AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE UNA CEPA NATIVA DEL GNERO

AURICULARIA

RESUMEN

La diversidad de macrohongos en el Ecuador es amplia, gracias al gradiente

altitudinal que presenta. Auricularia spp. es un gnero de macrohongos que

presenta alto valor econmico debido a sus propiedades nutricionales y medicinales

que le otorgan potencial industrial. No obstante, para su aprovechamiento es

necesario la obtencin de cepas nativas para favorecer la adaptacin del hongo a

las condiciones de cultivo de la zona. Por tanto, el objetivo de este experimento es

aislar e identificar la cepa nativa ecuatoriana del hongo Auricularia sp. para su

conservacin en un Banco de Recursos Genticos (BRGM) que evale sus usos

potenciales. Para ello, se aislaron tres cepas nativas de Auricularia sp. (ceba AP1-

1810, ceba AP2-1810 y ceba AP3-1810) en agar antibitico, se conservaron en el

BRG del CEBA, y se identificaron por comparacin con claves taxonmicas y

secuencias de GenBank, obtenindose por ambos medios que la muestra analizada

pertenece a A. fuscosuccinea, con una identidad gentica del 99 %, valor bastante

alto, teniendo en cuenta que existen precedentes de que la diversidad gentica en

especies nativas es alta.

Palabras clave: BRGM, cepas ecuatorianas, claves taxonmicas, identidad

gentica.
ABSTRACT

The diversity of macro-fungi in Ecuador is wide, thanks to the altitudinal gradient that

it presents. Auricularia spp. is a genus of macrohongos that presents high economic

value due to its nutritional and medicinal properties that give it industrial potential.

However, for its use it is necessary to obtain native strains to favor the adaptation of

the fungus to the growing conditions of the area. Therefore, the objective of this

experiment is to isolate and identify the native Ecuadorian strain of the fungus for its

conservation in a Gene Bank to evaluate its potential uses. To this end, three native

strains of Auricularia sp. (Ceba AP1-1810, AP2-1810 strain and AP3-1810 strain)

were isolated on antibiotic agar, preserved in the BRBA of the CEBA, and identified

by comparison with taxonomic keys and sequences of GenBank, both of which

obtained that the analyzed sample belongs to A. fuscosuccinea, with a genetic

identity of 99%, quite high value, considering that there are precedents that genetic

diversity in native species is high.

Key words: Gene Bank, Ecuadorian strains, taxonomic keys, genetic identity.

INTRODUCCIN

Se estima que existen en la naturaleza ms de 1,5 millones de especies de hongos,

de las cuales slo se han descrito alrededor de 69 000 (1). Tan slo en el Ecuador

se han estimado ms de 100 000 especies de hongos (2), aunque se han descrito

tan solo 5 000 (3).

La diversidad de macrohongos en el Ecuador es amplia, gracias al gradiente

altitudinal que presenta (4). Los macrohongos tienen un alto valor econmico y
gastronmico, debido a sus propiedades nutricionales y medicinales, que le otorgan

un carcter funcional o nutracutico. Existe una amplia gama de macro Hongos

Comestibles Silvestres (HCS) que pueden ser consumidos con seguridad, y que

presentan gran potencial en la industria alimentaria (5), cosmetolgica y

farmacutica, lo que ha fomentado el inters de los Bancos de Recursos Genticos

Microbianos (BRGM) en su aislamiento y purificacin (6).

Auricularia spp. es un gnero de hongos que bio-convierten residuos

lignocelulsicos en biomasa fngica y metabolitos secundarios de gran inters

industrial (7). Se han descrito alrededor de quince especies (810), entre las que se

encuentran: A. auricula, A. polytricha, A. delicata, A. mesentrica, A. cornea, A.

peltata, A. fuscosuccinea, y A. auricula-judae; siendo las dos primeras las ms

producidas y estudiadas a nivel mundial (11).

Los carpforos de Auricularia spp. crecen de forma natural en los tallos y las races

de algunos rboles, as como en materiales de madera en descomposicin (9,10).

Su consumo est ampliamente difundido en Asia, por lo que su produccin a nivel

industrial es una alternativa viable (12).

La actividad agrcola predominante en el Ecuador y las condiciones climatolgicas

diversas del territorio nacional, hacen factible el cultivo de Auricularia spp. para la

produccin de carpforos con fines industriales. Sin embargo, para incursionar en

este tpico es necesaria la obtencin de cepas puras nativas, con el objetivo de

garantizar el acople del hongo a las condiciones ambientales de la zona, sin incurrir

en costos adicionales modificacin antrpica.

Por tanto, el objetivo de este experimento es aislar e identificar la cepa nativa

ecuatoriana del hongo Auricularia sp., para su conservacin en un BRGM que

evale sus usos potenciales.

