Western blot

Cuando se realiza un inmuno ensayo, a una muestra sangunea, lo que se

busca es la presencia de anticuerpos contra el VIH, esta prueba (rpida) se
realiza en una tira reactiva, en caso de ser positiva y determinarse la
presencia de anticuerpos, lo que procede es la bsqueda del virus, lo cual se
realiza, entre otras tcnicas por medio de un western blot.
1. Tomas la muestra, y separas las clulas en donde sabes que se
encuentra el virus, en este caso son los linfocitos, por lo que separas
los glbulos blancos.
2. Estas clulas, las colocas en tu tubo eppendorf, debido a la
sensibilidad, se requiere muy pocas, le agregas el buffer de carga, es
una mezcla de colorante, glicerol (para que le de peso) y una sustancia
que rompa las membranas celulares y desnaturalice protenas,
comnmente se usa el mercaptoetanol.

3. Los geles empleados son de poliacrilamida entre dos cristales planos, y

se colocan de manera vertical. Se colocan las muestras en la parte
superior. Por efecto del mercaptoetanol, las protenas desarrollan una
carga elctrica negativa, por lo que en el campo elctrico al que son
sometidas, migran al polo positivo. Se puede colocar un marcador de
peso molecular.
4. Una vez transcurrido de 2 a 3 horas, dependiendo de la separacin de
protenas que se desee y tambin de la intensidad del campo elctrico,
se saca el gel de entre los cristales, las protenas separadas en el gel se
pueden observar colocando el gel en una solucin de azul de
coomasie, aunque si se va a realizar el western blot no se debe de teir
porque con este colorante ya no se puede desteir, se puede usar uno
que se conoce como rojo de ponceau, este si se quita, pero de todos
modos no se recomienda teir el gel para western. En la figura de
abajo se ve un gel teido con azul, las bandas son las protenas y otro
con rojo.
5. El siguiente paso es transferir estas protenas hacia una membrana
(papel) de nitrocelulosa o de PVDF, en una cajita se pone el gel, se le
 coloca encima la membrana, se colocan papel filtro para poder
manipularlo, todo en forma de sndwich, y se colocan en un
dispositivo que aplique una corriente elctrica, para que las protenas
migren y por las cargas positivas que tiene la membrana se adhieran a
esta.

6. Despus de 2 horas de transferencia, se separa el sndwich,

obviamente la membrana tiene lugares en donde no se uni protena,
por lo que se bloquean incubndola con albumina o casena (esta
ltima es ms usada porque se usa leche light en polvo), para que no
vayan a interferir.
7. Se lava la membrana para quitar el exceso de leche, se pone un
anticuerpo especfico para la protena que ests buscando, en la figura
de abajo, la protena es verde, este primer anticuerpo es rojo,
normalmente es una IgG, despus de un tiempo de incubacin, lavas
para quitar la IgG que no se uni, y por ltimo colocas un anticuerpo
anti IgG, en la figura est en azul, al cual se le ha unido un detector (la
bolita roja), el cual puede ser un tomo radiactivo para que sea haga
una autoradiografa (una placa de rayos X), puede ser una enzima que,
al ponerle su sustrato, el producto enzimtico es colorido, las ms
usadas son la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rabano.
 Autoradiografia:

8. La fosfatasa alcalina desfosforila al p-nitrofenilfosfato, produciendo

una sustancia oscura que se deposita en la membrana en donde se
encuentra la enzima:
El segundo anticuerpo ya se encuentra comercialmente disponible, porque
siempre es igual. El problema es el primer anticuerpo, una vez que puedes
crear ese primer anticuerpo especfico para la protena que buscas, puedes
buscarla en cualquier muestra, por ejemplo para el VIH, se tiene los
anticuerpos para buscar algunas de sus protenas: