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Aula

MTODOS DE DIAGNSTICO
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MICROBIOLGICO

META
Conhecer os mtodos empregados na identifica o de microrganismos pro enientes de ontes
di ersas

OBJETIVOS
o fina desta a a o a no de er
definir mtodo de diagn stico micro io gico
reconhecer a import ncia do mtodo diagn stico a ser empregado para identifica o do
microrganismo
conhecer os mtodos de diagn stico acterio gico mico gico e iro gico e mo ec ar

PR-REQUISITOS
ara acompanhar esta a a oc de er ter no es de mor o ogia fisio ogia contro e de pop a o
micro iana mecanismos de ir ncia e patogenicidade de microrganismos

Interpretao de exames microbiolgicos.


(Fontes: http://4.bp.blogspot.com/)
Microbiologia Geral

INTRODUO

O diagnstico microbiolgico o conjunto de procedimentos e tc-


nicas complementares empregadas para estabelecer a etiologia do agente
responsvel de uma doena infecciosa.
Muitos testes microbiolgicos objetivam o isolamento de microrgan-
ismos viveis, os quais devem ser levados rapidamente ao laboratrio em
transportes adequados e inoculados em meios de cultura para o crescimento
dos patgenos mais provveis. Alm disso, deve-se ter muito cuidado para
que a amostra no seja contaminada com microrganismos do ambiente ou
das mucosas do paciente.
Os mtodos de diagnstico podem ser diretos, que demonstram o
agente, seus metablitos ou componentes antignicos nos uidos orgnicos
e, indiretos, que consistem na demonstrao do efeito que o agente causou
em seu contato com o sistema imunocompetente do hospedeiro.
Os laboratrios de Bacteriologia que, a partir das amostras cole-
tadas, isolam e identicam bactrias, atualmente esto comprometidos com
a caracterizao fenotpica e genotpica das cepas visando contribuir com
a epidemiologia das mesmas.
A Micologia, rea da microbiologia que estuda os fungos microscpicos
est avanando e ganhando muita importncia na medicina. Atualmente,
Micologia mdica est passando por um perodo de rpido crescimento. Os
fungos esto sendo utilizados para o esclarecimento de muitos processos
moleculares, genticos e biolgicos comuns a todos os seres vivos; servindo
como modelo para estudar diferenciao e adaptao hospedeiro-parasita.
A necessidade da rpida identicao dos fungos em material clnico foi
parcialmente incrementada com o desenvolvimento de sondas moleculares
especcas, e atualmente h uma nfase na descoberta de novos agentes
antifngicos e de novas estratgias teraputicas para o tratamento de um
nmero cada vez maior de infeces fngicas.
Os laboratrios de Virologia objetivam identicar o vrus responsvel
pela infeco, denir o processo patolgico, monitorar a doena do ponto
de vista epidemiolgico e, orientar mdicos e pacientes.
A preparao do material de laboratrio para utilizao em anlises
microbiolgicas envolve todas as atividades necessrias para garantir que
os frascos, utenslios, instrumentos e vidraria, destinados ao contato com as
amostras de alimentos, encontrem-se totalmente limpos, estreis e isentos
de resduos qumicos e orgnicos, no momento das anlises. Esse trabalho
envolve as atividades de descontaminao, descarte de resduos contami-
nados, lavagem, acondicionamento e esterilizao.

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Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

DIAGNSTICO BACTERIANO

O diagnstico bacteriolgico pode ser realizado por diversos procedi-


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mentos, sendo que o diagnstico de certeza realizado pelo isolamento
e identicao do agente bacteriano a partir de materiais coletados ad-
equadamente, conhecido normalmente como exame bacteriolgico ou
cultura. Outros mtodos podem ser utilizados para o diagnstico como
a demonstrao das bactrias por tcnicas de colorao; de antgenos por
mtodos imunolgicos; pesquisa de genes bacterianos especcos; pesquisa
de anticorpos e resposta imunolgica celular. Os procedimentos que uti-
lizam mtodos para a demonstrao do agente, diretamente em material
clnico, embora sejam presuntivos, apresentam grande interesse por serem
geralmente rpidos e dispensarem tcnicas de cultivo.

ISOLAMENTO
O processamento inicial da amostra clnica para o exame bacteriolgico
um procedimento que envolve vrias consideraes. Deve-se primeiro
avaliar a amostra e a sua origem anatmica. Esses dados determinaro qual
o melhor tratamento da amostra antes da inoculao como, por exemplo,
centrifugao ou homogeneizao, conservao, entre outras. A segunda
etapa a seleo do meio de cultura a ser empregado para cada amostra e,
por nal, a escolha da temperatura e atmosfera de incubao.
Os procedimentos realizados para o processamento das amostras devem
ser realizados dentro de uma capela de uxo-laminar com nvel de segurana
biolgica. A preservao da amostra quanto manuteno da umidade e do
pH imprescindvel para manter a viabilidade dos microrganismos. Vrios
meios de transporte esto disponveis para o uso. A escolha depender do
tipo da amostra clnica e do provvel agente microbiano.
A temperatura e atmosfera (atm) de incubao so dois fatores im-
portantes a serem considerados para que se tenha sucesso no isolamento e
identicao do microrganismo. Geralmente a temperatura de incubao
utilizada para a maioria dos microrganismos patognicos ao homem gira em
torno de 35 a 37C. Quanto atm, as bactrias podem ser aerbias estritas,
aerbias facultativas, microaerlas ou anaerbias estritas. Para a escolha
da atmosfera a ser empregada , portanto, fundamental o conhecimento
dos microrganismos que provavelmente podero estar numa dada amostra
clnica. Alguns so bastante sensveis a variaes de temperatura e atm, por
exemplo, Neisseria gonorrhoeae. Algumas bactrias podem ser enriquecidas
a 4C, como Listeria monocitogenes e Yersinia enterocolitica. A tempera-
tura pode tambm ser um fator seletivo; por exemplo, para o isolamento
de Campylobacter jejuni das fezes, utiliza-se 42C como temperatura de
incubao, inibindo assim outras espcies de Campylobacter que no so

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Microbiologia Geral

termoflicas. Para a obteno de atm de microaerolia (menos que 6% de


O2) ou anaerobiose, vrios procedimentos podem ser utilizados. No labo-
ratrio clnico, o mais prtico o uso de jarras de anaerobiose, utilizando-se
envelopes que possuem geradores de CO2 e H2 na concentrao necessria
para uma ou outra atm. E importante salientar que o uso de jarra de vela
fornece uma concentrao de 3% CO2, apenas.