MATERIALES Y MTODOS

Material biolgico. El aislamiento se realiz en la comunidad La Joya, Parroquia

Jacinto Jijn y Camao, Cantn Mira, Provincia del Carchi, en un bosque subtropical

con coordenadas: UTM WGS84: 17N 806475 Este 10088020 Norte, segn figura 1.

Los basidiocarpos de Auricularia sp. se encontraban sobre troncos cados y restos

de madera aserrada de pendo; para su recoleccin se tomaron los carpforos

adheridos al sustrato y se transportaron en cavas de icopor, como indica la figura 2.

Figura 1. Georreferenciacin del sitio

de muestreo. Figura 2. Carpforos de Auricularia sp.

sobre el sustrato .

Reactivos. Se emple como medio de cultivo Agar antibitico de la marca FUNGI

PERFECTI, y se prepar siguiendo la tcnica descrita por Stamets (13).

Equipos. Se emple una cmara de flujo laminar diseada por el CEBA a partir de

un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) H14 EN-1822-1.

Aislamiento de la cepa. Se tom un bistur estril y se hizo un corte longitudinal

sobre el carpforo del hongo, luego con unas pinzas metlicas aspticas se tomaron

trozos de tejido interno de aproximadamente 2mm de longitud (7). Los trozos de

tejido se depositaron en cajas de Petri que contenan el medio de cultivo Agar Papa

Dextrosa (PDA, por sus siglas en ingls) con antibitico y se incubaron durante 6

das a 22 C. Se consideraron como aislamientos positivos, todos aquellos con

crecimientos y caractersticas miceliares uniformes, sin contaminaciones ni estados

conidiales.

Las cepas se purificaron mediante el mtodo de repiques sucesivos, se rotularon

con la siguiente nomenclatura: ceba AP1-1810, ceba AP2-1810 y ceba AP3-1810.

Luego, se almacenaron a 4 C en el BRGM del Centro Ecuatoriano de Biotecnologa

y Ambiente (CEBA).

Identificacin morfolgica. Se realiz siguiendo la metodologa descrita por Ortiz

y colaboradores (7), que consiste en observar las caractersticas morfolgicas de

los cuerpos fructferos, la estructura del tejido y del micelio, la forma de las hifas, el

color del himenforo, el tipo de zona pilosa y el tamao de la capa medular. Luego

se compararon con las claves taxonmicas reportadas por Montoya-lvarez y

colaboradores (14):

1. Himenio reticulado......................................................................... A. Delicada

1. Himenio suave................................................................................................2
 2. Seccin transversal con capa medular....... 3

2. Seccin transversal sin capa medular... ...4

3. Zona pilosa inferior a 100 m, capa medular inferior a 150m A. Fuscosuccinea

3. Zona pilosa de ms de 100 m, capa medular superior a 150m ...... A. Polytricha

4. Zona pilosa inferior a 150 m....................................................... A. Auricula judae

4. Zona pilosa cerca de 500 m........................................................... A. Mesenterica

Identificacin molecular. Los carpforos de Auricularia sp. se transportaron en

cadena de fro hasta la empresa IDGEN (http://idgen-ecuador.com/) en la ciudad de

Quito (Ecuador), la cual codific el hongo como Auri1 y realiz la respectiva

identificacin molecular.

El protocolo de identificacin molecular constaba de:

- Toma de muestra del tejido fngico.

- Rompimiento celular mecnico (bead beating) y qumico (buffer de lisis).

- Extraccin de ADN por duplicado, mediante el mtodo de Sambrook (15) modificado

con la adicin de ARNasa, para eliminar el ARN residual (16).

- Verificacin de la calidad del ADN mediante electroforesis en gel de Agarosa al 1%

y utilizacin de un marcador de bajo peso molecular para determinar la

concentracin de ADN de la muestra. Los resultados se confirmaron con un

nanodrop.

- Amplificacin del ADN mediante la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por

sus siglas en ingls), empleando los cebadores (primers) ITS4 y ITS5, y el siguiente
 protocolo de termociclado: 95 C por 3 min; 31 ciclos de 94 C por 30 s, 50 C por

45 s y 72 C por 1 min 30 s; 72 C por 7 min; y 4 C en espera.

- Observacin de amplicones mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y

comparacin con marcadores de 1 Kb (1 000 pb).

- Secuenciacin de amplicones por el Mtodo de Sanger (17).

- Ensamblaje y depuracin de las secuencias obtenidas con el programa

bioinformtico GENEIOUS.

- Comparacin de las secuencias ensambladas con la base de datos de nucletidos

de GenBank.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Aislamiento de la cepa. El aislamiento de Auricularia sp. se hace a partir del tejido

del hongo y no de esporas debido a que los cultivos de tejidos son esencialmente

clones del hongo, en contraste con los cultivos de esporas, que presentan

variabilidad gentica (18).

