.
En nuestro pas ya se ha iniciado la ejecucin de proyectos

de biorremediacin que consideran la aplicacin de esta
tcnica y se espera que en los prximos aos su empleo se
incremente. Dado que todo proyecto de biorremediacin

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DE SUELOS
tiene como uno de sus principales objetivos la recuperacin
de la calidad del suelo contaminado y su posterior
productividad.
Las tecnologas de remediacin pueden clasificarse de

diferentes maneras, sobre la base de los siguientes
principios: (i) Estrategia de remediacin; (ii) Lugar en que
se realiza el proceso de remediacin y, (iii) Tipo de
tratamiento. Segn el Instituto Nacional de Ecologa,
(2003).
2.4.2. Justificacin Prctica

La biorremediacin, mediante la aplicacin de la bacteria
Pseudomona (enzima Oxigenasa), se constituye en una
tcnica de fcil ejecucin y de bajo costo debido a que las
bacterias pueden desarrollar procesos de biorremediacin
es porque hay algunos de ellos capaces de resistir pH
extremos o lugares con alto contenido de sustancias
txicas, las cuales son aprovechadas por estos
microorganismos, y a veces por plantas, para realizar sus
propios procesos metablicos. Esto implica crecer y
reproducirse en estos ambientes, que tambin pueden
concebirse como extremos. Cuyos residuos de su
metabolismo son inocuos o menos txicos y podrn ser
degradados fcilmente por las plantas o lixiviados sin
perjudicar el ambiente.
2.4.3. Justificacin Metodolgica

La metodologa a emplear es del tipo experimental, ya que
se tiene muestra de suelos contaminados por hidrocarburos
de la Refinera Conchan, a las que se les va a remediar con
la actividad enzimtica de la bacteria Pseudomona y como

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DE SUELOS
bioindicador se tiene el desarrollo de la planta de maz; por
lo que es pertinente el mtodo experimental.
2.4.4. Justificacin Socio Econmica

Existen muchos mtodos de remediacin de suelo, pero es
necesario buscar mtodos de bajo costo y fcil acceso,
como el empleo de poblaciones nativas utilizando
desechos orgnicos de fcil degradacin como aditivos o
correctores de densidad, resulta una alternativa
tcnicamente factible, viable y sencilla que favorece la
degradacin de contaminantes orgnicos en suelos a
travs de procesos de composteo, ya que stos mejoran
las propiedades del sistema y aportan nutrientes para
mantener activas las poblaciones microbianas.
2.5. IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACION

2.5.1. Aporte a la Ciencia
El trabajo de investigacin que se realiza sobre la
biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos
contribuye a una investigacin de tipo cientfica donde se
realizaran estudios profundos en base a la bioqumica de la
Enzima Oxigenas para degradar hidrocarburos y obtener
como producto sustancias menos txicas.
Debido a que estos microorganismos que contienen dicha

enzima poseen la capacidad de crecer a partir de la
utilizacin de sustancias recalcitrantes al medio ambiente.
Algunos de ellos son capaces de degradar estos
compuestos hasta dixido de carbono, sales, agua y otros
productos inocuos al medio ambiente los cuales se
integran posteriormente a los ciclos biogeoqumicos
naturales. Esta tcnica permite tratar grandes volmenes

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DE SUELOS
de contaminantes con un impacto ambiental mnimo, a
diferencia de otros procedimientos de descontaminacin.
2.5.2. Aporte a la Tecnologa

En la presente investigacin se propone el uso de
herramientas de la biorremediacin que es un proceso
natural por el cual los microorganismos degradan o alteran
molculas orgnicas transformndolas en molculas ms
pequeas y no txicas. Sin embargo, este proceso es muy
lento y puede acelerarse introduciendo determinadas
bacterias o plantas en los ambientes contaminados. Esta
intervencin se denomina biorremediacin o
biocorreccin y se define como el empleo de organismos
vivos para eliminar o neutralizar contaminantes del suelo o
del agua. Actualmente se estn desarrollando
microorganismos, algas (especialmente cianobacterias o
algas azules) y plantas genticamente modificadas para ser
empleadas en biorremediacin, con nuestra investigacin
promoveremos que est nueva tecnologa siga
acrecentndose a travs de nuevas cepas de bacterias
biodegradadoras de hidrocarburos.
2.5.3. Aporte Prctico

En la actualidad los suelos contaminados con
hidrocarburos representan el 70% del total de los
ecosistemas impactados.
La biorremediacin de suelo contaminado con

hidrocarburos empleando la bacteria Pseudomona permitir
recuperar suelos totalmente improductivos a suelos
totalmente activos agrcolamente generando produccin y
empleo para muchas comunidades afectadas por este tipo
de contaminacin. Adems de la propagacin de dicho

11
DE SUELOS
contaminante que producir mltiples enfermedades, lo
cual no solo representa un gran riesgo para las personas
sino que tambin aumenta considerablemente el gasto de
los Estados en salud; por ello a travs de nuestra
investigacin trataremos de mitigar este problema
utilizando un mtodo que no traer contaminacin al medio
ambiente y el costo de la inversin ser mnimo.
2.6. ALCANCES DE LA INVESTIGACION

Esta investigacin tiene como alcance realizarse a nivel laboratorio
para luego ser aplicado a mayor escala con ayuda de
patrocinadores.
2.7. LIMITACIONES DE LA INVESTIGACION

Las limitaciones de esta investigacin se basan en la bsqueda y
adaptacin de una cepa bacteriana de Pseudomona o que sean
autctonas de dicho lugar y que a travs de la bioestimulacin poder
aumentar su produccin adems que requiere mayor tiempo de
tratamiento y no podra emplearse si el tipo de suelo no favorece el
crecimiento microbiano. Si se hace de manera incompleta puede
generar cambios metablicos inaceptables, con un grado
contaminante igual o superior del punto de partida y algunos
contaminantes que incluso pueden inhibir la biorremediacin.
CAPITULO III: MARCO TEORICO

3.1. ANTECEDENTES DEL PROBLEMA
3.1.1. ANTECEDENTES INTERNACIONALES
A. USO DE LA BIORREMEDIACIN PARA EL SANEAMIENTO DE

SUSTRATOS CONTAMINADOS POR PETRLEO EN EL ORIENTE
DE VENEZUELA.
RESUMEN

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DE SUELOS
La bioremediacion es un conjunto de tcnicas orientadas al
aprovechamiento de la fisiologa de los seres vivos para degradar
sustancias contaminantes. En el caso de contaminacin por
petrleo, la empresa Petrleos de Venezuela (PDVSA) encontr
(para el ao 2002) 10.000 fosas inundadas con crudo y agua.
Adems se producen ripios de perforacin y sustratos afectados por
derrames. Para mitigar estos pasivos ambientales, PDVSA ha
logrado desarrollar un exitoso sistema denominado INTEBIOS que
utiliza Pseudomona para degradar el crudo. El proceso consiste
bsicamente en la excavacin del material contaminado, su
colocacin en pilas adyacentes al lugar afectado, adicin de
fertilizantes, aireacin y disposicin final en la fosa tratada. Este
sistema puede degradar un 76% de crudo en 68 das. Al final, el
material es depositado de manera similar a las condiciones
originales y la sucesin vegetal se encarga de restablecer la
cobertura de plantas para evitar la erosin.
Palabras clave: contaminacin, medidas mitigantes, impacto
ambiental, industria petrolera, PDVSA.
METODOLOGIA
Este es el sistema de bioremediacion utilizado por PDVSA en el
oriente de Venezuela, en el marco territorial de la Faja Petrolfera del
Orinoco. Est dirigido a la degradacin de hidrocarburos en fosas,
ripios de perforacin y suelos afectados por derrames petroleros. La
magnitud del problema ambiental se evidencia con la cifra de 10.000
fosas inventariadas, hasta diciembre de 2002, solamente en el
Distrito San Tom del Estado Anzotegui (informacin suministrada
por el Ing. Pedro Guerra, Gerente Ambiental del Distrito San Tom,
PDVSA).
Algunas de estas fosas llegan a tener una superficie cercana a 1 ha.
De acuerdo a Infante (2001), las principales operaciones de este
proceso son las siguientes:

13
DE SUELOS
1. Caracterizacin del Pasivo Ambiental.- Consiste en el
anlisis fsico-qumico de los efluentes y de los sedimentos
encontrados. Este procedimiento es realizado por laboratorios
certificados en el Ministerio del Poder Popular para el
Ambiente (MPPA), y cumpliendo lo establecido en el Decreto
No. 883 sobre las Normas para la Clasificacin y Control de la
Calidad de los Cuerpos de Agua y Vertidos o Efluentes
Lquidos y el Decreto No. 2635 sobre las Normas para el
control de la recuperacin de materiales peligrosos y el
manejo de los desechos peligrosos.
2. Extraccin de Fluidos.-
2.1. Extraccin de Crudo.- Las fosas que estn llenas de
agua e hidrocarburos (Ilustracin 1) deben ser
vaciadas con equipos de succin como el Vacume,
Camiones de Fluidos o Jumbos (retroexcavadoras). El
crudo es llevado a macro fosas o plantas de
tratamiento acondicionadas para su disposicin y
procesamiento. Estas actividades son llevadas a cabo
por empresas que poseen el Registro de Actividades
Susceptibles de Degradar el Ambiente (RASDA)
otorgado por el MPPA.
2.2. Extraccin y Disposicin de Agua Salada.- Si el agua

posee concentraciones de cloruros superiores a 1000
ppm deber ser transportada y procesada en una
planta de tratamiento. El agua tratada o que est por
debajo del lmite de cloruros antes sealado, es
asperjada a lugares aledaos al sitio de remediacin.

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DE SUELOS
Ilustracin 1: Aspecto de una fosa inundada con Agua y
Petrleo.
Ilustracin 2: Excavacin de la Fosa para extraer el sustrato

contaminado por Petrleo.
3. Remocin.- El terreno impactado es excavado hasta unos 3

m de profundidad (Ilustracin 2). Luego, utilizando tractores y

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DE SUELOS
cargadores frontales, el material contaminado (suelo) es
colocado en pilas en lugares aledaos al sitio de remediacin
(Ilustracin 3).
Ilustracin 3: Arreglo del sustrato contaminado en pilas adyacentes al rea

afectada.
4. Fase de Tratamiento.-
4.1. Aplicacin de Enmiendas.- En las pilas, se aplican
fertilizantes qumicos y orgnicos en dosis que varan
segn el contenido de grasas y aceites del suelo. En este
proceso se utiliza urea, fosfato, NPK, estircol y cascarilla
de arroz.
4.2. Aireacin y Mezclado.- El material es removido con la

maquinaria para proveer oxgeno a la mezcla, extraer los
aromticos (componentes de los hidrocarburos), activar la
actividad microbiana y lograr un material homogneo.