DEMONSTRAO DIRETA

MICROSCOPIA

MICROSCOPIA TICA COM ILUMINAO DIRETA

A identicao do patgeno a partir de material clnico deve ser iniciada


pelo exame microscpico da amostra clnica. A demonstrao direta do
agente tem como objetivo vericar as caractersticas morfolgicas e enu-
merar microrganismos e clulas eucariticas; pode auxiliar o microbiologista
na escolha dos meios de cultura mais indicados e ao mdico, a melhor tera-
pia emprica a ser ministrada. Observaes importantes como a qualidade
da amostra clnica e a intensidade da resposta inamatria, vericada pela
presena de um inltrado de polimorfonucleares, podem ser visualizadas.
Para visualizao do material celular e microrganismo torna-se ne-
cessrio o emprego de corantes, uma vez que os mesmos so freqente-
mente transparentes. A observao direta das amostras clnicas em diversas
montagens a fresco, entre lminas e lamnulas, d informaes quanto
composio celular, morfologia do microrganismo e motilidade. As amostras
podem ser observadas por microscpio ptico de luz direta, de contraste de
fase ou de campo escuro. As caractersticas morfo-tintoriais, a disposio
e a quantidade de microrganismos do informaes preliminares quanto
identicao e importncia deles na amostra.

EXAME A FRESCO

O exame a fresco de espcimes clnicas pouco espessas possvel


por meio de montagem com soluo siolgica, como no exame de se-
crees vaginais para a identicao de fungos, leuccitos e clulas indica-
doras. Soluo de KOH a 10% empregada para claricao de fungos
em amostras clnicas. A pesquisa de microrganismos capsulados, como
Cryptococcus neoformans em lquor cefalor-raquidiano, realizada por
colorao com tinta da china. Corantes como azul-de-metileno podem ser
utilizados em amostras de fezes para deteco de leuccitos, identicao

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Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

de grnulos metacromticos de Corynebacterium diphtheriae e verica-


o da presena de microrganismos fusiformes e espiroquetas a partir de
material de infeces orais.
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COLORAO DE GRAM
o mtodo de colorao diferencial mais utilizado em exames diretos
ao microscpio de amostras clnicas e a partir de colnias bacterianas, devido
ao seu largo espectro de colorao, que inclui a maioria das bactrias, muitos
fungos e parasitas, tais como Trichomonas, Strongyloides e cistos de vrios
protozorios. As excees signicantes incluem Treponema, Mycoplasma,
Chlamydia e Rickettsia, por serem pequenos demais para a visualizao em
microscopia ptica de luz direta ou por no terem parede.
A colorao de Gram permite dividir as bactrias em dois grandes gru-
pos: Gram-positivas e Gram-negativas. Os Gram-positivos so aqueles que
retm o corante cristal violeta devido ao aumento na quantidade de cido
teicico e a diminuio da permeabilidade da parede celular aos solventes
orgnicos, por conterem menos lipdios na parede celular. Ao contrrio, a
parede das bactrias Gram-negativas apresenta grande quantidade de lip-
dios, o que aumenta a permeabilidade aos solventes orgnicos permitindo
a descolorao. Aps perdem, portanto, o cristal violeta, coram-se com o
corante de fundo, fuccina.

COLORAO DE BACILOS LCOOL-CIDO


RESISTENTES (BAAR)

Algumas bactrias possuem cidos graxos de cadeia longa (cido


miclico) na sua parede, que conferem impermeabilidade ao cristal violeta
a outros corantes bsicos. Para permitir a entrada de corantes primrios
nestas devem ser empregados calor ou detergentes. Uma vez dentro da clula
bacteriana, o corante no eliminado mesmo com solvente lcool-cido.
A colorao lcool-cido diferencia bactrias dos gneros Mycobacterium,
Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordona, Legionella micdadei e
cora oocistos de Cryptosporidium, lsospora, Sarcocystis e Cyclospora.
O mtodo de colorao de BAAR, conhecido por colorao de Zihel-
Neelsen constitui-se em um mtodo de grande valor diagnstico para a
pesquisa de micobactrias em diferentes materiais clnicos como o escarro,
onde a presena de BAAR fortemente sugestiva de tuberculose pulmonar.
Tal mtodo o nico recurso disponvel para o diagnstico microbiolgico
da hansenase ou lepra.

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Microbiologia Geral

MICROSCOPIA TICA COM ILUMINAO DE


CAMPO ESCURO

A microscopia em campo escuro uma das tcnicas mais usadas para o


diagnstico da slis primria. Devido ao pequeno tamanho da clula bacte-
riana de Treponema pallidum no possvel observ-la utilizando-se colo-
raes usuais, a no ser pela colorao da prata aps xao do esfregao.
Um resultado positivo em exame microscpico denitivo para slis se
a infeco por outros treponemas patognicos puder ser excluda. Isso
possvel pela observao da morfologia e motilidade da clula bacteriana.
A visualizao do treponema vivo torna-se possvel j que a iluminao
obtida pelo campo escuro aumenta a resoluo do microscpio.

DETECO DE ANTGENOS (AGS)

A pesquisa de Ags diretamente na amostra clnica ou aps o agente ter


sido isolado em cultura constitui-se em importante mtodo imunolgico
de diagnstico de doenas infecciosas, com a vantagem de ser permitir um
diagnstico rpido, alm de serem especcos e sensveis.
O teste de aglutinao mais comum o que utiliza partculas de ltex
absorvidas com anticorpos especcos contra Ags bacterianos de superfcie.
Esse mtodo tem sido utilizado na deteco de Haemophilus inuenzae,
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes e C. neo-
formans, principalmente em casos de meningites, onde o diagnstico rpido
fundamental para o sucesso do tratamento.
O teste imunolgico mais utilizado que emprega suporte slido o
ELISA (Enzyme-linked lmmunosorbent Assay). Para a deteco de Ags,
utiliza-se com maior freqncia um dos trs mtodos de ELISA de captura:
competitivo, direto ou indireto. No mtodo competitivo, Ag marcado com
enzima ou com iodo radioativo misturado amostra clnica, onde haver
uma competio entre o Ag adicionado e o presente na amostra por uma
quantidade limitada de anticorpos (Ac) ligados a uma fase slida, como
numa placa de poliestireno. Deve-se adicionar sempre um controle negativo
que ser uma amostra negativa contendo somente Ag marcado. Ags que
no se ligaram so tirados do teste por lavagens sucessivas. O resultado
dado pela diferena entre a leitura do controle negativo e da amostra clnica.
O mtodo de captura direto para a pesquisa de Ags envolve a adio
da amostra clnica a Acs especcos aderidos a uma superfcie slida.
Antgenos que no se ligaram so retirados por lavagens antes da adio
de um segundo Ac marcado (conjugado), geralmente com uma enzima.
Ensaios que utilizam a associao de Acs monoclonais com policlonais
freqentemente apresentam melhor desempenho. O mtodo indireto

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Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

similar ao direto, porm o segundo Ac no marcado e adicionado um


terceiro Ac marcado, que um Ac antiimunoglobulina. Esse teste tem-se
tornado popular, pois diferentes antgenos podem ser pesquisados com
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um mesmo conjugado. O teste indireto amplica o sinal, por isso mais
sensvel. Contudo, reaes inespeccas podem ocorrer. Esses testes tm
sido empregados para detectar a presena de diversos patgenos tais como
Chlamydia trachomatis, Rotavirus, citomegalovrus, L. pneumophila.
H ainda uma outra tcnica que utiliza anticorpos especcos marcados
com isotiocianato de uorescena. Atualmente, os laboratrios clnicos sub-
stituram essa tcnica imunolgica por outras como ELISA e aglutinao,
devido principalmente ao alto custo da manuteno do microscpio e dos
conjugados. Os mtodos de imunouorescncia direta (IFD) ou indireta
(IFI) so ainda empregados por alguns laboratrios no diagnstico, entre
outras, da slis primria, legionelose, tracoma, linfogranuloma venreo,
uretrites e cervicites por C. trachomatis.

DETECO DE CIDOS ORGNICOS

Durante o processo metablico algumas bactrias produzem substn-


cias, geralmente cidos graxos, que podem ser detectadas por cromatograa
a gs e, portanto, caracterizar a bactria em espcie ou gnero. Durante os
anos 70, vrios mtodos foram propostos com base nessa propriedade
utilizando cromatograa a gs para a identicao de Pseudomonas aerugi-
nosa, M. tuberculosis, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. e diversos
gneros de bactrias anaerbias estritas. O mtodo tem sido utilizado com
sucesso no diagnstico de septicemias (estalococos e estreptococos),
meningites (M. tuberculosis) e de artrites spticas. O alto custo do aparelho
limitado seu emprego em tais diagnsticos.

IDENTIFICAO BIOQUMICA

A identicao bioqumica emprega testes que detectam a presena


de enzimas estruturais importantes no metabolismo do microrganismo,
como catalase, fenilalanina desaminase, descarboxilases, citocromo C
oxidase; a produo de metablicos e catablicos, como indol, acetona,
cidos orgnicos e, a susceptibilidade a substncias antimicrobianas como
a novobiocina, bacitracina, optoquina, novobiocina.
Em laboratrios com grande demanda de anlises, tm sido emprega-
dos mtodos automatizados, que apresentam vantagens como a minia-
turizao das provas bioqumicas e diminuio no tempo de incubao e,
desvantagens, como ndice de probabilidade de acerto de 95%, qualidade e
quantidade do inculo. Na maioria dos sistemas automatizados, diferentes

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Microbiologia Geral

conjuntos so oferecidos para se identicar diferentes microrganismos,


que so agrupados por caractersticas semelhantes, como cocos Gram-
positivos, bacilos Gram-negativos no fermentadores, espcies da famlia
Enterobacteriaceae, entre outros.

PESQUISA DE DNA

O diagnstico microbiolgico convencional das infeces bacterianas


envolve o isolamento do microrganismo e sua caracterizao fenotpica
e bioqumica. Porm, em alguns casos, estas etapas consomem tempo,
so caras, e muitas vezes inviveis, como, por exemplo, o diagnstico de
Mycobacterium leprae e Chlamydia sp, uma vez que estas bactrias no
crescem in vitro.
Com o advento da biologia molecular, vrias tcnicas genticas de iden-
ticao bacteriana tm surgido ao longo das ltimas dcadas, permitindo
um diagnstico mais rpido, preciso e seguro.
As tcnicas moleculares de identicao bacteriana envolvem a pesquisa
de cidos nuc1icos atravs de hibridao com sondas genticas, ampli-
cao de fragmentos de cidos nuc1icos a partir de um oligonuc1eotdeo
com seqncia conhecida ou tipagem molecular.

SONDAS GENTICAS
Sondas genticas so fragmentos de ta simples de cidos nuc1icos
(DNA ou RNA), com seqncias conhecidas, que so marcadas com
enzimas, substratos antignicos, radioistopos, marcadores de anidade
ou molculas quimioluminescentes. As sondas genticas reconhecem e se
ligam com uma alta especicidade a uma sequncia complementar do ma-
terial gentico do microrganismo a ser identicado. Para que isso ocorra,
as condies da reao de hibridao devem ter elevada estringncia, com
altas temperaturas e baixas concentraes de sais, permitindo, desta forma,
que a sonda se ligue a uma seqncia perfeitamente complementar a ela.
O uso de molculas radioativas para a marcao de sondas tem sido
substitudo ao longo dos ltimos anos por outros marcadores, visando,
desta forma, a uma maior segurana para o laboratrio. Os marcadores de
anidade so os mais comumente utilizados, como a biotina e a digoxigenina,
que so incorporadas ao fragmento gentico atravs de reaes enzimticas,
conhecidas por nick translation e random-priming. Vrios mtodos para
a marcao de sondas genticas j esto disponveis comercialmente sob
a forma de kits.
As reaes de hibridao podem ocorrer sobre um suporte slido, in
situ ou em fase lquida. Nas reaes em suporte slido, as bactrias so
inoculadas em placas de meio de cultura. O suporte slido, por exemplo,

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Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

ltro de nitrocelulose, colocado sobre a superfcie do gar. Esses ltros


contendo as colnias bacterianas so submetidos a um tratamento para
lisar as bactrias, expondo e desnaturando o DNA. Ento, sob condies
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de alta estringncia, o ltro incubado com uma soluo contendo sonda
gentica para um fator que se queira pesquisar. Esta tcnica pode ser real-
izada diretamente com o cido nuc1ico do microrganismo estudado. Neste
caso, o DNA ou RNA transferido para a membrana de nitrocelulose, a
partir de gel de agarose. Estas reaes recebem o nome de Southern-blot
e Northern-blot, respecti vamente.
A hibridao in situ urna variao do mtodo de hibridao em fase
slida. Nesta tcnica, a sonda incubada com fragmentos de tecido ou
clulas ntegras, xados em lminas microscpicas. A reao de hibridao
realizada pelo mesmo mtodo de fase slida. Geralmente, o tecido a ser
pesquisado embebido em parana ou formalina, permitindo urna maior
xao da amostra. Este teste amplamente utilizado em laboratrios
clnicos na deteco e tipagem do Papilomavrus humano (HPV).
Para as reaes em fase lquida, importante que o fragmento de sonda
gentica no se auto-anele. O cido nuc1ico a ser pesquisado incubado
em soluo com a sonda, seguindo as mesmas condies de estringncia
descritas acima. Urna pequena quantidade de cido nuc1ico pode ser de-
tectada, embora timos resultados sejam obtidos quando se faz a extrao
e puricao prvia do mesmo.
Aps o nal da reao de hibridao, quando a sonda se liga ao cido
nuclico alvo, as molculas marcadoras incorporadas sonda devem ser
detectadas. Para isso, utilizam-se substncias marcadas com anidade s
molculas da sonda e, para a revelao, substratos colorimtricos ou qui-
mioluminescentes so adicionados reao. A tcnica de sondas genticas
utilizada em estudos epidemiolgicos para se pesquisar genes de virulncia
bacterianos, como, por exemplo, genes que codicam toxinas, fmbrias,
ilhas de patogenicidade, plasmdios e adesinas. O uso de sondas pode ser
empregado, tambm, para deteco direta do microorganismo da amostra
clnica, como o Papilomavrus humano, alm de C. trachomatis, G. vaginalis,
Streptococcus do grupo A, N. gonorrheae, L. pneumophila e T vaginalis,
entre outros. Alm disso, esta tcnica permite a conrmao do diagnstico
da infeco envolvendo uma variedade de microorganismos, como por
exemplo: CampyLobacter sp, Enterococcus sp, Streptococcus do grupo
B, Mycobacterium sp, Listeria monocytogenes, entre outros.

PCR

A reao da polimerase em cadeia (Polimerase Chain Reaction - PCR)


um mtodo que permite a amplicao in vitro de segmentos de DNA.
Esta tcnica foi primeiramente descrita em 1985, e, desde ento, tem sido

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Microbiologia Geral

amplamente utilizada na biologia molecular.


Para que a reao ocorra, necessria a utilizao de dois iniciadores
que se anelam diferentes, a saber: temperatura de desnaturao, geralmente
94C, permitindo que a molcula de DNA se abra; temperatura de anela-
mento, variando para cada par de iniciadores utilizados, permitindo que
os iniciadores se anelem seqncia complementar da molcula de DNA
alvo; e, nalmente, a temperatura de alongao, permitindo que a enzima
DNA polimerase estenda o fragmento. Este ciclo repetido por 25 a 40
vezes, conforme a necessidade de cada reao; a visualizao do resultado
da reao feita em gel de agarose.
Ao longo dos ltimos anos, uma srie de variaes desta tcnica foi
padronizada, permitindo sua ampla utilizao em pesquisa e diagnstico
laboratorial, como, por exemplo, na deteco de genes de virulncia, anlise
do genoma de microorganismos isolados em estudos epidemiolgicos ou
surtos e pesquisa de genes de resistncia a antibiticos.
Alguns exemplos de variaes da tcnica de PCR esto listados a seguir:
Multiplex PCR. Neste caso, so utilizados vrios pares de iniciadores,
especcos para diferentes seqncias-alvo, numa mesma reao de ampli-
cao. Este procedimento permite que vrias seqncias de uma mesma
molcula de DNA sejam lidas, ou, ainda, que mltiplos fatores de virulncia
de um mesmo patgeno seja pesquisado. No laboratrio clnico, esta met-
odologia pode ser empregada para pesquisa de Mycoplasma sp, Chlamydia
sp, Neisseria sp e alguns vrus, como Herpes simplex tipos I e lI.
Nested PCR. Nesta tcnica, duas amplicaes so realizadas: a
primeira etapa de amplicao realizada com um par de iniciadores, por 20
a 30 ciclos, e o produto desta reao transferido para outro tubo, onde uma
segunda amplicao ser realizada, tendo como molde o DNA amplicado
na primeira. Porm, na segunda amplicao, os iniciadores utilizados iro
anelar-se em uma regio mais interna do fragmento amplicado na primeira
reao, permitindo, desta forma, uma maior especicidade da reao.
RT-PCR. A tcnica de RT-PCR oferece uma maneira rpida, verstil e
extremamente sensvel de se analisar a expresso de um gene-alvo, podendo
oferecer tambm informaes semiquantitativas da expresso. Atravs
desta tcnica, o RNAm utilizado como molde para a sntese de cDNA,
transcrio pela enzima transcriptase reversa. O prximo passo envolve a
amplicao do cDNA atravs de uma reao de PCR-padro. RT-PCR
pode ser utilizado tambm para a deteco e diagnstico de RNA vrus.
PCR em tempo real. Este procedimento compreende uma amplicao
convencional de DNA, porm a deteco do resultado feita ao longo
dos ciclos de amplicaes. Para que isso ocorra, adicionada na reao
brometo de etdio ou alguma outra molcula uorescente (SYBR Green,
por exemplo), que, medida que o DNA vai sendo amplicado, vai-se
intercalando na dupla ta, resultando num aumento de uorescncia, a

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Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

qual detectada por uma luz UV acoplada ao termociclador. a uso desta


metodologia permite que o tempo para o diagnstico seja menor, alm de
diminuir, tambm. os custos do teste, uma vez que a etapa de visualizao
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em gel de agarose dispensvel. A sua aplicao envolve o diagnstico direto
da amostra clnica ou ainda a pesquisa de genes de virulncia ou resistncia
do microrganismo isolado.

MTODOS MOLECULARES DE TIPAGEM


Outros mtodos moleculares tm sido amplamente utilizados nos dias
atuais, porm no com o objetivo direto de diagnstico, mas de caracter-
izao bacteriana, permitindo a anlise de diferenas e similaridades entre
amostras bacterianas envolvidas numa mesma patologia, ou, ainda, para se
vericar a origem de cepas bacterianas envolvidas em surtos ou epidemias.
Com os dados obtidos, pode-se construir dendogramas que mostram a
similaridade existente entre amostras logeneticamente prximas.
Anlise do perfIl plasmidial. Alm do DNA cromossomal, algumas
bactrias possuem um ou mais fragmentos circulares de DNA chamados
plasmdios. Estes plasmdios, muitas vezes, contm informaes importantes
para a patogenicidade bacteriana, como, por exemplo, genes que codicam
fatores de virulncia ou genes responsveis pela resistncia a antibiticos. A
extrao dos plasmdios de uma amostra bacteriana realizada com solues
que rompem a parede bacteriana e degradam as protenas, permitindo que
as molculas de DNA circulares sejam recuperadas em solues. A anlise
, ento, realizada em gel de agarose, permitindo que diferentes amostras
sejam comparadas quanto ao seu perl plasmidial, quanto presena de
plasmdios envolvidos na patogenicidade bacteriana, ou simplesmente para
se investigar a distribuio das cepas em estudos epidemiolgicos.
Polimorsmo de tamanhos dos fragmentos de restrio (RFLP). O
DNA cromossomal e o plasmidial podem ser digeridos com endonucleases
de restrio, enzimas que cortam o DNA em posies constantes dentro
de um stio especco, geralmente de quatro a seis bases nucleotdicas.
Este corte altamente especco, permitindo que os fragmentos de DNA
resultantes sejam obtidos com reprodutibilidade, quando usada a mesma
enzima. A variao dos fragmentos gerados por uma enzima de restrio
especca denominada polimorsmo de tamanhos dos fragmentos de re-
strio (Restriction Fragment Length Polymophism - RFPL). A vi-sualizao
do perl de restrio observada em gel de agarose. Esta metodologia
permite, ainda, a realizao da tipagem molecular de fatores de virulncia
entre uma amostragem grande de bactrias.
PCR-RFLP. A tcnica de RFLP descrita acima tambm pode ser
realizada utilizando-se o fragmento de DNA amplicado aps reao de
polimerase em cadeia (PCR), possibilitando. desta forma, que o perl de

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Microbiologia Geral

restrio de um nico gene com sequncia conhecida possa ser analisado e


comparado com o perl de outras cepas ou sorogrupos bacterianos. Esta
metodologia permite a anlise de diversos genes bacterianos, por exemplo,
genes de virulncia, da agelina, da pilina, de toxinas, operons ribossmicos,
entre outros.
RAPD-PCR. Esta tcnica tambm conhecida por amplicao
randmica de DNA polimrco (Random amplication of Polimorphic
DNA - RAPD-PCR), e sua metodologia consiste na amplicao de DNA
utilizando um par de iniciadores com baixa relao de complementaridade ao
DNA alvo, gerando, assim, anelamentos imperfeitos ao longo da molcula
de DNA. A reao ocorre em condies de baixa estringncia e possvel
se obter mais de 50 fragmentos amplicados do DNA. Esta tcnica de
tipagem molecular permite a anlise do genoma de microrganismos, pos-
sibilitando sua comparao entre isolados de amostras clnicas.
Ribotipagem. Os RNA ribossmicos encontram-se associados ao
longo de todo o DNA bacteriano. Desta forma, possvel obter padres de
bandeamento quando o cromossomo clivado com enzimas de restrio.
A deteco deste polimorsmo feita com a hibridao dos fragmentos
obtidos com uma sonda de RNAr. Esta tcnica conhecida por ribotipagem,
e pode ser considerada uma variao da tcnica de RFLP, utilizando, neste
caso, sondas especcas para RNAr. H algumas vantagens em se usar este
mtodo, quando comparado com a tipagem de DNA, como, por exemplo,
os genes de RNAr aparecem em vrias cpias diferentes em stios diferen-
tes no genoma com diferentes regies de anqueamento, h uma grande
variabilidade entre os genes do RNAr 16S e 23S, alm da variabilidade das
regies entre os genes 16S e 23S. A ribotipagem permite que padres de
bandeamento resultantes possam ser comparados com espcies conhecidas
de microrganismos para determinar sua relao gentica e evolucionria.
Eletroforese de campo pulsado (PFGE). Fragmentos de DNA maiores
de 40kb no so ecientemente resolvidos em gis de agarose, submetidos a
um nico campo eltrico. Desta forma, o mtodo de eletroforese em campo
pulsado (Pulsed Field Gel Eletrophoresis - PFGE) utilizado quando se
pretende analisar fragmentos de DNA cromossomais digeridos, com alto
peso molecular. Nesta tcnica, as molculas de DNA so submetidas a
campos eltricos aplicados em duas direes alternadas, permitindo que
as molculas sejam reorientadas antes de ocorrer a migrao. Porm, para
que o mtodo seja reprodutvel, necessrio que a molcula de DNA esteja
intacta antes de ser clivada pelas enzimas de restrio. Ento, a extrao
do DNA feita aps serem imobilizadas pela xao da bactria numa
matriz de agarose antes de ser rompida. A escolha das enzimas de restrio
uma etapa importante, pois devem originar poucos fragmentos de alto
peso molecular, permitindo que todo o DNA cromossomal da bactria
possa ser analisado. Esta metodologia utilizada para tipagem de vrias

184
Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, como S. aureus, P. aeruginosa,


