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MTODOS DE DIAGNSTICO
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MICROBIOLGICO
META
Conhecer os mtodos empregados na identifica o de microrganismos pro enientes de ontes
di ersas
OBJETIVOS
o fina desta a a o a no de er
definir mtodo de diagn stico micro io gico
reconhecer a import ncia do mtodo diagn stico a ser empregado para identifica o do
microrganismo
conhecer os mtodos de diagn stico acterio gico mico gico e iro gico e mo ec ar
PR-REQUISITOS
ara acompanhar esta a a oc de er ter no es de mor o ogia fisio ogia contro e de pop a o
micro iana mecanismos de ir ncia e patogenicidade de microrganismos
INTRODUO
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Mtodos de diagnstico microbiolgico
Aula
DIAGNSTICO BACTERIANO
ISOLAMENTO
O processamento inicial da amostra clnica para o exame bacteriolgico
um procedimento que envolve vrias consideraes. Deve-se primeiro
avaliar a amostra e a sua origem anatmica. Esses dados determinaro qual
o melhor tratamento da amostra antes da inoculao como, por exemplo,
centrifugao ou homogeneizao, conservao, entre outras. A segunda
etapa a seleo do meio de cultura a ser empregado para cada amostra e,
por nal, a escolha da temperatura e atmosfera de incubao.
Os procedimentos realizados para o processamento das amostras devem
ser realizados dentro de uma capela de uxo-laminar com nvel de segurana
biolgica. A preservao da amostra quanto manuteno da umidade e do
pH imprescindvel para manter a viabilidade dos microrganismos. Vrios
meios de transporte esto disponveis para o uso. A escolha depender do
tipo da amostra clnica e do provvel agente microbiano.
A temperatura e atmosfera (atm) de incubao so dois fatores im-
portantes a serem considerados para que se tenha sucesso no isolamento e
identicao do microrganismo. Geralmente a temperatura de incubao
utilizada para a maioria dos microrganismos patognicos ao homem gira em
torno de 35 a 37C. Quanto atm, as bactrias podem ser aerbias estritas,
aerbias facultativas, microaerlas ou anaerbias estritas. Para a escolha
da atmosfera a ser empregada , portanto, fundamental o conhecimento
dos microrganismos que provavelmente podero estar numa dada amostra
clnica. Alguns so bastante sensveis a variaes de temperatura e atm, por
exemplo, Neisseria gonorrhoeae. Algumas bactrias podem ser enriquecidas
a 4C, como Listeria monocitogenes e Yersinia enterocolitica. A tempera-
tura pode tambm ser um fator seletivo; por exemplo, para o isolamento
de Campylobacter jejuni das fezes, utiliza-se 42C como temperatura de
incubao, inibindo assim outras espcies de Campylobacter que no so
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DEMONSTRAO DIRETA
MICROSCOPIA
EXAME A FRESCO
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IDENTIFICAO BIOQUMICA
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PESQUISA DE DNA
SONDAS GENTICAS
Sondas genticas so fragmentos de ta simples de cidos nuc1icos
(DNA ou RNA), com seqncias conhecidas, que so marcadas com
enzimas, substratos antignicos, radioistopos, marcadores de anidade
ou molculas quimioluminescentes. As sondas genticas reconhecem e se
ligam com uma alta especicidade a uma sequncia complementar do ma-
terial gentico do microrganismo a ser identicado. Para que isso ocorra,
as condies da reao de hibridao devem ter elevada estringncia, com
altas temperaturas e baixas concentraes de sais, permitindo, desta forma,
que a sonda se ligue a uma seqncia perfeitamente complementar a ela.
O uso de molculas radioativas para a marcao de sondas tem sido
substitudo ao longo dos ltimos anos por outros marcadores, visando,
desta forma, a uma maior segurana para o laboratrio. Os marcadores de
anidade so os mais comumente utilizados, como a biotina e a digoxigenina,
que so incorporadas ao fragmento gentico atravs de reaes enzimticas,
conhecidas por nick translation e random-priming. Vrios mtodos para
a marcao de sondas genticas j esto disponveis comercialmente sob
a forma de kits.
As reaes de hibridao podem ocorrer sobre um suporte slido, in
situ ou em fase lquida. Nas reaes em suporte slido, as bactrias so
inoculadas em placas de meio de cultura. O suporte slido, por exemplo,
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PCR
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CITOLOGIA
MICROSCOPIA ELETRNICA
A microscopia eletrnica pode ser utilizada para detectar e identicar
alguns vrus em quantidade suciente. A adio de anticorpo vrus-especco
amostra ocasiona a agregao das partculas virais, facilitando a deteco
e identicao do vrus.
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- Dose letal: ttulo de vrus que mata 50% de um grupo de animais de teste.
- Dose infecciosa: ttulo de vrus que inicia um sintoma, produo de anti-
corpo ou outra resposta detectvel em 50% de um grupo de animais de teste.
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Certos vrus podem ser eliminados intermitentemente sem que a
pessoa afetada apresente sintomas por longos perodos. O vrus tambm
pode no ser isolado de uma amostra por essa no ter sido manipulada
adequadamente, conter anticorpos neutralizantes ou ter sido obtida antes
ou aps a eliminao de vrus.
As enzimas e outras protenas podem ser detectadas atravs de meios
bioqumicos, imunolgicos e de biologia molecular. Elas podem ser sepa-
radas por eletroforese, e seus padres so utilizados para identicar e dis-
tinguir os vrus.
A deteco e o estudo de enzimas ou de suas atividades podem iden-
ticar e quanticar vrus especcos. Os anticorpos podem ser utilizados
como instrumentos especcos e sensveis. Os anticorpos monoclonais
ou monoespeccos servem para distino entre cepas virais e mutantes.
Os antgenos podem ser detectados atravs da imunoorescncia e ensaio
imunoenzimtico (EIA). Os vrus ou antgenos virais liberados de clulas
infectadas podem ser detectados pelo ensaio do imunossorvente ligado
a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e aglutinao do ltex (LA).
A estrutura do genoma e a sequncia gentica constituem importantes
caractersticas que distinguem a famlia, o tipo e a cepa de um vrus. Os
padres eletroforticos gerados por endonuclease de restrio so como
impresses genticas.
As sondas de DNA com sequncias complementares a regies espe-
ccas de um genoma viral podem ser utilizadas como instrumentos espe-
ccos e sensveis na deteco at de mesmo de vrus que no se replicam.
As sequncias genticas virais especcas podem ser detectadas atravs de
hibridizao in situ.
A reao em cadeia da polimerase (PCR), a PCR com transcriptase re-
versa (RT-PCR) e os ensaios de cadeia ramicada de DNA esto se tornando
muito importantes na deteco viral. A utilizao de primers (iniciadores)
apropriados para PCR pode amplicar milhes de vezes uma sequncia
alvo em poucas horas. Essa tcnica especialmente til para detectar vrus
latentes e integrados. A RT-PCR utiliza a transcriptase reversa de retrovrus
para converter RNA-viral em DNA e permitir a amplicao por PCR das
seqncias de cidos nuclicos virais.
SOROLOGIA ANTIVIRAL
A sorologia pode ser usada para identicar o vrus e a sua cepa ou
sorotipo, avaliar a evoluo de uma infeco e se ela primria ou uma
reinfeco, e se aguda ou crnica. Os dados so fornecidos pelo tipo e
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ATIVIDADES
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CONCLUSO
RESUMO
O diagnstico de microrganismos fundamental para o estabeleci-
mento de parmetros de qualidade, sanidade e conduta teraputica. Os dados
obtidos fornecem informaes epidemiolgicas que so observadas para
o estabelecimento das polticas de sade pblica, saneamento bsico e de
educao, nas escolas. Amostras coletadas so utilizadas para o isolamento
e identicao de bactrias, vrus e fungos. Os microrganismos identica-
dos so caracterizados em seus fentipos e gentipos. Tais caracterizaes
visam contribuir com o monitoramento de amostras emergentes e/ou res-
surgentes de virulncia diferenciada. A necessidade da rpida identicao
dos microrganismos em material clnico foi parcialmente incrementada com
o desenvolvimento de tcnicas moleculares como: amplicao de DNA
in vitro e sondas moleculares. Atualmente h uma nfase na descoberta de
novos agentes infecciosos, e consequentemente de novas drogas e estratgias
teraputicas para o tratamento. O sucesso do diagnstico microbiolgico
depende de diversos fatores como: escolha do material clnico adequado,
coleta apropriada, acondicionamento, armazenamento e transporte ad-
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REFERNCIAS
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