16
DE SUELOS
5. Fase de Disposicin Final.- El material es sometido a
anlisis de laboratorio y, cuando cumple las especificaciones
establecidas en las normas ambientales, es confinado en el
mismo lugar de donde se extrajo, con una compactacin
similar a las condiciones originales. All se produce una
sucesin natural que restablece la vegetacin con especies
autctonas (Ilustracin 4). En algunos casos se distribuyen
semillas de gramneas (Urochloa sp.) para acelerar el
establecimiento de cobertura vegetal y frenar la erosin.
La tecnologa INTEBIOS se fundamenta en la actividad de
Pseudomona. La mayor eficiencia de estas bacterias se logra
en las siguientes condiciones: pH entre 6 y 8; humedad entre
30 y 60%; temperatura entre 20 y 40C; buena disponibilidad
de nitrgeno, fsforo, potasio; suelos franco arcillosos o
franco arenosos con porosidad y permeabilidad adecuadas
para el flujo de los nutrientes, aire y microorganismos.
La aplicacin de INTEBIOS no requiere del uso de
preparaciones biolgicas a base de microorganismos, prctica
conocida como bioaumentacin, en la que se elabora un
cultivo bacteriano y luego se agrega en campo. Las
experiencias sealan que la bioestimulacin es ms eficiente
en la disminucin de las fracciones de saturados y aromticos
de un crudo en suelo que la bioaumentacin (Dott et al., 1999,
citados por Infante, 2001). Por su parte Infante (2001), reporta
que el uso de INTEBIOS, en el oriente de Venezuela,
permiti degradar crudo en un 76% y compuestos saturados y
aromticos en un 68%, ambos en 68 das. En suelos no
tratados (en el mismo perodo) las tasas de degradacin
fueron 2% para crudo y 0% para saturados y aromticos.

17
DE SUELOS
Ilustracin 4: Recuperacin de la vegetacin en el rea
afectada, despus de la disposicin final del sustrato tratado.
En primer plano se observa un individuo de Curatella

americana, producto de la regeneracin natural y especie
tpica de los chaparrales que se observan al fondo bordeando
la fosa recuperada
CONCLUSION
En un mundo cada vez ms afectado por la contaminacin del suelo

y del agua, las tcnicas de bioremediacion constituyen una
alternativa ms econmica y eficiente para el tratamiento de
residuos y efluentes. La descomposicin de sustancias
contaminantes mediante plantas de tratamiento es costosa y, a
menudo, genera otros impactos ambientales. La bioremediacion
utiliza la capacidad de algunos organismos para sobrevivir en
condiciones de altas concentraciones de sustancias nocivas. Por
medio de sus procesos fisiolgicos, estos organismos degradan
estas sustancias y las transforman en otras materias inertes.
En el caso de la industria petrolera venezolana, un equivocado
concepto de desarrollo dej pasivos ambientales considerables. En
estas reas se ha logrado sanear el terreno con el uso de

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DE SUELOS
Pseudomona, llevando las concentraciones de hidrocarburos a
niveles aceptables de acuerdo a las leyes que rigen esta actividad.
Esta medida mitigante confiere un carcter un poco ms ecolgico y
ms sostenible a los proyectos petroleros.
B. DIVERSIDAD DE BACTERIAS CULTIVABLES CON CAPACIDAD DE

DEGRADAR HIDROCARBUROS DE LA PLAYA DE CALETA
CRDOVA, ARGENTINA.
RESUMEN
En el presente trabajo se estudiaron las comunidades bacterianas
aisladas de agua de mar y sedimentos intermareales de Caleta
Crdova, norte de Comodoro Rivadavia, Argentina. Tres sitios fueron
muestreados estacionalmente entre los aos 2005 y 2006; el primer
sitio fue una playa pblica, el segundo sitio cerca de un puerto
pesquero y el tercero cerca de una boya de toma de petrleo. Las

19
DE SUELOS
comunidades bacterianas fueron determinadas en base a las
diferencias en la composicin de cidos grasos de membrana, las
bacterias fueron identificadas por medio del Sistema Sherlock MIDI,
y el potencial de las comunidades para la utilizacin de
hidrocarburos por la mineralizacin de gasoil, petrleo, kerosene,
aceite lubricante y nafta. Las mineralizaciones evidenciaron la
capacidad de los microorganismos para la degradacin de
hidrocarburos en dos de los sitios estudiados. Se aislaron 251 cepas
de las que se lograron identificar 124 correspondientes a 24 gneros
y 40 especies; la ms frecuente fue Pseudoalteromonas.
Palabras claves: contaminacin, bioremediacion, bacterias marinas,
FAME, Patagonia.
MATERIALES Y METODOS
1. Toma de Muestra.- Se tomaron tres muestras de agua de mar
(M) del litoral de Caleta Crdova y tres muestras de sedimento
(S) del rea intermareal a una profundidad de 10 a 30 cm.
Los sitios de muestreo fueron tres:
El primero ubicado en la zona norte (M1 y S1; 4544,384S
6722,633W), lugar que es utilizado para recreacin en
verano.
El segundo en la zona del puerto (M2 y S2, 45 45,146S
6722,299W).
El tercero en la regin sur (M3 y S3, 4545,651S
6722,278W) donde se ubica una monoboya de carga de
petrleo.
En cada sitio se tomaron muestras en las cuatro estaciones del

ao entre el ao 2005 y 2006. Los parmetros abiticos de la
zona fueron 1600 1700 mgL-1 para cloruro, 2500 2700 mgL-
1 para sulfato, para bicarbonato 80 100 mgL-1, para calcio 360
400 mgL-1 y 1100 1200 mgL-1 para magnesio. No se

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DE SUELOS
detectaron hidrocarburos totales de petrleo (EPA 418) en las
muestras colectadas.
2. Recuentos Bacterianos.- Se realiz el recuento en placa en

medio para bacterias hetertrofas (BRN) (triptena bacteriolgica
5 g, extracto de levadura 1 g, K2HPO4 1 g, (NH4)2SO4 2 g,
agar- agar 15 g, agua de mar estril 700 mL, agua destilada 300
mL, pH 7,2). La incubacin se realiz a 28 C (Brown & Leff
1996) durante 20 das en oscuridad.
Para bacterias degradadoras de hidrocarburos (BDH) se utiliz
la tcnica de diseminacin en superficie en medio mineral con el
agregado de 30 L de una mezcla 1:1 de petrleo gasoil (MM-
PGO) por placa segn lo propuesto por Pucci y Pucci en 2003, la
temperatura de incubacin fue de 28 C por 20 das.
3. Mineralizacin de Hidrocarburos.- Se estudi mediante mi-

crocosmos, por triplicado, en frascos de vidrio de un litro de
capacidad. Se utilizaron 50 mL de agua de mar o 5 g de
sedimento en 45 mL de agua de mar estril.
Todos los microcosmos fueron inoculados con 50 L de una
solucin de nutrientes concentrada denominada HDB (K2HPO4
100 g, (NH4)2PO4 200 g, agua destilada 1000 mL, pH 7).
Como fuente de carbono se utiliz nafta al 0,05% y kerosn,
gasoil, petrleo y aceite lubricante al 0,1%. Se realizaron dos
controles, uno con el agregado de los nutrientes y otro sin
nutrientes.
El potencial de biodegradacin se determin por el dosaje del
dixido de carbono producido. Para ello se coloc un frasco
colector, dentro del microcosmo, con hidrxido de sodio para la
captura del CO2 producido por el sistema. Este se titul con

21
DE SUELOS
cido clorhdrico valorado, utilizando fenolftalena y heliantina
como indicadores del punto final.
En cada caso se realiz un control, que contena la muestra y la
solucin concentrada de nutrientes para conocer la
mineralizacin en las muestras sin el agregado de hidrocarburos.
Los sistemas se incubaron a 28 C en oscuridad durante 50 das
(Pucci et al. 2009).
Los datos graficados representan los valores de mineralizacin
del hidrocarburo ensayado, corregido por lo observado a partir
del control diseado. Con los datos de mineralizacin acumulada
se obtuvo la tasa de mineralizacin de cada sistema expresada
en miligramos de CO2 por kilogramo para sedimento o litro para
agua de mar por da.
4. Estudio de la Comunidad Bacteriana.- A 100 mL de agua de

mar se le adicion 1 mL de una solucin estril 100 veces con-
centrada de caldo BRN (triptena bacteriolgica 50 g, extracto de
levadura 10 g, K2HPO4 10 g, (NH4)2SO4 20 g, agua de mar
estril 700 mL, agua destilada 300 mL, pH 7,2).
El sedimento, 10 g, se coloc en 90 mL de caldo BRN. Para
conocer la comunidad degradadora de hidrocarburos se tom
100 mL de agua de mar o 10 g de sedimento en 90 mL de agua
de mar estril, a los que se les coloc 100 L de HDB y
hexadecano al 0,1% o fenantreno al 0,05%. Los sistemas se
realizaron por triplicado y se cultivaron 10 das a 28 C con
agitacin constante y oscuridad.
La extraccin de cidos grasos se realiz sobre el pellet
resultante de la centrifugacin a 4500 rpm de los medios de
cultivo, efectuando una saponificacin con alcohol metlico-
hidrxido de sodio-agua (150 mL: 45 g: 150 mL) seguida de una
metilacin con cido clorhdrico 6N y alcohol metlico (325 mL:
275 mL) y a continuacin una extraccin con n-hexano-metil

22
DE SUELOS
trbutil ter (1:1) y lavado con hidrxido de sodio-agua (10,8 g
900 mL) de acuerdo con el procedimiento del sistema de
identificacin (MIDI Newark, Del., USA). Las muestras fueron
almacenadas a -20 C hasta su anlisis.
Los cidos grasos se determinaron como metil steres por
cromatografa gaseosa usando una columna capilar Ultra 2 de
25 m de longitud, 0,2 mm de dimetro.
El anlisis se llev a cabo con un cromatgrafo HP 6890 series II
GC (inyeccin splitless; presin inicial 10 psi; programa de
temperatura: 170 288 C a 28 C/min, 288 310 C 60 C/min,
1,5 min. de permanencia a 310 C, detector por ionizacin de
llama), la integracin de los picos se efectu mediante HP 10.01
Chem Station, los cidos grasos fueron identificados utilizando
Sherlock (versin 6.0) con el estndar Agilent Calibration
standards kit for the microbial identification system.
La composicin en cidos grasos fue cal-culada como
porcentaje del rea de pico (Pucci & Pucci 2006).
5. Identificacin de Cepas Aisladas.- A partir de los recuentos

bacterianos realizados en agua de mar y en sedimentos, se
aislaron 251 cepas para su posterior identificacin por FAMEs.
Se realiz un aislamiento por estras en medio TSBA (triptena
15 g, peptona de soya 5 g, cloruro de sodio 5 g, agar 15 g,
glucosa 2,5 g, agua destilada 1000 mL, pH 7). Los aislamientos
se realizaron de todas las muestras de agua y sedimento.
La extraccin de cidos grasos se realiz sobre 40 mg de
bacterias (peso hmedo) crecidas en la tercera estra de la placa
de TSBA cultivada a 28 C durante 24 h, de acuerdo con el
procedimiento del sistema de identificacin (MIDI Newark, Del.,
USA www.midi-inc.com), segn lo publicado anteriormente
(Pucci et al. 2009).

