Vous êtes sur la page 1sur 7

UNIVERSIDAD POPUPLAR DEL CESAR

PROGRAMA: LIC. EN CIENCIAS NATURALES


AREA: LABORATORIO
MATERIA: MICROBIOLOGA GENERAL
TUTORA: IVONNE ACOSTA NIEVES

Nombres y Apellidos: Jose Galvn Jimnez, Mileydis Moreno Villafaa, Lizeth Daz Carpio, Marcela
Nieves Blanco, Adriana Lpez Len, Mara Merio Vanegas.
Grupo: 03
Fecha De Entrega: 20/10/17

ACTIVIDAD PRCTICA N. (4)


CONFECCIN DE UN EXTENDIDO PARA COLOREAR:
MORFOLOGA Y AGRUPACIONES BACTERIANAS A PARTIR DE CULTIVOS PUROS

OBJETIVO GENERAL nos puede dar una idea del posible agente
Utilizar tcnicas de coloracin para infeccioso que est causando la patologa.
diferenciar entre bacterias Gram
positivas y Gram negativas. PALABRAS CLAVES: Tincin, pared celular,
Gram positiva, Gram negativa,
OBJETIVOS ESPECFICOS peptidoglicano.
Reconocer los reactivos que se usan en la
tincin del Gram MATERIALES Y REACTIVOS
Conocer las distintas caractersticas de Microscopio
las tinciones del Gram Laminas y laminillas
Aprender tcnicas de tincin con Gram Mechero
Encontrar diferencias entre bacterias Alcohol
Gram positivas y Gram negativas Asa de punta redonda
Cristal violeta
INTRODUCCIN Lugol
Para visualizar mejor la morfologa y Cetona
agrupacin de las clulas bacterianas, es Safranina
indispensable analizar el extendido para Solucin salina
colorear de una manera correcta ya que a Medios de cultivo (S. ureus, salmonella,
pesar de que es un procedimiento basillus, E. coli)
supremamente sencillo, de obviar un solo
paso podramos tener coloraciones PROCEDIMIENTO
denominadas Gram variables, esto es un
CONFECCIN DEL FROTIS PARA
Gram de difcil interpretacin. Por otro lado,
COLOREAR
la coloracin de Gram se convierte en el
Se esteriliz el aza de punta redonda
primer paso para el diagnstico
utilizando alcohol y un mechero.
microbiolgico. El tener claridad sobre la
Sobre el porta objetos se coloc una gota
morfologa y la agrupacin de las bacterias es
de solucin salina para humedecer y
de suma importancia ya que la coloracin de
ayudar a esparcir el medio de cultivo.
Gram se convierte en una herramienta
Se procedi a tomar la muestra de S.
valiossima para el diagnstico preliminar y
ureus y se extendi sobre el porta
presuntivo de la bacteria observada ya que
objetos

Microbiologa General
Basillu

Luego se flame tres veces para la Salmonella


fijacin de la muestra.
Posteriormente se inici la tincin de
Gram. Primero se aplic generosamente
sobre la placa con S ureus el reactivo de
cristal violeta, se dej actuar durante 1
minuto y luego se le retira el exceso con
agua.
Segundo, se aplic generosamente
sobre la placa con S ureus el reactivo de
Lugol, se dej actuar durante 1 minuto y
luego se le retira el exceso con agua.
Tercero, se aplic generosamente sobre
la placa con S ureus alcohol acetona, se
dej actuar durante 30 segundos y luego
se le retira el exceso con agua. Morfologa: Bacilos
Cuarto, se aplic generosamente sobre Agrupacin: Cocobacilo, diplobacilos,
la placa con S ureus safranina, se dej empalizadas, estreptobacilo
actuar durante 30 segundos y luego se le
retira el exceso con agua.
Finalmente se procedi a llevar la Bacillus
muestra al microscopio para observar y
analizar los resultados.

Nota: El anterior procedimiento de tincin


con Gram se aplic tambin a los medios de
cultivo de Salmonella, Bacillos, y E. coli

RESULTADOS
Coloracin de Gram
S. ureus

Morfologa: Espirilo
Agrupacin: Filamento, espiroquetas y
sacacorchos

Morfologa: Coco
Agrupacin: Aislados, Diplococos,
estreptococos, estafilococos, ttrada,
sarcina
Microbiologa General
E. coli
capa de peptidoglicano, adems de dos
clases de cidos teicoicos: anclado en la cara
interna de la pared celular y unida a la
membrana plasmtica, se encuentra el cido
lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido
teicoico que est anclado solamente en el
peptidoglicano. Por el contrario, la capa de
peptidoglucano de las bacterias gram
negativas es delgada, y se encuentra unida a
una segunda membrana plasmtica exterior,
por medio de lipoprotenas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una
membrana exterior por lipoprotenas. La
membrana exterior est hecha de protena,
fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto,
Morfologa: Vibrio ambos tipos de bacterias se tien
diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el
ANLISIS DE RESULTADOS peptidoglicano, ya que es el material que
Coloracin con Gram confiere su rigidez a la pared celular
S ureus: El estafilococo ureo o estafilococo bacteriana, y las gram positivas lo poseen en
dorado es una bacteria anaerobia facultativa mucha mayor proporcin que las gram
productora de coagulada, catalasa, inmvil y negativas. La diferencia que se observa en la
no esporulada. En este procedimiento la resistencia a la decoloracin se debe a que
coloracin del Gram en S. ureus dio la membrana externa de las bacterias Gram
positivo, como se esperaba. negativas es soluble en solventes orgnicos,
Basillus: Es un gnero de bacterias en forma como por ejemplo la mezcla de
de bastn y Gram positivas. Son aerobios alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano
estrictos o anaerobios facultativos, en que posee es demasiado delgada como para
condiciones estresantes forman una poder retener el complejo de cristal
endoespora de situacin central. En este violeta/yodo que se form previamente, y
procedimiento la coloracin del Gram en por lo tanto este complejo se escapa,
Basillus tambin dio positivo, como se perdindose la coloracin azul-violcea. Por
esperaba. el contrario, las bacterias gram positivas, al
E. coli: Es un bacilo gramnegativo de la poseer una pared celular ms resistente y
familia de las enterobacterias que se con mayor proporcin de peptidoglicanos,
encuentra en el tracto gastrointestinal de no son susceptibles a la accin del solvente
humanos y animales de sangre caliente es orgnico, sino que este acta deshidratando
una bacteria anaerobia facultativa comensal. los poros, cerrndolos, lo que impide que
En este procedimiento la coloracin de pueda escaparse el complejo cristal
Gram en E. coli dio negativo, como se violeta/yodo, y manteniendo la coloracin
esperaba. azul-violeta.
Salmonella: Es un gnero bacteriano
Los fundamentos de la tcnica de Gram se perteneciente a la familia entero bactericea
basan en las diferencias entre las paredes constituido por bacilos Gram negativos
celulares de las bacterias Gram positivas y intracelulares facultativos, con flagelos
Gram negativas. La pared celular de las peritricos. Constituye un grupo importante
bacterias Gram positivas posee una gruesa de patgenos para animales y humanos. En

Microbiologa General
este procedimiento la coloracin de Gram en veces sobre la llama, con la preparacin
salmonella dio Positivo, contrario a lo que se hacia arriba, para no quemarla. Hay que
esperaba. En este caso de la tincin con procurar que el calor nunca sea excesivo,
Gram las coloraciones o resultados se pues se alteraran las estructuras de la
pueden ver alteradas o variadas por algunos bacteria: en ningn momento el
factores como; mal procedimiento en la portaobjetos, colocado sobre el dorso de la
tincin, es decir no se aplicaron la cantidad mano, debe quemar.
de reactivos necesarios, no se dej actuar la
coloracin por el tiempo preciso, no se La TINCIN SIMPLE: es la tincin en que se
aplicaron en el orden indicado etc. Tambin utiliza un solo colorante. Como colorantes
puedo verse alterada por contaminacin utilizaremos el azul de metileno o la
cruzada en el laboratorio. safranina, ambos de
Naturaleza bsica. La tcnica es la siguiente:
INVESTIGUE 1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.
2. Cubrir con colorante la preparacin y
1. Cules son los pasos que se deben dejarlo actuar durante un minuto.
realizar para confeccionar 3. Lavar suavemente con agua destilada para
correctamente un frotis para colorear a eliminar el exceso de colorante.
partir de cultivos slidos, cultivos 4. Secar al aire y observar al microscopio con
lquidos y secreciones corporales? el objetivo de inmersin (100x) Empleando el
Para observar las bacterias teidas es aceite apropiado.
necesario, en primer lugar, hacer un frotis de Esta tcnica permite observar la morfologa y
las bacterias y fijarlo. Para hacer un frotis, tamao de las bacterias, as como los
cuando se parte de un cultivo de bacterias en Tipos de agrupaciones que forman.
medio lquido, se toma una o varias cargas TINCIN DE GRAM: es la tincin diferencial
directamente con el asa y se extienden sobre ms utilizada en Bacteriologa pues permite
el portaobjetos. Si se parte de un cultivo en separar las bacterias en dos grandes grupos,
medio slido, debe depositarse previamente las Gram positivas Y las Gram-negativas. La
una gota de agua sobre el portaobjetos. A tincin de Gram requiere cuatro soluciones:
continuacin, se toma con el asa una 1. Primer colorante: Es un colorante bsico
pequea parte de la colonia y se dispersa en que en contacto con las clulas Cargadas
la gota de agua, realizndose la extensin negativamente, reacciona con ellas
como en el caso anterior. La fijacin tiene colorendolas. El ms Utilizado es el cristal
por objeto provocar modificaciones en la violeta.
composicin fsico-qumica de la bacteria 2. Solucin mordiente: Fija las tinciones y
(coagulacin de las protenas, etc.) de forma aumenta la afinidad entre el Colorante y las
que sta conserve definitivamente una clulas. Los mordientes empleados suelen
estructura similar a la que tena en vivo, sin ser sales Metlicas, cidos o bases, como,
deformarse como consecuencia de los por ejemplo, una solucin diluida de Yodo.
tratamientos a que se ver sometida durante 3. Agente decolorante: Es un disolvente
la tincin. Por otra parte la fijacin impide el orgnico, por ejemplo, alcohol acetona.
arrastre de los microorganismos al quedar 4. Colorante de contraste: Es un colorante
estos adheridos al portaobjetos y hace que la bsico de distinto color que el primer
pared celular sea ms permeable a los colorante, como, por ejemplo, la safranina.
colorantes. Para la fijacin pueden utilizarse Los dos grupos Bacterianos a los que
agentes qumicos (formol, metanol) o el anteriormente nos referamos difieren en el
calor. Nosotros emplearemos el calor, y para color con el que finalmente aparece. Las
ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres bacterias Gram positivas se teirn de azul