L. monocytogenes, entre outros.
Eletroforese de isoenzimas (MLEE). A tcnica de eletroforese de
10
enzima multilocos (Multilocus Enzyme Eletrophoresis - MLEE) uma
metodologia-padro para a anlise gentica em populaes eucariticas,
porm, nos ltimos anos, ela vem sendo utilizada para estimar a diversi-
dade gentica e a estrutura em populaes naturais de diversas espcies
bacterianas. MLEE estabeleceu base gentica para a anlise de variaes em
sorotipos e em outras caractersticas fenotpicas, alm de fornecer muitos
dados para a sistemtica e para sistemas de marcadores epidemiolgicos
de doenas infecciosas. O princpio da tcnica se baseia na deteco de
eletromorfos (variao da mobilidade) de uma enzima que pode ser igualada
com alelos dos genes estruturais correspondentes. O perl de eletromorfos
pode ser equiparado aos gentipos de multilocos cromossomais. MLEE
mede a variao allica de 20 a 40 genes de enzimas estruturais seleciona-
dos randomicamente do genoma cromossomal. Variaes na mobilidade
de uma enzima constitutiva para diferentes cepas de uma espcie podem
ser atribudas a isoenzimas ou a aloenzimas. Essa variao determinada
pela deteco das mudanas causadas por substituies de um ou mais
aminocidos, que afetam a carga eletrosttica da congurao de polipep-
tdios, originando diferentes pers de migrao das enzimas numa dada
condio de eletroforese.

DIAGNSTICO DAS INFECES FNGICAS

O diagnstico das infeces fngicas causadas por patgenos primrios


pode ser feito microscopicamente para a identicao da fase parasitria em
amostras clnicas ou por meio de cultura a partir de amostras de tecidos col-
hidos da leso. O diagnstico mais difcil quando as infeces so causadas
por agentes oportunistas ubquos. Nesse caso, o microrganismo deve ser
cultivado vrias vezes a partir de amostras coletadas em diferentes intervalos.
Os mtodos utilizados para coletar e manipular os espcimes clnicos
so muito importantes no isolamento e identicao de fungos. eminente
usar tcnicas estreis, especialmente com a superfcie da pele, unhas e plos,
que podem estar contaminados com fungos saprtas, bactrias, poeira e
restos epiteliais.
Quando o material clnico a pele, a superfcie dessa deve ser limpa
com etanol a 70% e deixada secar antes da coleta, e a seguir, raspada para
remover escamas cutneas ou plos que contenham fungos; o espcime
tratado com hidrxido de potssio a 10% para destruir os elementos
teciduais. Uma parte da amostra deve ser levada ao microscpio para se
observar a presena de hifas.

185
Microbiologia Geral

Quando se suspeita de uma etiologia infecciosa, um fragmento do tecido


doente deve ser levado ao patologista para um exame microscpico. Para
identicao denitiva do organismo, deve-se cultivar o fungo em meios
apropriados e encub-lo de 25C a 30C. Amostras de sangue, lquido cefal-
orraquidiano e de biopsia cirrgica devem ser examinadas ao microscpio
e cultivadas rapidamente para evitar desidratao, processos autolticos e
contaminao bacteriana.
O gar glicose de Sabouraud (4% de glicose, 1% de peptona, 2% de
gar, em pH 5,5) o meio de cultura mais utilizado para fungos nos labo-
ratrios. Pode-se tambm adicionar cloranfenicol para inibir a maioria das
bactrias e a ciclo-heximida para os fungos saprbicos.
Em geral, as tcnicas para identicao de leveduras so as mesmas
para bactrias. Tais tcnicas se baseiam nas propriedades bioqumicas e si-
olgicas do organismo. As leveduras so unicelulares, crescem rapidamente
e podem ser uniformemente suspensas no caldo de cultura. Entretanto,
os bolores so lamentosos, produzem condios especializados e crescem
vagarosamente; so identicados microscopicamente pelo tamanho e forma
dos condios e pela maneira como se desenvolvem. A identicao de fungos
requer uma compreenso bsica e o conhecimento de suas caractersticas
morfolgicas.

DIAGNSTICO DAS INFECES VIRAIS

Nas ltimas dcadas o diagnstico das infeces virais emergiu como


uma importante ferramenta na medicina, contribuindo de forma efetiva
na identicao do patgeno, possibilitando o tratamento da infeco. At
recentemente o diagnstico das viroses no era realizado em laboratrios
clnicos ou hospitais, pois as tcnicas utilizadas eram muito lentas e caras,
os reagentes no estavam disponveis e no se tinha ainda tratamento para
as infeces virais, limitando a utilidade dos testes diagnsticos.
A amplitude do uso dos mtodos diagnsticos tem vrias explicaes.
Primeiro, a epidemia do vrus da imunodecincia humana (HIV) e o
sucesso dos transplantes de medula ssea e de rgos slidos aumentaram
o nmero de pacientes sujeitos a infeces virais oportunistas. Segundo, o
uso dos agentes antivirais depende da deteco precisa do patgeno. Ter-
ceiro, o desenvolvimento tecnolgico (anticorpos monoclonais e ensaios de
deteco de cido nuclico) tornou o diagnstico virolgico rpido e preciso.
Alm disso, o desenvolvimento da PCR em tempo real permitiu a aplicao
de um mtodo quantitativo no diagnstico laboratorial das infeces virais.

O DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES


DIVIDIDO EM

186
Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

A. DIAGNSTICO CLSSICO, QUE INCLUI AS


10
TCNICAS

- de isolamento e identicao do vrus por meio de sistemas vivos como


ovos embrionados, culturas de clulas e em animais de laboratrio nos quais
os vrus so propagados. A colheita deve ser feita na fase aguda da doena e
o material deve ser transportado imediatamente para o laboratrio, mantido
em temperatura baixa (gelo), sem congelar uma vez que as partculas virais
apresentam instabilidade a fatores ambientais; quando remetido para locais
distantes, deve ser acondicionado em gelo seco.
- sorolgicas, por mtodos de deteco de anticorpos especcos, produ-
zidos pelo hospedeiro em resposta infeco viral.