23
DE SUELOS
6. Anlisis Estadsticos.- Los valores de mineralizacin y recuento
se analizaron utilizando anlisis de varianza (ANOVA) mediante
el programa PAST. Para el anlisis de los perfiles de FAMEs
obtenidos se realiz un estudio de componentes principales
utilizando el programa PAST.
RESULTADOS
1. Recuentos Bacterianos.- En los recuentos de bacterias no se

presentaron diferencias significativas entre los tres puntos de
toma de muestra de agua, en los dos medios de cultivo
utilizados en cada estacin (p> 0,05). Tampoco se presentaron
diferencias significativas en las cuatro estaciones para cada
punto (todos p> 0,05) siendo los valores hallados los que
frecuentemente se observan en agua de mar (Stabili & Cavallo
2004) (Tabla 1). En los sedimentos estudiados se observ un
mayor nmero de microorganismos que en las muestras de agua
de mar. El sedimento del punto de muestreo 2 fue el que mostr
los valores de bacterias hetertrofas y degradadoras de
hidrocarburos ms elevados de los tres estudiados.

24
DE SUELOS
Fuente: Rev. Per. Biol. 17(2): 237 - 244 (Agosto 2010)
2. Mineralizacin.- Los sedimentos dan un soporte a la comunidad

bacteriana (Stock et al. 2002) lo que implic que los valores de
mineralizacin fueran mayores a los de agua para los mismos
puntos (Ilustracin 5). Los valores de las mineralizaciones ms
elevados, en sedimento, se obtuvieron en el sitio 2, seguido del
sitio 3. En ambos se observ el mismo patrn estacional, con
valores ms elevados de mineralizacin en la estacin de otoo.

25
DE SUELOS
Ilustracin 5: Valor del CO2.
Acumulado al da 50 de las mineralizaciones de las muestras de agua y sedimento de

los tres sitios en todas las estaciones. Figuras (a), (c) y (e) muestras de agua de los
sitio 1, 2 y 3 respectivamente. Figuras (b), (d) y (f) corresponden a las muestras de
sedimento de los sitios 1, 2 y 3 respectivamente.
Por ltimo, el sitio 1 present su mayor valor en verano. El

hidrocarburo menos mineralizado en sedimento fue la nafta y en agua
de mar fue la nafta junto con el aceite lubricante. El sistema de control
sin nutrientes present valores de mineralizacin en el orden de 60
90 mgCO2 al cabo de los 50 das.
En agua de mar, las mineralizaciones se presentaron de forma diferente al

sedimento, los valores ms elevados se presentaron en la primavera. Para el
resto de las estaciones los valores de mineralizacin oscilaron entre 200 y
800 mgCO2kg-1 siendo la nafta y el aceite lubricante los menos utilizados en
los sitio 2 y 3. En el sitio 1, el kerosn y la nafta poseen los menores valores
de mineralizacin en otoo e invierno. La tasa de mineralizacin para los
primeros 14 das se encuentra en la Tabla 2 y muestra que el incremento de

26
DE SUELOS
produccin de CO2 es mayor de 0 a 14 das que de 15 a 50 das. Esto indica
que la produccin de CO2 a partir de los hidrocarburos ensayados se realiza
principalmente en los primeros 14 das.
3. Estudio de las Comunidades Bacterianas.- Un total de 70

cidos grasos se encontraron en las muestras de agua, del 9:0
al 20:0, encontrndose en mayor cantidad 16:1 7c, seguido de
los cidos grasos 12:0 3OH y 10:0 3OH.

27
DE SUELOS
Todos ellos son marcadores de cidos grasos de bacterias Gram
negativas (Frostegrd et al 1993, Zelles 1997 y Konopka et al.
1999).
En los sedimentos se hallaron un total de 68 cidos grasos,

siendo los mayoritarios el 16:1 7c, 10:0 3OH, 16:0 y 18:1 7c,
tambin indicadores de bacterias Gram negativas. De los cidos
grasos saturados, el 16:0 fue, en ambos tipos de muestras, el
que present los valores ms elevados, mientras que de los
cidos grasos insaturados fue el 16:1 7c. No se hallaron
cidos grasos trans, y en bajo porcentaje de observ cidos
grasos iso y anteiso que son los marcadores de bacterias Gram
positivas (Frostegrd et al. 1993, Zelles 1997).
El hallazgo de estos cidos grasos coincide con estudios

realizados en el Mar del Norte (Stock et al. 2002), donde tambin
son ms abundantes las bacterias Gram negativas. No se
detect la presencia de los cidos grasos 10 metil, que son
marcadores del grupo de los actinomices y corineformes (Atlas
2003).
Todo esto se condice con las cepas aisladas e identificadas a

partir de las muestras estudiadas (Tabla 3). El anlisis de
ordenamiento muestra que la comunidad cultivada en BRN se
agrupa en las muestras de agua (Ilustracin 6) y en las de
sedimento (Ilustracin 7), teniendo dos excepciones en el
sedimento que son la muestra de primavera del sitio 3 y de
invierno en el sitio 2.
En los dos tipos de muestras el crecimiento en presencia de

hidrocarburos produjo una dispersin de las muestras, las que
no presentaron ningn tipo de agrupamiento por sitio.

28
DE SUELOS
Ilustracin 6: Anlisis de PCA de FAME
Para las muestras de agua en los tres medios lquidos estudiados en las cuatro
estaciones, BRN, C16: hexadecano y FEN: fenantreno, P: primavera, V: verano, O:
otoo, I: invierno.
Ilustracin 7: Anlisis de PCA de FAME

29
DE SUELOS
Para las muestras de sedimento en los tres medios lquidos estudiados en las cuatro
estaciones, BRN, C16: hexadecano, y FEN: fenantreno. P: primavera, V: verano, O:
otoo, I: invierno.
4. Identificacin de Cepas.- Se aislaron 251 cepas a partir de los

diferentes sitios de toma de muestras. Se pudo identificar 124
cultivos, que pertenecieron a 24 gneros y 40 especies
diferentes (Tabla 3).
Los gneros bacterianos con mayor porcentaje de recuperacin
fueron Pseudoalteromenas, Bacillus, Psychrobacter y
Shenewanella, con un 21, 18, 13 y 6% respectivamente. Dentro
de estos cuatro gneros mencionados, las especies ms
representativas fueron Pseudoalteromonas nigrifaciens, Bacillus
atrophaeus, megaterium y pumilus, Psychrobacter immobilis y
Shewanella putrefaciens.

30
DE SUELOS
Estos microorganismos, a excepcin de Bacillus, fueron los ms
recuperados a partir de las placas utilizadas para contar
bacterias degradadoras de hidrocarburos. Las restantes 127
cepas no fueron identificadas porque su coeficiente de
identificacin fue menor al que el sistema sugiere.
Las especies bacterianas identificadas se agruparon en funcin
a los sitios de muestreo (Ilustracin 8), observndose que los
sitios donde puede encontrarse pequeas contaminaciones
accidentales, sitio 2 y 3, se ubicaron ms prximos entre s, a
excepcin de la muestra M3. Los sedimentos de los sitios 2 y 3
estuvieron asociados a grupos bacterianos con capacidad de
utilizar hidrocarburos (Pseudomona, Rhodococcus, Bacillus)
mostrando que los microorganismos que desarrollan a partir de
estos, son de similares caractersticas. El sitio de muestreo 1,
ubicado en el rea recreacional de Caleta Crdova, se encontr
ms alejado en el anlisis de componentes principales realizado.
La proximidad observada entre las muestras M1 y S1 seala que
los integrantes de la comunidad bacteriana de ambos son
similares, siendo estos muy diferentes a los microorganismos de
los dems puntos de toma de muestras, influenciado esto, por la
ausencia de contaminantes en las cercanas del sitio 1.

31
DE SUELOS
Ilustracin 8: Anlisis del Componente Principal de FAME de las identificaciones
bacterianas con los sitios.
Grupo A: Burkholderia cepacia, L. enzymogenes, K. varians, K. kristinae, R.

sphaeroides, O. anthropi, Rhodococcus, M. lylae, S.macroltabida, Pseudomona, Z.
uliginosa, Paracoccus denitrificans, Arthrobacter mysorens, Pseudoalteromonas, K. gibs,
Bacillus, Onii, Bacillus, B. pumilus, Sta. Hominis, R. capsula-tus. (A) Acinetobacter, (B)
Bacillus, (H) Halomonas, (K) Kocuria, (L) Lisobacter, (M) Micrococcus, (O)
Ochrobactrum, (P) Pseudomonas, (R) Rodobacter, (S) Sphingopyxis, (Sta)
Staphylococcus, (V) Vibrios, (Z) Zobelia.
DISCUSION
Uno de los factores que limitan la biodegradacin de hidrocarburos
derramados en ambientes marinos, es la escasa cantidad de
nitrgeno y fsforo que se encuentra en los mismos (Head &
Swannell 1999). Por este motivo, la mineralizacin determinada por
acumulacin de CO2 se llev a cabo con una fertilizacin con
nitrgeno y fsforo, para que acte positivamente sobre la
biodegradacin de los compuestos contaminantes. Los rangos de los
recuentos bacterianos observados en agua de mar (101 a 103 UFC
mL-1) coinciden con los encontrados por Zweifel y Hagsrtm en
1995 para el Mar Bltico, Mar del Norte y Mediterrneo.