Microbiologa General
por el cristal violeta y no perdern esta MEDIO SLIDO
coloracin durante los pasos sucesivos. Las Flameamos el asa de siembra, tomamos, en
bacterias Gram negativas perdern la condiciones aspticas, una pequea cantidad
coloracin inicial del cristal violeta en los del cultivo bacteriano en medio slido y lo
siguientes pasos y se teirn de rosa debido transferimos a la gota de agua. Removemos
a la Safranina. La diferencia est la mezcla con el asa de siembra hasta formar
determinada por la composicin de su una suspensin homognea que quede
envoltura celular. Las bacterias Gram bastante extendida para facilitar su secado.
positivas poseen una malla de Peptidoglicano Si la muestra se toma de un cultivo en medio
en su parte ms externa, mientras que las lquido, no es necesario realizar los dos
bacterias Gram Negativas, recubriendo una primeros pasos. Tomamos con el asa de
fina capa de peptidoglicano, presentan una siembra una gota de la suspensin
Membrana externa que envuelve toda la bacteriana, la colocamos y la extendemos
clula. El mtodo de tincin es el siguiente: directamente sobre el portaobjetos.
1. Se prepara el frotis, se seca y se fija. Esperamos hasta que el lquido se evapore o
2. Se cubre con cristal violeta durante un aceleramos su evaporacin acercando el
minuto. porta a la llama del mechero, teniendo
3. Lavar suavemente con agua destilada para cuidado de no calentar demasiado el porta
eliminar el exceso de colorante. pues las clulas pueden deformarse o
4. Se traza con Lugol un minuto. El Lugol romperse.
acta como mordiente aumentando la
Afinidad del colorante por la bacteria. 2. Diga los pasos de la tcnica de
5. Lavar con agua el exceso de Lugol. coloracin de Gram
6. Se gotea alcohol-acetona de forma A. Recoger muestras para ubicarlas en el
continua hasta que la preparacin deje de microscopio.
perder color y se lava enseguida con agua B. Hacer el extendido con un palillo de
abundante. madera.
7. Se cubre la preparacin con un colorante C. Dejar secar a temperatura ambiente o
de contraste, como la safranina, durante un fijarlas utilizando un mechero.
minuto. D. Fijar la muestra con metanol durante un
8. Se lava con agua y se seca al aire, minuto o al calor (flameado tres veces
observndose a continuacin con el objetivo aproximadamente).
de inmersin. E. Agregar azul violeta (cristal violeta o
Observacin de las tinciones de bacterias al violeta de genciana) y esperar un
microscopio. minuto.
Las bacterias Gram-positivas presentarn F. Enjuagar con agua no directamente
una coloracin violeta mientras que las sobre la muestra
Gram-negativas la presentarn roja o rosa. La G. Agregar Lugol y esperar un minuto
identificacin de las bacterias Gram-positivas aproximadamente.
puede ser problemtica, solamente cuando H. Agregar alcohol acetona y esperar 30
las bacterias Gram positivas se encuentran segundos
en crecimiento exponencial (cultivos I. Enjuagar con agua.
jvenes) la reaccin es clara; en fase J. Agregue safranina o fucsina bsica, y
estacionaria (cultivos viejos) las bacterias esperar un minuto. Este tinte dejar de
Gram-positivas pueden parecer Gram- color rosado-rojizo las bacterias gram
negativas. negativas.
K. Lavar levemente con agua.

Microbiologa General
L. Para observar al microscopio ptico es Formas helicoidales:
conveniente hacerlo a 100x con aceite de Vibrio: ligeramente curvados y en forma de
inmersin. coma, juda o cacahuete.
Espirilo: en forma helicoidal rgida o en
3. Por qu razn no debe sobrecalentarse forma de tirabuzn.
el extendido en el proceso de su Espiroqueta: en forma de tirabuzn
fijacin? (helicoidal flexible).
El proceso de extendido no se debe
sobrecalentar, debido a que el calor podra 6. Qu bacterias no se tien con la
matar las bacterias o microorganismos a coloracin de Gram y por qu?
observar. Esto hace que no se pueda Las siguientes bacterias de naturaleza Gram
observar y analizar de manera eficaz la positivas
muestra al llevarla al microscopio.
Mycobacterias (estn encapsuladas)
4. Cul es el paso ms crtico en la Mycoplasmaas (no tienen pared)
coloracin de Gram y por qu? Formas L (perdida ocasional de la pared)
El paso ms crtico en el procedimiento de Protoplastos
esta tincin, es la decoloracin, en la cual el
complejo CV-I ser liberado de las clulas. Por ejemplo las micobacterias no se tien
Una sobre decoloracin puede resultar en la con esta coloracin debido a la pared muy
prdida del colorante primario, apareciendo rica en lpidos que poseen y por eso se
las bacterias Gram positivas como Gram utilizan otras coloraciones como ejemplo la
negativas. Una decoloracin ineficiente no de Ziehl-Neelsen. Hay microorganismos que
remover por Microbiologa General no poseen pared, como los micoplasmas, no
completo el complejo CV-I, produciendo que resistiran la decoloracin, no retendrn el
los organismos gram-negativos aparezcan violeta de genciana y siempre se van a teir
como Gram positivos del contracolor.

5. Cul es la morfologa tpica y la 7. Qu es una bacteria pleomrfica?


agrupacin de las clulas bacterianas? Son aquellas bacterias que tienen formas
La forma de las bacterias es muy variada y a variables, aunque generalmente tienen
menudo, una misma especie adopta forma bacilar. Algunas pueden presentar
distintos tipos morfolgicos, lo que se modificaciones y se las denomina
conoce como pleomorfismo. De todas pleomrfica. El pleomorfismo est
formas, podemos distinguir tres tipos relacionado a veces a la edad del cultivo y se
fundamentales de bacterias: manifiesta en bacterias sin pared celular
Coco (del griego kkkos, grano): de forma (micoplasmas). Las formas L son bacterias
esfrica. que perdieron la pared celular por una
Diplococo: cocos en grupos de dos. situacin de estrs (temperatura, presin
Tetracoco: cocos en grupos de cuatro. osmtica, etc.) pero que son capaces de
Estreptococo: cocos en cadenas. resintetizar la cuando el estrs cesa. Siendo
Estafilococo: cocos en agrupaciones la morfologa una caracterstica taxonmica,
irregulares o en racimo. es importante determinar el fenmeno de
Bacilo (del latn baculus, varilla): en forma pleomorfismo originado por las condiciones
de bastoncillo. del cultivo, para evitar falsas identificaciones.

Microbiologa General
CONCLUSIN
Con la anterior prctica de laboratorio se
reconoci que la tincin de Gram es una
prueba til y de fcil realizacin que nos
permite diferenciar las dos principales clases
de bacterias con el objeto de instaurar un
tratamiento. Adems conocimos que la
tincin de Gram es una herramienta muy til
en el laboratorio de microbiologa, siendo
ineludible conocer su fundamento y
procedimiento, para poder tener una
correcta interpretacin de los datos que nos
otorga la diferenciacin de Gram positiva y
negativa concluyendo que debido a la
estructura de sus paredes celulares tendrn
o no propiedades patolgicas diferentes.

WEBGRAFA
https://diferenciasentre.org/diferencias
-entre-gram-positivas-y-gram-
negativas/
http://www.webconsultas.com/prueba
s-medicas/tincion-de-gram-13399
https://es.wikihow.com/hacer-una-
tinci%C3%B3n-de-Gram
https://es.answers.yahoo.com/questio
n/index?qid=20110407225314AAZLGQC

Microbiologa General