DIAGNSTICO RPIDO, POR DETECO DIRETA


DO VRUS, ANTGENOS E GENOMAS VIRAIS.

Em laboratrios virais objetiva-se identicar o vrus responsvel pela


infeco, denir o processo patolgico, monitorar a doena do ponto de
vista epidemiolgico e orientar mdicos e pacientes.

Para conrmar o diagnstico, empregam-se os mtodos laboratoriais


descritos que se seguem.

CITOLOGIA

O exame citolgico das amostras fornece o diagnstico inicial rpido


das infeces virais que produzem efeitos citopticos como alteraes mor-
folgicas, lise celular, vacuolizao, formao de sinccio (fuso de clulas
induzida por vrus, as quais se tornam multinucleadas) e corpsculos de
incluso (alteraes histolgicas nas clulas, causadas por vrus).

MICROSCOPIA ELETRNICA
A microscopia eletrnica pode ser utilizada para detectar e identicar
alguns vrus em quantidade suciente. A adio de anticorpo vrus-especco
amostra ocasiona a agregao das partculas virais, facilitando a deteco
e identicao do vrus.

187
Microbiologia Geral

ISOLAMENTO E REPLICAO VIRAIS

Os procedimentos de isolamento e crescimento do agente infectante


so muito importantes para provar a etiologia viral. Os sintomas do paci-
ente e a histria de viagem, a estao do ano e o diagnstico presuntivo
ajudam a determinar os procedimentos adequados a serem utilizados para o
isolamento do agente viral. A seleo da amostra apropriada para a cultura
viral frequentemente complicada, pois vrios vrus podem causar a mesma
doena clnica. Logo, podem ser necessrios vrios tipos de amostras para
identicao do vrus causal. As amostras devem ser coletas inicialmente
na fase aguda da infeco, antes da interrupo da eliminao do vrus.
Quanto menor o tempo entre a coleta da amostra e seu envio ao labo-
ratrio, maior a possibilidade de isolamento do vrus. Isso ocorre porque
muitos vrus so lbeis, e as amostra tambm so suscetveis ao crescimento
de bactrias e fungos. O gelo e os meios de cultura especiais contendo
antibiticos e protenas, como a albumina srica, so as melhores maneiras
de transportar e armazenar os vrus.
Os vrus podem crescer em cultura de tecido, ovos embrionados ou
em animais embrionados. Para o crescimento dos vrus so utilizados dife-
rentes tipos de clulas em cultura tecidual. As culturas de clulas primrias
so obtidas por dissociao de rgos animais especcos com tripsina ou
colgeno e cultivadas em monocamadas ou suspenso. Essas podem ser
transferidas para se tornarem clulas secundrias. As linhagens de clulas
diplides so culturas de um nico tipo celular capazes de serem transferi-
das vrias vezes antes de sua senescncia. As linhagens de clulas tumorais
e as linhagens de clulas imortalizadas, que so respectivamente obtidas
de tumor de paciente e por mudanas causadas por vrus ou substncias
qumicas, so um nico tipo de clula que podem ser transferidas continu-
amente sem haver senescncia.

DETECO DOS VRUS

Alguns vrus crescem lentamente ou no crescem em laboratrio, ou


no causam efeitos citopticos imediatos em linhagens celulares tipicamente
utilizadas. Alguns exigem condies perigosas ao laboratorista. Esses vrus
so mais frequentemente diagnosticados com base em achados sorolgicos.
Propriedades virais caractersticas tambm podem ser usadas para iden-
ticar vrus que no induzem efeito citoptico clssico. Um exemplo disso
ocorre na interferncia heterloga, na qual um vrus impede a replicao
de outro tipo de vrus.
Pode-se identicar um vrus com base na determinao dos seguintes ttulos:
- Dose de cultura tecidual: ttulo de vrus que causa efeito citoptico em
cultura de tecido.

188
Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

- Dose letal: ttulo de vrus que mata 50% de um grupo de animais de teste.
- Dose infecciosa: ttulo de vrus que inicia um sintoma, produo de anti-
corpo ou outra resposta detectvel em 50% de um grupo de animais de teste.
10
Certos vrus podem ser eliminados intermitentemente sem que a
pessoa afetada apresente sintomas por longos perodos. O vrus tambm
pode no ser isolado de uma amostra por essa no ter sido manipulada
adequadamente, conter anticorpos neutralizantes ou ter sido obtida antes
ou aps a eliminao de vrus.
As enzimas e outras protenas podem ser detectadas atravs de meios
bioqumicos, imunolgicos e de biologia molecular. Elas podem ser sepa-
radas por eletroforese, e seus padres so utilizados para identicar e dis-
tinguir os vrus.
A deteco e o estudo de enzimas ou de suas atividades podem iden-
ticar e quanticar vrus especcos. Os anticorpos podem ser utilizados
como instrumentos especcos e sensveis. Os anticorpos monoclonais
ou monoespeccos servem para distino entre cepas virais e mutantes.
Os antgenos podem ser detectados atravs da imunoorescncia e ensaio
imunoenzimtico (EIA). Os vrus ou antgenos virais liberados de clulas
infectadas podem ser detectados pelo ensaio do imunossorvente ligado
a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e aglutinao do ltex (LA).
A estrutura do genoma e a sequncia gentica constituem importantes
caractersticas que distinguem a famlia, o tipo e a cepa de um vrus. Os
padres eletroforticos gerados por endonuclease de restrio so como
impresses genticas.
As sondas de DNA com sequncias complementares a regies espe-
ccas de um genoma viral podem ser utilizadas como instrumentos espe-
ccos e sensveis na deteco at de mesmo de vrus que no se replicam.
As sequncias genticas virais especcas podem ser detectadas atravs de
hibridizao in situ.
A reao em cadeia da polimerase (PCR), a PCR com transcriptase re-
versa (RT-PCR) e os ensaios de cadeia ramicada de DNA esto se tornando
muito importantes na deteco viral. A utilizao de primers (iniciadores)
apropriados para PCR pode amplicar milhes de vezes uma sequncia
alvo em poucas horas. Essa tcnica especialmente til para detectar vrus
latentes e integrados. A RT-PCR utiliza a transcriptase reversa de retrovrus
para converter RNA-viral em DNA e permitir a amplicao por PCR das
seqncias de cidos nuclicos virais.