32
DE SUELOS
En nuestro trabajo, las mineralizaciones obtenidas en sedimentos
fueron similares a lo observado en otros sistemas de bioremediacion
como el de Landfarming (Riis et al. 2002), indicando la capacidad de
la comunidad bacteriana para mineralizar hidrocarburos. Los valores
en agua de mar fueron menores, influenciados por la hidrofobicidad
de los hidrocarburos, que limita la utilizacin de estos ltimos por
parte de las bacterias, el sedimento da un soporte que permite un
mejor contacto entre la bacteria y el hidrocarburo.
CONCLUSIONES
Este ensayo, que se llev a cabo en un medio lquido, seleccion los
microorganismos que se adaptan ms rpidamente a las nuevas
condiciones de cultivo, estos son, generalmente, Gram negativos
(Atlas 2003). Esta es la razn por la cual se observaron cidos
grasos que marcan su presencia y no cidos grasos como los 10
metil; aunque ms tarde en los aislamientos de los recuentos se
recuperaron cepas Gram positivas.
Uno de los factores de suma importancia en la recuperacin de
ambientes marinos contaminados con hidrocarburos, es la presencia
de microorganismos con capacidad de utilizarlos como fuente de
carbono y energa (Head et al. 2006, Swannell et al. 1996);
condiciones observadas en el litoral de Caleta Crdova, en particular
en los puntos 2 y 3, donde la ocurrencia de un posible derrame de
hidrocarburos, podra metabolizarse y llevar adelante la
bioremediacion del lugar.

33
DE SUELOS
3.1.2. ANTECEDENTES NACIONALES
A. REMEDIACION DE SUELOS Y AGUAS SUBTERRANEAS POR
CONTAMINACION DE HIDROCARBUROS EN LOS TERMINALES DE
MOLLENDO Y SALAVERRY DE LA COSTA PERUANA.
RESUMEN
Se realiz el diagnstico del contexto geolgico ambiental, de los

emplazamientos, donde se encuentran ubicados los terminales de
almacenamiento de combustibles de Mollendo y Salaverry.
Los Terminales de Mollendo y Salaverry tienen en promedio un suelo
arenoso de grano fino a medio. El nivel fretico para el caso del
Terminal de Salaverry esta aproximadamente a 0.5 msnm. y para el
de Mollendo a 2.0 msnm.
Teniendo en ambos casos aguas subterrneas salobres producto de
la cercana al mar.
En los Terminales se observaron aspectos ambientales en las
instalaciones como el manipuleo de los hidrocarburos, los cuales
generaron un impacto ambiental significativo. El trabajo se centr en
establecer los criterios para la eleccin de una tcnica de remediacin
y toda la metodologa de las tcnicas elegidas para la remediacin de
suelos y aguas subterrneas contaminadas, teniendo la planificacin,
operacin, evaluacin del proceso y obtencin de resultados.
Para el Terminal de Mollendo se proyect la remediacin de suelos
contaminados con hidrocarburos, del rea X. La tcnica de
remediacin elegida fue de Solidificacin Estabilizacin
(Encapsulamiento). En este estudio se describen las tareas de
tratamiento hasta la obtencin de resultados.
Este estudio establece la metodologa para un trabajo de

remediacin. Debido al impacto ambiental y al dao a la salud
humana que genera la liberacin de sustancias al suelo, agua y aire
desde hace 3 dcadas a escala mundial surge la inquietud de sanear

34
DE SUELOS
aquellos suelos que haban sido afectados por algunos compuestos
qumicos, dando como resultado el desarrollo de una gran variedad
de tecnologas fsicas, qumicas y biolgicas.
OBJETIVOS
i. Desarrollar la evolucin del marco legal en materia
medioambiental nacional e internacional.
ii. Definir los elementos cuerpo receptores de la contaminacin por
hidrocarburos.
iii. Establecer un diagnostico Geolgico ambiental para la
remediacin de suelos y aguas subterrneas en un terminal de
almacenamiento de combustible.
iv. Definir las principales causas, formas y procesos de
contaminacin por hidrocarburo para evitar daos significativos
al medio ambiente.
v. Establecer la metodologa de remediacin para los terminales de
almacenamiento de combustibles de Mollendo y Salaverry.
vi. Establecer la planificacin y operacin de los sistemas de
remediacin seleccionados.
vii. Evaluar y optimizar los sistemas de remediacin seleccionados
para la remediacin de suelos y agua subterrnea.
viii. Verificar mediante pruebas, anlisis y ensayos el cumplimiento de
la remediacin de los terminales de Mollendo y Salaverry.

35
DE SUELOS
Ilustracin 9: Vista area del Terminal de Mollendo
METODOLOGIA
Los terminales de Salaverry y Mollendo se encuentran sobre la costa,

a escasa distancia del mar, con suelos arenosos que alojan acuferos
salobres o salados cuyas aguas no tienen uso. Se ubican en clima
rido, donde no se producen lluvias o son muy tenues y por lo tanto la
infiltracin es mnima o inexistente.
La solidificacin y estabilizacin, as como otras tcnicas tales como

el aislamiento (cobertura de una contaminacin con una capa
impermeable) se enmarcan en las tcnicas de contencin y control.
Dichas tcnicas son de uso comn para contaminaciones de grandes
dimensiones tales como las que afectan a los terminales en cuestin,
particularmente en sitios donde se continuar con la manipulacin de
contaminantes tras la remediacin.
En la solidificacin y estabilizacin, el material original es englobado

por un ligante y aditivos. Normalmente se diferencia entre micro
encapsulamiento, esto es la incorporacin de partculas individuales, y
macro encapsulamiento, es decir la incorporacin de aglomerados de

36
DE SUELOS
partculas o del cuerpo de material de modo completo. Se debe
destacar que en la prctica la divisin no es tajante.
Por medio de la solidificacin y estabilizacin se reduce la porosidad y

las vas de migracin hacia el exterior, de modo que la infiltracin de
agua se encuentre dificultada. El lavado del suelo y eventual
lixiviacin se limita a la superficie o bien a las fisuras del producto.
En este caso particular la tcnica propuesta consiste en la
solidificacin y estabilizacin mediante encapsulamiento en una matriz
de cemento y cal. Los suelos contaminados son homogeneizados con
cemento y cal con el agregado de humedad.
La hidratacin del cemento genera una estructura cristalina de

aluminio silicato clcico en cuyo interior queda atrapado el
contaminante. La cal reacciona con el suelo contaminado dando lugar
a silicato clcico, almina clcica o aluminio silicato clcico,
hidratados, que estabilizan el contaminante.
De este modo se genera un tipo de suelo-cemento, para el cual

existen las siguientes posibilidades:
Volver a ponerlo en el lugar de origen
Enviarlo a repositorio
Reutilizarlo como material de construccin (por ejemplo como
subrrasante de calles o ncleo de diques o murallas de
contencin).

37
DE SUELOS
Ilustracin 10: Mezcla Suelo Cal Cemento
En general se utiliza una mezcla donde sobre unos cien volmenes

de suelos se agregan 15 volmenes de cal y 5 volmenes de
cemento. Esta tcnica presenta una serie de ventajas entre las cuales
se deben destacar:
Disminucin de la solubilidad o bien de la lixiviacin

Disminucin de la superficie especfica
Mejora de la resistencia a la presin y de la capacidad de carga
Disminucin de la formacin de polvos
Garanta de estabilidad mecnica e integridad a largo plazo
Traspaso de substancias fluidas al estado de agregado slido
Ninguna liberacin de contaminantes en proceso bioqumicos
en curso a largo plazo o bien en procesos de degradacin.
Ninguna generacin de productos de reaccin o metabolitos
dainos.
La estabilizacin contiene an aquellos hidrocarburos
asfaltizados que no pueden ser tratados por mtodos de
bioremediacion

38
DE SUELOS
Fuente: Bustamante Ubaldo, 2007.
El suelo es dispuesto en su posicin original en capas de no ms de

30 cm, procediendo a la compactacin de cada capa mediante el
agregado de humedad y la utilizacin de rodillo o herramientas de
mano. El material se coloca y luego se compacta con las maquinas
habituales con el objeto de disminuir el volumen de poros y de esto
modo la permeabilidad del cuerpo.
Finalmente se completa la tarea nivelando la superficie del suelo
tratado.

39
DE SUELOS
Ilustracin 11: Excavacin del Sitio Contaminado
1. PLANIFICACION DE LA REMEDIACION
2. PROCESO CONSTRUCTIVO
3. CONTROL DE REMEDIACION
4. EQUIPOS Y MATERIALES

40
DE SUELOS
3.2. MARCOS CONCEPTUALES
3.2.1. SUELOS CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS

3.2.1.1. El suelo
El suelo constituye la capa superficial del manto terrestre y su

profundidad es variable. Est formado por partculas minerales, organismos
vivos, materia orgnica, agua y sales. La mayora de los componentes
provienen de la meteorizacin de rocas, descomposicin de restos vegetales y
accin de microrganismos, formando uno de los recursos naturales ms
importantes del planeta.
El suelo es un medio altamente complejo, formado, prevalentemente por

tres fases: slida (50%), lquida y gaseosa. Estas tres fases se pueden
organizar de muy diferentes formas, adquiriendo diversas proporciones para
dar lugar a centenares de tipos de suelos.
Una de las formas de clasificacin de suelos es mediante el tamao de

las partculas que forman su fase slida, tal y como se puede observar en la
tabla adjunta
Tabla: Clasificacin de suelos segn el tamao de las partculas
La materia orgnica y los compuestos minerales se organizan en el

espacio generando una estructura porosa, donde puede haber agua o aire. En
el agua contenida en estos poros hay sales minerales y nutrientes y, por lo

41
DE SUELOS
tanto, es el medio donde se puede desarrollar la actividad metablica de los
microorganismos que habitan el suelo.
Figura: Esquema de la disposicin en el espacio de los agregados

constituyentes de un suelo
3.2.1.2. Destino ambiental de los contaminantes orgnicos del suelo
La entrada de contaminantes al medio ambiente va ligada tanto a

procesos naturales como antropognicos. Como resultado de estos ltimos
(vertidos accidentales, incineracin de residuos), cada ao se liberan al
medio, grandes cantidades de compuestos qumicos orgnicos e inorgnicos.
La contaminacin de suelos es una consecuencia comn de la actividad
industrial (Ulrici, 2000).
La distribucin de los contaminantes orgnicos en el suelo est muy

condicionada por la existencia de tres fases bien diferenciadas. En relacin a
los contaminantes, estos pueden estar adsorbidos sobre las partculas, la
materia orgnica o incluso en disolucin o en forma de vapor. Los ms
hidrofbicos, como los HAPs y los aceites minerales, suelen estar adsorbidos,
mientras que los que lo son menos, suelen estar disueltos en el agua de los
poros (Mackay & Betts, 1991; Weissenfels et al., 1992).

42
DE SUELOS
En el conjunto del suelo, los contaminantes pueden verse
transformados, a causa de la accin de agentes fsicos o qumicos, o pueden
sufrir biodegradacin (Bossert & Bartha, 1984), por parte de los
microrganismos presentes en el suelo en forma de microcolonias (Harms &
Bosma, 1996). Este potencial degradador de las poblaciones microbianas
naturales es explotado por las tecnologas de biorremediacin.
3.2.1.3. Suelos contaminados por hidrocarburos
Los procesos de combustin dan lugar a un tipo de contaminacin difusa

que afecta mayoritariamente a la atmsfera, pero que a causa de procesos de
precipitacin y lixiviado se puede acumular en suelos y sedimentos (Casellas et
al., 1995). En cambio, las actividades de produccin, transporte y utilizacin de
combustibles fsiles dan lugar a emplazamientos definidos, con la posibilidad
de la existencia de un alto grado de contaminacin. Los hidrocarburos se
encuentran en el suelo en forma de mezclas complejas que suelen constituir
fases lquidas no acuosas (NAPLs, en ingls).
Los crudos de petrleo son mezclas formadas por diversos miles de

compuestos, mayoritariamente hidrocarburos, formado a partir de la fosilizacin
o diagnesis sufrida por restos orgnicos sometidos a condiciones de elevada
presin y temperatura durante millones de aos (Rosini, 1960). As mismo,
contienen derivados heteroatmicos sulfurados, nitrogeneados y oxigenados,
en menor medida, y tambin metales como hierro, vanadi, nquel, en forma de
complejos organometlicos. La composicin qumica de crudos procedentes de
diversas regiones puede presentar gran variabilidad, aunque siempre son las
mismas familias de hidrocarburos, en mayor o menor medida, las presentes en
la mezcla de compuestos.
Hidrocarburos saturados, bsicamente n-alcanos e isoprenoides pero

tambin ciclo alcanos. Contienen el nmero mximo de hidrgenos
posibles.

43
DE SUELOS
Hidrocarburos aromticos, mono (con un anillo bencnico) o policclicos
(con ms de uno) y/o con sustituyentes alquilados, representan entre un
1 y un 20% de los hidrocarburos totales en la mayora de crudos.
Compuestos polares (resinas y asfaltenos), ms pesantes, con azufre,

nitrgeno y/o oxgeno y pueden contener tambin metales.
Figura: Estructuras qumicas de diferentes componentes

mayoritarios de un crudo de petrleo.
A partir de la destilacin del crudo de petrleo, se producen diferentes

fracciones, como se puede observar en la tabla 1.2. Conocer las diferencias
entre los hidrocarburos que forman estas fracciones es imprescindible para
entender su destino ambiental y para prever la dificultad que implicara en un
proceso de biorremediacin. Estas diferencias, a nivel estructural, conducen a
diferentes comportamientos en relacin a la adsorcin a las partculas del suelo
y solubilidad en el agua, entre otros procesos que harn de la
descontaminacin, un proceso ms o menos complicado y/o costoso.

44
DE SUELOS
El crudo se destila a temperaturas crecientes y como ms elevada es la
temperatura, ms carbonos tienen los hidrocarburos que se obtienen y
diferentes sus usos as como su peligrosidad y recalcitrancia como
contaminantes.
3.2.1.3.1. Suelos contaminados por gasolina
La gasolina forma parte de la fraccin ligera del crudo de petrleo, ya

que se obtiene a entre 20 y 180C (Tabla 1.2), aunque su produccin es menos
directa que la del diesel y los fueles. Este hecho implica que los suelos
contaminados por gasolina son ricos en hidrocarburos de cadena corta (C6-
C11) y no en otros de cadena ms larga, como en el caso de suelos
contaminados por otros derivados del petrleo.
Tabla: Fracciones que se pueden obtener en la destilacin

fraccionada de un crudo de petrleo.
Los componentes ms importantes de la gasolina y, por lo tanto, los

contaminantes ms abundantes en suelos con presencia de esta substancia
son: nbutano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX,
mono y dimetilhexanos, trimetilbenzenos, metiletilbenzenos, naftalenos y
heptano, estos dos ltimos en menor grado. Entre ellos, los BTEX generan una
gran preocupacin medioambiental debido a su toxicidad y relativamente
elevada solubilidad en agua.

45
DE SUELOS
3.2.1.3.2. Suelos contaminados por disel
El diesel forma parte de la fraccin mediana del crudo de petrleo, esto

implica un rango de puntos de ebullicin entre 200 y 350C (Tabla 1.2). Dentro
del diesel se encuentran compuestos de entre 10 y 25 tomos de carbono,
aunque los ms abundantes son los que en tienen entre 15 y 17 (Figura 1.3).
En el cas de suelos contaminados por diesel, encontraremos, por lo tanto,
compuestos ms pesados que en los suelos contaminados por gasolina. Estos
compuestos son: n-alcanos e isoprenoides (parafinas), cicloalcanos (naftenos)
y aromticos. Los ms abundantes son los cicloalcanos, representando un 45%
del total de hidrocarburos del diesel. En general, los alcanos no se considera
txicos, sin embargo, los compuestos de menor peso molecular pueden causar
daos por inhalacin o por su accin como disolventes.
Figura: Perfil cromatogrfico de GC-MS, de diesel. P, pristano; F,

fitano.
3.2.1.3.3. Suelos contaminados por aceites minerales
Los aceites minerales son productos muy utilizados en motores, luces e,

incluso, como disolventes. Provienen del crudo de petrleo y se obtienen
gracias al proceso de refinado. Su composicin es una mezcla de
hidrocarburos alifticos y aromticos. Los aceites minerales se diferencian

46
DE SUELOS
entre ellos por los rangos de ebullicin de los compuestos presentes en su
estructura. Los ms pesados son ricos en compuestos de entre 25 y 40
carbonos y, por lo tanto, tienen unos rangos de temperatura de ebullicin ms
elevados que los aceites minerales ligeros, ms ricos en compuestos de entre
15 y 25 carbonos. Por otro lado, los suelos contaminados con aceites minerales
presentan un alto contenido de alcanos alifticos y cicloalcanos, que son los
hidrocarburos que tienen un papel principal en la composicin de los aceites
minerales, ya que forman parte en un 80-90%, mientras que los compuestos
aromticos solo representan entre un 10 y un 20% del total de hidrocarburos
presentes en estos suelos, como se hablar ms adelante en el captulo 3 de la
presente tesis, donde se presenta un ensayo de tratabilidad realizado a escala
de laboratorio en un suelo contaminado por aceites minerales.
3.2.1.3.4. Suelos contaminados por creosota
La creosota es un producto lquido y viscoso que se utiliza para la

conservacin de la madera, de la cual se hablar en ms profundidad durante
el captulo 4, donde se realiz un ensayo piloto en campo, con un suelo
industrial contaminado por este producto derivado del carbn.
El producto final, se obtiene por procesos de destilacin a entre 200 y

400C de alquitranes procedentes de la combustin de carbones minerales
grasosos, como la hulla. Est formada por, entre, 150 y 200 compuestos
diferentes, aunque un 85% de estos compuestos son hidrocarburos aromticos
policclicos (PAHs), un 10% son compuestos fenlicos y el 5% restante son
compuestos heterocclicos (Nestler, 1974). El 50% de los PAHs de la creosota
son de entre 2 y 3 anillos, es decir, de bajo peso molecular (Mueller et al.,
1989). Aunque, como se ver con mayor amplitud entre los captulos 5 y 8,
donde se trabaja con un suelo contaminado por creosota despus de haber
sufrido el ensayo descrito en el captulo 4, son los PAHs de mayor peso
molecular, entre 4 y 6 anillos, los que suponen un mayor reto en un posible
proceso de biorremediacin, debido a sus propiedades fsico-qumicas.
Actualmente, la fabricacin y utilizacin de creosota en Europa y Estados
Unidos est prohibida, aunque los emplazamientos contaminados son
numerosos.

47
DE SUELOS
En relacin a los suelos contaminados por creosota, los diferentes tipos
de compuestos que la forman se comportan de forma diferente. Los
compuestos fenlicos y algunos hidrocarburos heterocclicos presentan una
gran solubilidad. Este hecho causa que los contaminantes puedan ser
movilizados por el agua del suelo y puedan afectar a sistemas acuosos
colindantes con el suelo contaminado, eso incluye tanto aguas superficiales
como subterrneas. Por otro lado, los compuestos contaminantes ms voltiles
pueden disminuir su concentracin porque pasan a la atmosfera. Dentro de
este grupo destacan los HAPs de 2 anillos y los compuestos fenlicos y
heterocclicos de bajo peso molecular.
3.2.1.4. HAPs
Los hidrocarburos aromticos policclicos son compuestos qumicos

formados per dos o ms bencenos fusionados. Se conocen unos 100 tipos
diferentes de HAPs. La estructura atmica del anillo bencnico les confiere una
gran estabilidad (Dagley, 1981).
Los HAPs pueden tener diferentes orgenes, pero los dos ms

importantes son la pirolisis, que es la exposicin de molculas orgnicas a altas
temperaturas, y la petrognesis, que consiste en una exposicin a menor
temperatura pero a presiones mucho ms elevadas, durante millones de aos
(Blumer, 1976).

48
DE SUELOS
Tabla: Peso molecular (PM) y solubilidad de los 16 HAPs incluidos
en la lista de contaminantes de estudio prioritario de la EPA.
Las caractersticas fisicoqumicas de los HAPs son las que condicionan

su comportamiento, en el medio ambiente. Las dos ms importantes son la
hidrofobicidad y la recalcitrancia. Ambas aumentan como ms anillos
bencnicos presente la estructura Introduccin general 27 del hidrocarburo.
Debido a sus propiedades hidrofbicas, los HAPs tienden a adsorberse a las
superficies, hecho que dificulta su degradacin (Clements et al., 1994). Adems
de su elevada persistencia ambiental, los HAPs suponen un riesgo para la
salud pblica y en 1979 la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados
Unidos (US EPA, en ingls) incluy los 16 HAPs de 2 a 6 anillos ms
frecuentes en su lista de contaminantes de investigacin prioritaria (Keith &
Telliard, 1979).

49
DE SUELOS
Los HAPs pueden acumularse en la cadena trfica y presentan toxicidad
por inhalacin, contacto o ingestin (Eisler, 1987). Su baja hidrosolubilidad
(Tabla 1.3) los convierte en altamente liposolubles, favoreciendo su absorcin a
travs del tracto intestinal de mamferos y su rpida distribucin en los tejidos,
preferentemente en el adiposo (Twiss et al., 1999). Especialmente, los de
elevado peso molecular como el benzo(a)antraceno, criseno,
benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a)pireno,
dibenzo(a,h)antraceno e indeno(1,2,3-c,d)pireno, poseen potencial
carcinognico y mutagnico, ya que forman aductos con el ADN tras su
activacin biolgica (Goldman, 2001). De entre los 16 HAPs prioritarios de la
EPA, el benzo(a)pireno est descrito como uno de los ms potentes
carcingenos (Juhasz & Naidu, 2000); el potencial carcinognico de otros
HAPs se representa en relacin al del benzo(a)pireno, como se puede observar
en la tabla 1.3
En el captulo 5 el trabajo se centra en el benzo(a)antraceno y el criseno

(Fig 1.4) ejemplos de HAPs de cuatro anillos aromticos, durante la realizacin
de una estrategia diseada para llegar a conocer mejor las poblaciones
bacterianas presentes en el suelo contaminado por creosota asociadas a su
degradacin. Estos dos HAPs, al ser de elevado peso molecular, presentan
elevadas tasas de hidrofobicidad y de recalcitrancia.
Finalmente, a partir del captulo 6 el estudio se cierne sobre todos los

HAPs de entre 4 y 5 anillos aromticos, incluidos en la lista de los 16 ms
importantes para la EPA.

50
DE SUELOS
Figura: Estructura qumica de hidrocarburos aromticos
policclicos representativos
3.2.1.5. Marco legal
El programa CERCLA (Comprehensive Environmental Response,

Compensation and Liability Act), gestionado por la US EPA y aprobado por
parte del congreso de los Estados Unidos en 1980, fue el primero en responder
al despertar de las preocupaciones de las sociedades sobre el riesgo que
suponen los emplazamientos contaminados para la salud humana. Este
programa determina las prohibiciones y requerimientos en relacin a los sitios
contaminados y establece, por primera vez, la responsabilidad de la
contaminacin.
Casi dos dcadas despus, en 1996, la Unin Europea estableci la

directiva 96/61, con aspectos generales relacionados con la prevencin y el
control de la contaminacin. Esto oblig a los distintos pases a realizar tareas
de identificacin de los emplazamientos contaminados, con especial inters en
aquellos dedicados a actividades industriales, militares y vertederos de

51
DE SUELOS
residuos.
En Espaa, siguiendo las directrices europeas, se cre el Plan Nacional

de Recuperacin de Suelos Contaminados, que oblig a cada una de las
comunidades autnomas a realizar un inventario de los posibles
emplazamientos contaminados. A este respecto, se dict la ley de Residuos
(Ley 10/1998, del 21 de abril), apoyada en el Real Decreto 9/2005, del 14 de
enero. Factores clave, como la definicin del concepto de suelo contaminado y
de riesgo inaceptable, la realizacin de un inventario de suelos contaminados,
el listado de las actividades potencialmente contaminantes o el rgimen de
responsabilidades, se establecen por primera vez en Espaa, junto con los
niveles de referencia de los contaminantes (NGR), a partir de los cuales se
pudieran llevar a cabo los estudios de riesgo previo a la declaracin de un
suelo como contaminado.
Sin embargo tal, en la Unin Europea (UE) existen diferentes NGR

dependiendo del pas legislador, con incluso marcadas diferencias en los
valores de ciertos hidrocarburos considerados de alto riesgo por la EPA. Estas
marcadas diferencias, as como la ausencia de algunos compuestos, implican
que todava ser necesario un tiempo para completar e incluso corregir algunos
valores ya definidos. Adems no se contempla el hecho de que los
contaminantes, aun estando a una misma concentracin, pueden tener efectos
muy diferentes, dependiendo del suelo (tanto por la textura como por el
contenido en materia orgnica) y de su biodisponibilidad real.
Posteriormente, con la ley 22/2011, del 28 de julio, se matizaron en

Espaa ciertos conceptos como la determinacin de los sujetos responsables
de la contaminacin, as como las obligaciones de informacin a la que quedan
sujetos tanto los titulares de las actividades potencialmente contaminantes
como los titulares de los suelos contaminados.
Por otro lado, el marco normativo vigente en Catalunya, est

configurado, adems, por el decreto legislativo 1/2009, de 21 de julio, que
modific la ley reguladora de residuos 6/1993, de 15 de julio.

52
DE SUELOS
Una vez llevado a cabo el anlisis de riesgos, si se aconseja la
descontaminacin del suelo, hay que tener en cuenta tanto el tiempo del
proceso, como el coste econmico de las diferentes metodologas potenciales.
Desafortunadamente, con la llegada de la crisis econmica, se produjo

una grave ralentizacin de muchos trabajos de descontaminacin,
bsicamente, por razones presupuestarias. De forma un tanto contradictoria, el
gran golpe recibido por el sector inmobiliario en nuestro pas, se traduce en
menos limpieza de suelos contaminados, al existir menos proyectos
urbansticos. Este hecho se constata con la reduccin, durante el periodo 2009-
2010, de la facturacin de las empresas del sector en ms del 60% para los
trabajos de recuperacin, con respecto a aos anteriores en el estado espaol.
3.2.2. METABOLISMO MICROBIANO DE HIDROCARBUROS
La transformacin microbiana de los compuestos orgnicos va ligada a

dos procesos principales, el crecimiento y el cometabolismo. La utilizacin de
un sustrato para el crecimiento por parte de catabolismo microbiano siempre
implica el mismo principio bsico: una degradacin gradual de la molcula para
formar al final uno o ms fragmentos capaces de pasar a metabolismo central.
Durante el proceso conocido como mineralizacin, una parte de los elementos
que constituyen la materia orgnica son convertidos en productos inorgnicos
como CO2 o H2O. En algunos casos, slo una parte del sustrato es degradado,
mientras que el resto del compuesto persiste en forma parcialmente oxidada.
Por su parte, el cometabolismo se basa en la transformacin o metabolizacin
de un compuesto orgnico por un microrganismo que no es capaz de utilizarlo
como fuente de carbono y energa. De hecho, la mayora de transformaciones
cometablicas y las de degradacin parcial son producto de la baja
especificidad de algunos enzimas presentes en las rutas metablicas de
degradacin.
La biodegradacin de hidrocarburos ha sido descrita tanto en

condiciones
aerbicas como anaerbicas, aunque los procesos anaerbicos de

degradacin son ms lentos y los mecanismos bioqumicos todava no estn

53
DE SUELOS
descritos, en su mayora (Meckenstock & Mouttaki, 2011). Recientemente,
nuevas rutas de biodegradacin anaerbica, por bacterias sulfato reductoras,
han sido propuestas para el fluoreno y el fenantreno (Tsai et al., 2009). En
cambio, las rutas aerbicas para hidrocarburos alifticos y HAPs de hasta tres
anillos estn bien caracterizadas. En presencia de oxgeno, las reacciones
clave para la biodegradacin de hidrocarburos estn catalizadas por
oxigenasas tanto en hongos como en bacterias, que actan incorporando
tomos de oxgeno, procedentes de oxgeno molecular (O2), al sustrato. Las
monooxigenasas incorporan un solo tomo de oxgeno y el otro es reducido a
agua, mientras que las dioxigenasas incorporan ambos tomos de oxgeno.
Como consecuencia, se entiende que los microrganismos degradadores de
hidrocarburos, en condiciones aerbicas, requieren la presencia de oxgeno
tanto para realizar la oxidacin inicial del sustrato como al final de la cadena
respiratoria, donde su papel es de aceptor final de electrones.
3.2.2.1. Degradacin de hidrocarburos alifticos
Los n-alcanos son los compuestos alifticos que se degradan ms

rpidamente en una mezcla de hidrocarburos (Atlas, 1981). Tanto en hongos
como en bacterias, el paso clave para la biodegradacin de este tipo de
hidrocarburos es una monooxigenacin inicial de la cadena hidrocarbonada. En
funcin de la posicin en que se produce esta oxidacin, se han descrito 3
rutas metablicas distintas (Figura 1.5). En la ruta mayoritaria, la oxidacin
terminal de la molcula, para formar un grupo alcohol, va seguida de una
segunda a aldehdo y una tercera al cido graso correspondiente. Estos cidos
grasos pueden incorporarse a metabolismo central va -oxidacin, donde se
generan otros cidos grasos de cadena ms corta. Los n-alcanos de entre C10-
C20 son los ms biodegradables, ya que al aumentar su peso molecular
disminuye su solubilidad en el agua (Kremer & Anke, 1997; Watkinson &
Morgan, 1990).
Para un mismo nmero de carbonos, los alcanos ramificados, como los

isoprenoides, presentan una biodegradabilidad inferior (Alexander, 1999). De
hecho, la oxidacin de isoprenoides puede verse inhibida por la presencia de n-
alcanos (Pirnik et al., 1974). Tambin se ha descrito la degradacin de

54
DE SUELOS
cicloalcanos o compuestos que contienen un anillo aliftico en su estructura
(Trower et al., 1985).
Por otro lado, poco se conoce de la degradacin de este tipo de

hidrocarburos mediante enzimas extracelulares de hongos de podredumbre
blanca o ligninolticos, ampliamente descritos, en cambio, como capaces de
romper el anillo aromtico de los HAPs. Finalmente, enzimas como el
citocromo P450 pueden jugar un papel importante en la degradacin de
hidrocarburos alifticos, tanto en microrganismos eucariotas como procariotas
(van Beilen & Funhoff, 2005). Un ejemplo, muy bien estudiado, de asimilacin
de alcanos relacionado con el citocromo P450 se realiz con especies de
Candida. El sistema monooxigenasa requerido comprende diferentes enzimas
citocromo P450 inducidos por alcanos (Scheller et al., 1996; Seghezzi et al.,
1991).

55
DE SUELOS
Figura: Rutas de degradacin microbiana de n-alcanos (Adaptado de
(van Beilen & Witholt, 2003))
3.2.2.2. Degradacin de HAPs
En general, los compuestos aromticos se degradan con ms dificultad,

respecto a los hidrocarburos alifticos, debido a la mayor estabilidad de los
enlaces entre carbonos presentes en su estructura. Como en los alcanos, la
degradabilidad disminuye al aumentar el nmero de carbonos o anillos
aromticos (Prince et al., 2003). A pesar de su elevada estabilidad, la
capacidad de degradar compuestos aromticos se ha descrito en una gran
variedad de microrganismos, entre ellos, bacterias y hongos capaces de
degradar compuestos de entre 1 y 5 anillos aromticos (Cerniglia, 1992; Kanaly
& Harayama, 2000), debido a que es una de las estructuras qumicas ms
ampliamente distribuidas en la naturaleza, formando parte de compuestos
mono y poliaromticos, as como de compuestos ms complejos como la
lignina (Dagley, 1981).
Para desestabilizar el anillo aromtico, los microrganismos han

desarrollado una estrategia comn que consiste en la activacin mediante la
introduccin de uno o dos grupos hidroxilo, mediante reacciones catalizadas
por mono- o dioxigenasas, respectivamente (Harayama & Rekik, 1989). Las
diferentes estrategias existentes en la naturaleza pueden observarse en la
figura 1.6

56
DE SUELOS
Figura: Primeras reacciones de la degradacin y/o transformacin de los
hidrocarburos aromticos por bacterias y hongos (Adaptado de (Kstner,
2000)).
El metabolismo de los HAPs por parte de microrganismos ha sido un

tema de gran inters para varios investigadores (Bamforth & Singleton, 2005;
Cerniglia, 1992; Haritash & Kaushik, 2009; Juhasz & Naidu, 2000; Sutherland et
al., 1995).
3.2.2.2.1. Biodegradacin bacteriana de HAPs
Actualmente, numerosos gneros bacterianos han sido descritos como

degradadores de HAPs. Una gran diversidad bacteriana es capaz de degradar
los HAPs de bajo peso molecular y unos cuantos gneros (i.e. Rhodococcus,
Mycobacterium, Alcaligenes, Pseudomonas, Arthrobacter o Nocardia, entre
otros) han sido catalogados como degradadores de HAPs de elevado peso
molecular.
El principal mecanismo, que presentan la mayora de bacterias, para

degradar HAPs de forma aerbica consiste en la oxidacin del anillo bencnico
por parte de dioxigenasas para formar cis-dihidrodiol, como se puede observar

57
DE SUELOS
en la figura 1.6. Estos dihidrodioles son dehidrogenados, formando
intermediarios dihidroxilados, que pueden ser metabolizados via catecoles,
despus de entrar a metabolismo central, hasta CO2 y agua. Por su parte,
algunas bacterias pueden catalizar la degradacin de HAPs a
transdihidrodioles, mediante la accin del enzima citocromo P450
monooxigenasa, como Mycobacterium sp. (Kelley et al., 1990).
Durante las dos ltimas dcadas, se han descrito gneros bacterianos

(Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Sphingomonas,
Rhodococcus, Mycobacterium o Flavobacterium) capaces incluso de degradar
benzo(a)pireno (Aitken et al., 1998; Schneider et al., 1996) y se han propuesto
rutas metablicas donde las dioxigenasas tienen un papel principal (Schneider
et al., 1996). Finalmente, se ha descrito tambin que ciertas cepas bacterianas
pueden degradar benzo(a)pireno, de forma cometablica, cuando crecen a
partir de otra fuente de carbono (Ye et al., 1995).
3.2.2.2.2. Biodegradacin fngica de HAPs
Aunque se ha avanzado mucho durante los ltimos veinte aos, el

conocimiento actual sobre el metabolismo fngico de HAPs es mucho menor
que el referente al metabolismo bacteriano. Sin embargo, los hongos son tan
importantes como las bacterias en la biorremediacin de HAPs en ambientes
acuticos y en suelos. En los captulos 6 y 8 de la presente tesis se presentan
dos estudios llevados a cabo con el objetivo de aportar conocimiento sobre las
comunidades tanto bacterianas como fngicas en suelos contaminados por
HAPs de elevado peso molecular.
Al contrario de las bacterias, los hongos no asimilan los HAPs como

fuente de carbono y energa, as que requieren de cometabolismo para
detoxificarlos (Casillas et al., 1996). En general, los hongos son ms lentos y
menos eficientes que las bacterias en la degradacin de HAPs. Por el contrario,
la mayora de cepas bacterianas no son capaces de degradar de forma
eficiente HAPs de 4 o ms anillos bencnicos, mientras que los hongos pueden
incluso mineralizar HAPs de ms de 4 anillos aromticos. La oxidacin de
HAPs es un preludio para su asimilacin, mientras que en hongos es un primer

58
DE SUELOS
paso hacia la detoxificacin. El papel de los hongos en ecologa es muy
importante, ya que los metabolitos formados, ms polares y ms reactivos que
los productos parentales, pueden ser mineralizados o detoxificados por la
poblacin autctona bacteriana del suelo.
Se ha demostrado que varias especies fngicas pueden metabolizar

HAPs, como el zigomiceto Cunninghamella elegans, ascomicetos Aspergillus
niger y Penicillium sp., y los basidiomicetos de podredumbre blanca
Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus y
Lentinus tigrinus. Tanto Trametes versicolor como Lentinus tigrinus han sido
utilizados en distintos captulos de la presente tesis, con el objetivo de mejorar
la biodegradacin de HAPs de elevado peso molecular, teniendo en cuenta sus
capacidades metablicas.
En general, los hongos filamentosos y las levaduras forman trans-

dihidrodioles, dihidrodiol epxidos, quinonas y fenoles, a la vez que productos
conjugativos que se forman a partir del fenol (Figura 1.6). Estos productos
conjugativos no son mutagnicos, mientras que los productos oxidativos son
txicos y bioactivos. Las rutas metablicas de degradacin de HAPs por
hongos involucran diversos enzimas, como el citocromo intracelular P450 y los
extracelulares lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y lacasa, de las
cuales se hablar con ms detalle en la seccin 1.3.3.3.2 de esta introduccin.
La formacin de metabolitos hidroxilados es muy importante para la
biorremediacin, ya que incrementa la mineralizacin de dichos compuestos.
3.2.3. DEGRADACIN DE HIDROCARBUROS ALIFTICOS EN

PRESENCIA DE OXIGENO:
Los microorganismos que utilizan hidrocarburos como sustrato deben

de tener enzimas denominada monooxigenasas que son dependientes de
oxigeno. La mayora de los microorganismos en teora si son capaces de
sobrevivir en ese ambiente pueden degradar sin mas problemas hidrocarburos
de cadena mas larga. Para que sea de fcil comprensin y sin entrar en
demasiados detalles metablicos podemos decir que para que los
microorganismos puedan degradar alcanos primero deben de oxidar con

59
DE SUELOS
oxigeno el ltimo carbono de la molcula gracias al complejo multienzimtico
que no hacen mas que incorporar esta molcula de oxigeno. As se obtiene un
hidrocarburo con un grupo alcohol siendo as una molcula mas reactiva.
Mediante otras enzimas este grupo alcohol se oxida mas hasta grupo aldhedo
y finalmente carboxlico. As se obtiene una molcula similar a un cido graso y
puede ser degradado a acetil-CoA por b-oxidacin. Este proceso de oxidacin
tambin puede darse en carbonos no terminales dando lugar a dos cidos
grasos que se procesarn por b-oxidacin. Todo este proceso se puede ver
representado esquematizado en la imagen de la izquierda.
Pero como deca aunque la mayora de microorganismos en teora sean

capaces de utilizar este mecanismo pocos pueden vivir en esas condiciones.
Para hacerlo deben ser capaces de vivir en un medio muy hidrfobo como es el
petrleo. Por lo tanto para colonizar las interfases petrleo-agua tienen que
variar sustentiblemente la membrana. Adems para introducir los hidrocarburos
en la clula lo hacen va vescula. Por lo tanto si hablamos de requerimientos
genticos no solo es necesario el sistema monooxigenasa sino otros genes
que permitan variar la envoltura y formacin de esas vesculas. Por esta razn
son pocos las especias que puedan realizar esta biodegradacin. Sin duda la
especie con mas posibilidades y la mas estudiada en el campo es
Pseudomonas.

