Departamento de Ingeniera Qumica

Diseo de Bioreactores

LABORATORIO N 2: DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ESPECFICA

ENZIMTICA (ENZIMA LIBRE) Y DE CONTENIDO DE PROTENAS.

1.- INTRODUCCIN

Como es bien sabido, las enzimas son protenas, polmeros de residuos aminoacdicos unidos
mediante enlaces peptdicos, que tiene la funcin de ser catalizadores de las reacciones qumicas
del metabolismo celular. La produccin de enzimas es seguida por una purificacin y una
estandarizacin del producto. En la formulacin del producto se agregan diversos excipientes (otras
protenas y azcares, por ejemplo), por lo que un preparado enzimtico comercial no es 100% puro.

La manera de cuantificar la enzima presente en una formulacin comercial se realiza mediante la

determinacin de su actividad enzimtica especfica (mg U.I./g enzima) y del contenido de
protenas.

El objetivo de este prctico es la determinacin de la actividad especfica enzimtica de lactasa y

del contenido de protenas de una formulacin comercial de lactasa a partir de Aspergillus Oryzae.

2.- DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ESPECFICA ENZIMTICA

Con respecto a la determinacin de la actividad de la enzima, debemos recordar que la actividad

enzimtica:
- Indica el mximo potencial cataltico de una enzima y esta dado por la velocidad inicial de la
reaccin
- La velocidad de reaccin se mide cuantificando la evolucin del producto o del sustrato de
reaccin en el tiempo, pero este ltimo es ms dificultoso ya que se utiliza en exceso y las
variaciones en corto tiempo no son notorias.
- Se determina en las mejores condiciones para la enzima (T y pH ptimo) y a concentraciones
saturantes de sustrato.
- La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de enzima que permite
catalizar 1 mol de sustrato por minuto de reaccin a las condiciones antes mencionadas.

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- La medicin de actividad se ve afectada por los siguientes factores:

Denaturacin de la enzima (por temperatura)
Reversibilidad de la reaccin enzimtica.
Inhibicin de la enzima (por producto o inhibidor externo)
Desaturacin de la enzima (baja concentracin de sustrato)
- Para evitar los tres primeros factores, la medicin se realiza a tiempos cortos; el ltimo factor
se evita al utilizar una concentracin saturante de sustrato.
- Al evitar tales problemas la velocidad de reaccin slo est condicionada por la cantidad de
enzima utilizada en la reaccin.

As, la determinacin de la actividad de lactasa de Aspergillus oryzae se realizar mediante el

siguiente protocolo:
- Adicionar en tubos de ensayo 1,8 mL de lactosa.
- Pre-Incubar durante aproximadamente 3 minutos a 53C, para llevar el sustrato a la temperatura
ptima de reaccin de la enzima.
- Adicionar 0,2 mL de la solucin de lactasa previamente diluida de una solucin stock.
- Incubar durante el tiempo de reaccin seleccionado (0, 2, 5, 10, 15 minutos).
- Detener la reaccin mediante ebullicin durante 5 minutos.
- Determinar el contenido de glucosa en la muestra mediante el mtodo de glucostat.

La determinacin de glucosa se realiza segn un Kit enzimtico Glucosa PAP liquiform, que acta
segn las siguientes reacciones:

+ 2 + 2 + 2 2

22 2 + 4 + + 42

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El procedimiento a llevar a cabo es entonces el siguiente:

- A 0,01 mL de muestra (solucin inactivada) agregar 1 mL del reactivo (en oscuridad).
- Incubar a 37C por 10 minutos (para realizar la reaccin).
- Leer el valor de la absorbancia a 505 nm, contra un blanco de agua destilada y reactivo.
- Medicin del estndar (estndar y reactivo)

La determinacin de cantidad de glucosa en la muestra se puede realizar mediante los siguientes

mtodos:

- Mtodo del punto final:

= 100

- Mtodo del factor:

100
=

=

Notas:
* Se utilizarn diferentes concentraciones de enzima para medir la actividad de sta.
* Las experiencias deben ser realizadas por duplicado.
* La solucin enzimtica debe ser realizada en buffer acetato pH 4,5 0,1 M de manera de mantener
la actividad de la enzima.

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2.- DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN PROTEICA

Para la determinacin de protenas, se utilizar el mtodo de Bradford, por ser una tcnica sencilla
y rpida para determinar enlaces peptdicos, y que presenta menor interferencias que otros mtodos
de anlisis.

El alumno deber realizar la dilucin correspondiente a partir de una solucin patrn de lactasa
(100 mg/L) y determinar su contenido en protenas segn el protocolo que se indica a continuacin:
- A 0,1 mL de muestra agregar 1 mL de reactivo Bradford (entregado por el ayudante).
- Agitar suavemente para homogeneizar la solucin y permitir la reaccin.
- Esperar por aproximadamente 15 minutos (no ms de una hora).
- Leer en espectrofotmetro a una longitud de onda de 595 nm contra un blanco de agua destilada
y reactivo.
- Interpolar el valor obtenido en la curva de calibracin (entregada por el ayudante).

*Las diluciones en este caso se pueden realizar con agua destilada.

3.- RESULTADOS FUNDAMENTALES A ENTREGAR EN EL INFORME:

1. Cada grupo deber recolectar los resultados obtenidos en las experiencias hechas por los
distintos grupos. Con estos resultados se deber hacer el informe del prctico de laboratorio.
Debern obtener de cada grupo la evolucin de la concentracin de producto (glucosa) en
el tiempo, para la concentracin especfica de enzima usada en cada grupo.

2. Con estos resultados se debern construir 2 grficas. La primera de ellas debe mostrar la
evolucin de la concentracin de producto (moles/L) en el tiempo (min) para cada una de
las concentraciones de enzima. La segunda grfica debe mostrar la evolucin de la
velocidad inicial de reaccin (moles/L.min) en funcin de las concentraciones de enzima
(mg prot/L) usadas.
3. Se deber entregar el valor de la actividad enzimtica especfica del preparado enzimtico
original, expresada en UI/mg enzima (protena).

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4. Finalmente se deber comparar el valor terico de cantidad de protena de la enzima con la

experimental.

IMPORTANTE: La concentracin de enzima que se us es de preparado enzimtico y NO de

enzima. Para obtener la concentracin de enzima considere que el preparado enzimtico contiene
un 30% en peso de enzima (el 70% restante son excipientes azcares, estabilizantes y otros) por un
lado, y por otro considerar el valor calculado mediante el Mtodo de Bradford.

El informe debe ser entregado dentro de los 15 das posteriores a la finalizacin del prctico de
laboratorio.

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