SOROLOGIA ANTIVIRAL
A sorologia pode ser usada para identicar o vrus e a sua cepa ou
sorotipo, avaliar a evoluo de uma infeco e se ela primria ou uma
reinfeco, e se aguda ou crnica. Os dados so fornecidos pelo tipo e

189
Microbiologia Geral

ttulo do anticorpo e pela natureza dos antgenos. Estudos sorolgicos so


importantes para vrus de difceis crescimento e isolamento em cultura
celular ou os que causam doenas de longa durao.
A deteco de imunoglobulinas M (IgM) vrus-especcas, as quais
esto presentes durante as duas ou trs primeiras semanas, indica infeco
primria. Em uma fase posterior de infeco, quando as clulas foram lisadas
pelo vrus infectante ou pela resposta imunolgica celular, so detectados
anticorpos direcionados contra as protenas e enzimas virais intracelulares.
Os testes de neutralizao determinam os anticorpos com base no seu
reconhecimento e ligao ao vrus. O revestimento do vrus pelo anticorpo
bloqueia sua ligao s clulas indicadoras. A resposta do anticorpo de
neutralizao vrus e cepa-especca.
A presena do anticorpo antiviral no o suciente para indicar quando
a infeco ocorreu. Os resultados falso-positivos e falso-negativos podem
confundir o diagnstico. Alm disso, as reaes sorolgicas cruzadas po-
dem entre diferentes vrus podem confundir a identidade do agente infec-
cioso. O anticorpo utilizado no teste pode ser excessivamente especco e
pode ser incapaz de reconhecer outros vrus da mesma famlia, dando um
resultado falso negativo. Um bom entendimento dos sintomas clnicos e
o reconhecimento das limitaes e dos potenciais problemas dos ensaios
sorolgicos ajudam no diagnstico.

ATIVIDADES

1. Dena mtodos de diagnstico microbiolgico.


2. Descreva as vantagens e desvantagens entre duas tcnicas/mtodos de
diagnostico microbiolgico.
3. Descreva, sucintamente, os mtodos de diagnstico bacteriolgico, mi-
colgico, virolgico e molecular.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

1. importante estabelecer exatamente o signicado de Diagnstico


Microbiolgico e o que seriam os mtodos utilizados para este m.
Os acadmicos devem pesquisar mtodos e/ou tcnicas utilizadas
com o objetivo de identicao de agentes microbianos (bactrias,
fungos e vrus).
2. O acadmico dever escolher duas tcnicas/mtodos e inicialmente
descrevelas (caracteriza-las). Apois esta descrio traar parametros
de comparao, como por exemplo: especicidade, sensibilidade,
rapidez, custo, necessidades especiais de suporte tcnico, equipamentos

190
Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula

necessarios, qualicao do pessoal responsavel, importncia clnica


(conduta terapeutica) e outras.
10
3. Se voc entendeu a aula agora ca fcil fazer um resumo dos mtodos
empregados no diagnstico de bactrias, fungos e vrus.

CONCLUSO

No existe nenhum teste laboratorial perfeito. Existem muitas tcnicas


diferentes para estabelecer a presena de um microrganismo patognico em
um paciente doente. Todos os mtodos esto sujeitos a falta de preciso por
no detectarem um patgeno ou uma resposta imune quando presentes ou
por indicarem a sua presena quando na verdade o patgeno ou a resposta
imune esto ausentes. Alguns testes so mais sensveis ou mais especcos
do que outros, e as medidas de seu desempenho determinam como e quando
devem ser utilizados. Entretanto, mesmo quando um teste analisa com pre-
ciso uma determinada amostra, a simples presena de um microrganismo
na amostra ou de anticorpos contra um patgeno no soro do paciente nem
sempre indica uma infeco ativa e nem estabelece necessariamente a causa
da doena. Por esses motivos, existe sempre a necessidade de se interpretar
qualquer teste microbiolgico, independentemente das caractersticas de seu
desempenho tcnico. Na anlise nal, no h substituto para a capacidade de
interpretao do mdico em situar os resultados dos testes microbiolgicos
dentro do contexto da doena do paciente.

RESUMO
O diagnstico de microrganismos fundamental para o estabeleci-
mento de parmetros de qualidade, sanidade e conduta teraputica. Os dados
obtidos fornecem informaes epidemiolgicas que so observadas para
o estabelecimento das polticas de sade pblica, saneamento bsico e de
educao, nas escolas. Amostras coletadas so utilizadas para o isolamento
e identicao de bactrias, vrus e fungos. Os microrganismos identica-
dos so caracterizados em seus fentipos e gentipos. Tais caracterizaes
visam contribuir com o monitoramento de amostras emergentes e/ou res-
surgentes de virulncia diferenciada. A necessidade da rpida identicao
dos microrganismos em material clnico foi parcialmente incrementada com
o desenvolvimento de tcnicas moleculares como: amplicao de DNA
in vitro e sondas moleculares. Atualmente h uma nfase na descoberta de
novos agentes infecciosos, e consequentemente de novas drogas e estratgias
teraputicas para o tratamento. O sucesso do diagnstico microbiolgico
depende de diversos fatores como: escolha do material clnico adequado,
coleta apropriada, acondicionamento, armazenamento e transporte ad-

191
Microbiologia Geral

equado, pessoal tcnico treinado para a realizao do exame, estrutura


laboratorial prpria, interpretao dos resultados obtidos e elaborao de
laudo tcnico/cientico. Os exames laboratoriais devem estar de acordo
com os achados clnicos. fundamental uma boa comunicao entre o
laboratrio de realizao dos exames e o prossional solicitante. No existe
um mtodo diagnstico denitivo. Procura-se um mtodo mais sensvel,
rpido, seguro e barato, que atenda as necessidades de cada problema.

REFERNCIAS

BLACK, J. G. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. 4. Ed. Guana-


bara Koogan, 2002.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PAKER, J. Microbiologia de Brock.
10 ed. So Paulo: Printece Hall do Brasil, 2004.
MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S.; KOBAYASHI, G. S. PFALLER,
M.A. Microbiologia Mdica. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 8 ed. So
Paulo: Artmed, 2005.

192