60
DE SUELOS
3.2.4. DEGRADACIN DE HIDROCARBUROS AROMATICOS EN
PRESENCIA DE OXIGENO:
En el caso de los hidrocarburos aromticos, el principal problema para

degradarlos es romper este anillo aromtico que pueden ser muy variados. Los
microorganismos que utilizan estos compuestos aromticos como fuente de
carbono ,lo que hacen es que en lugar de utilizar una enzima monooxigenasa
especfica para cada molcula diferente, utilizan unas vas bioqumicas
llamadas vias altas o perifricas que consisten en modificar los diferentes
anillos aromticos absorbidos en protocatechuate y catechol. Es decir, la gran
variedad de compuestos aromticos que se pueden encontrar son modificados
y convertidos a estas dos molculas. A partir de estas dos molculas que
convergen todos los compuestos, ya se puede llevar a cabo el rompimiento del
anillo mediante enzimas especficas. Esta segunda fase en la degradacin
seria lo que se conocera como vas bajas. La imagen de la derecha ilustra la
ruta metablica de estas vas bajas.
A nivel gnico decir que los genes que intervienen en las vas bajas
suelen encontrarse a nivel cromosmico. Sin embargo los genes que
intervienen en las vas altas debido a su gran variedad, suelen codificarse en

61
DE SUELOS
plsmidos, aumentando as la probabilidad de adquirir nuevas vas por
transferencia gnica horizontal. Por ejemplo, el plsmido TOL ( pWWO)
contiene los genes implicados en transformar el tolueno a protocatechuate o
catechol.( En el apartado de regulacin gnica se hace un esmento especial).
3.2.5. DEGRADACIN ANAERBICA:
El hecho que en todos los ambientes donde los hidrocarburos naturales

se forman el oxigeno no esta presente, ha hecho pensar a la comunidad
cientfica que los hidrocarburos no podran ser degradados anaerbicamente.
Pero a finales de 1980s se descubrieron algunos microorganismos que si
tenan cierta actividad degradadora bajo condiciones totalmente extrictas.
Este conocimiento es tan reciente que an no se comentan ni en los

libros de textos mas especializados en el tema ni siquiera la posibilidad.
Actualmente se est trabajando mucho en este inslito campo por la
importancia que tiene y las aplicaciones potenciales que pueda tener en la
biorremediacin. Hay que tener en cuenta que en la mayora de los lugares
contaminados donde se quiere aplicar estas tcnicas de biorremediacin hay
condiciones anoxignicas o de seguida se consume el oxigeno. Lo que se
hacia hasta ahora en estas situaciones es insuflar aire en estos ambientes
mediante una bomba para favorecer la degradacin aerbica. Evidentemente

62
DE SUELOS
esta tcnica hace encarecer el proceso aparte que a veces la difusin de
oxigeno no puede ser posible.
Los pocos estudios realizados hasta ahora han desvelado que los
mecanismos de degradacin en estas condiciones son totalmente diferentes a
los utilizados en presencia de oxigeno excepto la b-oxidacin que tambin se
da en condiciones anxicas. En general se dan procesos de reduccin o
condensacin con otras molculas para activar primero los compuestos.

63
DE SUELOS
CAPITULO IV: HIPOTESIS Y VARIABLES
4.1. HIPOTESIS GENERAL

La utilizacin de la bacteria Pseudomona influye significativamente en la
Biorremediacin de Suelos Contaminados con Hidrocarburos.
4.2. HIPOTESIS ESPECFICAS

El nivel de concentracin de Hidrocarburos influye
significativamente en la utilizacin de Pseudomonas en la
Biorremediacin de los Suelos contaminados.
La actividad enzimtica de la Pseudomona influye
significativamente en la Biorremediacin de Suelos Contaminados
con Hidrocarburos
4.3. IDENTIFICACION DE VARIABLES
4.3.1. Variable independiente

X: Bacteria Pseudomona.
4.3.2. Variable Dependiente

Y: Biorremediacin del Suelo Contaminado con Hidrocarburos.

64
DE SUELOS
4.4. MATRIZ DE CONSISTENCIA
TITULO: BIORREMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

UTILIZANDO LA BACTERIA Pseudomona.
PROBLEMA OBJETIVOS HIPOTESIS VARIABLES INDICADORES METODOLOGIA
PROBLEMA OBJETIVO
HIPOTESIS GENERAL VARIABLE DEPENDIENTE
GENERAL GENERAL
De qu manera la La utilizacin de la
Evaluar la utilizacin
utilizacin de bacterias bacteria Pseudomona Y: Sembrado de una
de las bacterias Calidad del Suelo
Pseudomonas ayuda influye Biorremediacin Planta Bio
Pseudomonas en la Contaminado con
a la biorremediacin significativamente en la del Suelo indicadora (maz),
biorremediacin de los presencia de
de los suelos Biorremediacin de Contaminado con asimismo que sea
suelos contaminados Hidrocarburos.
contaminados por Suelos Contaminados Hidrocarburos. tolerante.
por hidrocarburos.
hidrocarburos? con Hidrocarburos.
PROBLEMAS OBJETIVOS HIPOTESIS

VARIABLES INDEPENDIENTES
ESPECIFICOS ESPECIFICOS ESPECIFICAS
Cmo influye la Evaluar el nivel de El nivel de

Concentracin de concentracin ptima concentracin de
Hidrocarburos en la de los Hidrocarburos Hidrocarburos influye
Diversas
utilizacin de la para la utilizacin de significativamente en la
concentraciones de
Pseudomona en la la Pseudomona en la utilizacin de
Hidrocarburos
Biorremediacin de Biorremediacin de Pseudomonas en la
los Suelos los Suelos Biorremediacin de los X1: Bacteria
contaminados? contaminados. Suelos contaminados. Pseudomona.
Evaluar la influencia
La actividad enzimtica
Cmo influye la de la Actividad
de la Pseudomona
actividad enzimtica Enzimtica de la
influye
de la Pseudomona en Pseudomona en la
significativamente en la
la biorremediacin de biorremediacin de
Biorremediacin de
Suelos contaminados Suelos contaminados
Suelos Contaminados
con Hidrocarburos? con Hidrocarburos.
con Hidrocarburos
Operacionalizacin de variables
Y = X1
(Biorremediacin del = Bacteria Pseudomona
Suelo Contaminado con
Hidrocarburos)
65
DE SUELOS
CAPITULO VI: CRONOGRAMA, PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO
1.1.CRONOGRAMA
MESES
Eventos Octubre Noviembre Diciembre
Inicio de ejecucin del

x
proyecto
Toma de muestras de los

x
puntos de muestreo
Obtencin de la bacteria
x
Pseudomona
Evaluacin de las
x
caractersticas del Suelo
Medicin de la enzima
Oxigenasa con el x
Espectrofotmetro
Pruebas en laboratorio con

las distintas concentraciones
x
y Medicin de la
concentracin de amonio.
Planta Bioindicadora (maz). x
Anlisis estadsticos x
Resultado y aplicacin del

x
proyecto
Fin de ejecucin del proyecto x

66
DE SUELOS
Elaboracin propia.
1.2.PRESUPUESTOS
TOMA DE MUESTRA
Descripcin Cantidad Costo unitario Costo (S/.)
Frascos de vidrio 5 5.00 25.00
Cooler 1 ------- -------
Guantes de ltex 1 caja 5.00 5.00
Obtencin de la bacteria Pseudomona
Vaso de precipitado 100mL 3 75.00 225.00
Hielo 2 bolsas 2.00 4.00
Matraz 2 40.00 80.00
Embudo 2 30.00 60.00
probeta 3 10.00 30.00
Filtracin y Centrifugacin
Pipetas 3 10.00 30.00
Pipeteador 2 40.00 80.00
Tubos de centrifuga 6 6.00 36.00
gradilla 1 20.00 20.00
Anlisis y lectura
Espectrofotmetro 1 ------ -------
Armado de pozas y tuberas
1500.00
1 1/2 millar 1.00
Ladrillos
Tubos --- --- 500
Medicin de la concentracin de amonio
---
Microquendel 1 ----
Total 2 630.50

67
DE SUELOS
Elaboracin Propia
1.3. FINANCIAMIENTO
Sera proporcionado por los Patrocinadores.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
- APHA-American Public Health Association, Standard methods for the
examination of water and wastewater, 19th Edition (1995).
- Carmona, O.; Microbiologa, 5ta. Edicin, McGraw Hill Interamericana

(1997).
- Iaez, E., Biotecnologa, Instituto de Biotecnologa, Universidad de

Granada (2004).
- Lee, C.C. y S.D. Lin; Handbook of Environmental Engineering

Calculations, McGraw-Hill (2000).
- Reynolds T.D. y P.A. Richards; Unit operations and processes in

environmental engineering, 2da. Edicin, PWS Publisihing Co. (1996).

68
DE SUELOS
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AO DEL SERVICIO AL BUEN CIUDADANO 2017

BUENO RAMOS, Maril

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

Ilustracin 1: Aspecto de una fosa inundada con Agua y Petrleo. ............................. 15

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

1.1. TITULO DEL PROYECTO

1.2. RESPONSABLE DEL PROYECTO

1.3. ASESOR DEL PROYECTO

1.4. COLABORADORES DEL PROYECTO

Mg. Apesteguia Infantes, Jos Alfonso

1.5. TIPO DE INVESTIGACION

1.6. LUGAR DE INVESTIGACION

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

La contaminacin por hidrocarburos en suelos como resultados de

En la mayora de los casos el saneamiento de los suelos es complejo

La bioremediacion es una alternativa para disminuir la cantidad de

Palabras Claves: Bioremediar, Pseudomona, Oxigenasa e

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

2.1. SITUACION PROBLEMTICA

En nuestro pas y el mundo existen refineras de petrleo que

Sobre estos suelos contaminados, no existe informacin Estadstica

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

Por ello este trabajo de investigacin desarrollar la recuperacin de

2.2. FORMULACION DEL PROBLEMA

2.2.1. Problema General

2.2.2. Problemas Especficos

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

2.3.2. Objetivos Especficos

2.4. JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION

2.4.1. Justificacin Terica

Esta investigacin se realiza con el propsito de recuperar

La aplicacin de la biorremediacin y restauracin de

En nuestro pas ya se ha iniciado la ejecucin de proyectos

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

Las tecnologas de remediacin pueden clasificarse de

2.4.2. Justificacin Prctica

2.4.3. Justificacin Metodolgica

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

2.4.4. Justificacin Socio Econmica

2.5. IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACION

Debido a que estos microorganismos que contienen dicha

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

2.5.2. Aporte a la Tecnologa

2.5.3. Aporte Prctico

La biorremediacin de suelo contaminado con

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

2.6. ALCANCES DE LA INVESTIGACION

2.7. LIMITACIONES DE LA INVESTIGACION

CAPITULO III: MARCO TEORICO

A. USO DE LA BIORREMEDIACIN PARA EL SANEAMIENTO DE

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

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2.2. Extraccin y Disposicin de Agua Salada.- Si el agua

CURSO: CONTAMINACION Y RECUPERACION

Ilustracin 2: Excavacin de la Fosa para extraer el sustrato

3. Remocin.- El terreno impactado es excavado hasta unos 3

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Ilustracin 3: Arreglo del sustrato contaminado en pilas adyacentes al rea

4.2. Aireacin y Mezclado.- El material es removido con la

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