El medio de cultivo empleado, agar PDA, coincide con el empleado por varios

investigadores para el aislamiento de especies del gnero, tales como A. auricula

(16,19).

Identificacin morfolgica. El hongo recolectado presenta basidiocarpos en forma

de oreja, solitarios, glabros, sub-estipitados y de color rosado plido, unidos

lateralmente al sustrato, consistencia cerosa y gelatinosa cuando frescos mientras

que coricea cuando secos, un tamao que vara de 2 a 10 cm de largo por 5 a 12

cm de ancho, un himenio suave con pliegues leves, y una zona pilosa inferior a 100
m con capa medular inferior a 150 m, segn figura 3. Estas caractersticas

macroscpicas coinciden con las reportadas por Lowy (20), y por Bolaos y Soto

(21).

Figura 3. Badisiocarpos de Auricularia sp. sobre sustrato natural.

Por otro lado, las colonias fngicas presentan micelio blanco de aspecto sedoso a

plumoso y mediana densidad, como se muestra en la figura 4.

Figura 4. Cepa de Auricularia sp. purificada

Constrastando con las claves taxonmicas descritas en la metodologa se deduce

que el hongo pertenece a la especie A. Fuscosuccinea; no obstante, es necesario

un estudio filogentico molecular para identificar la especie con mayor exactitud

(14).

Identificacin molecular. Los enfoques moleculares se consideran herramientas

poderosas para investigar la relacin inter e intragentica de especies de

basidiomicetos, apoyando los resultados obtenidos a partir de mtodos

convencionales tales como los morfolgicos, fisiolgicos y bioqumicos (19).

En este trabajo se emplearon los cuerpos fructferos del Auricularia sp. (Auri1) como

muestra para la extraccin de ADN, a diferencia de otros trabajos donde se emplea

el micelio seco luego de Fermentacin en Estado Lquido (FEL) (16,19,22).

La extraccin de ADN se realiz en este trabajo por el mtodo de Sambrook (15), a

diferencia de Tao y Colaboradores (19), que emplearon el mtodo de Doyle (23)

modificado, y de Yan y colaboradores (12), que emplearon el mtodo de Bromuro

de hexadeciltrimetilamonio (CTAB, por sus siglas en ingls).

El ADN de Auri1 se extrajo por duplicado con el fin de obtener una concentracin y

calidad de ADN que permitiera la correcta amplificacin del Fragmento de

Espaciadores Transcritos Internos (ITS, por sus siglas en ingls) mediante PCR.

Adicionalmente, las muestras se trataron con ARNasa y se diluyeron hasta una

concentracin en un rango de 15 a 30 ng/L, para descartar procesos inhibitorios

de la PCR debido a una elevada concentracin de ADN, previo a su utilizacin en

el ensamblaje de la PCR. Este rango de concentracin de ADN es semejante al

rango reportado por Tao y Colaboradores (19) para la identificacin de cepas

nativas de A. auricula, 20 a 40 ng/L.

El anlisis de secuencias de Espaciadores Transcritos Internos (ITS, por sus siglas

en ingls) juega un papel importante en los estudios de filogenia en o por debajo del

nivel de gnero y en la identificacin de hongos (24).

Los resultados del ensamblaje se visualizan en la figura 5, donde C - es el control

negativo y el Ladder tiene una longitud de 1Kb.

Figura 5. Amplicn del fragmento ITS visualizados en un gel de Agarosa 2%.

El ADN lineal de Auri1 presenta longitud de 636 pb, calidad del 71,5 % y al

contrastarse con la accesin JX065150.1 de la base de datos de nucletidos de

GenBank muestra identidad del 99 % con A. fuscosuccinea (25), conforme con la

publicacin de Looney, Birkebak y Matheny (2013). Este porcentaje de identidad

gentica es positivo, ya que otros estudios evidencian que las cepas nativas

presentan una alta diversidad gentica. Cepas nativas de A. auricula-judae

presentaron una identidad gentica promedio de tan slo el 41% (27), mientras que

las cepas de A. auricular presentaron el 50-63% (12,22) y las de A. polytricha el 58-

65 % (12,28).
Tabla 1. Clasificacin cientfica de la cepa en estudio

Clasificacin cientfica

Reino: Fungi

Divisin: Basidiomycota

Clase: Agaricomycetes

Orden: Auriculariales

Familia: Auriculariaceae

Gnero: Auricularia

Especies: A. fuscosuccinea

CONCLUSIONES

Se aislaron las cepas ceba AP1-1810, ceba AP2-1810 y ceba AP3-1810, de

Auricularia sp. (Auri1), las cuales se almacenaron en el Banco de Recursos

Genticos Microbianos (BRGM) del CEBA.

La comparacin de caracteres morfolgicos con claves taxonmicas y la bsqueda

en la base de datos Genbank, de la secuencia de ADN obtenida, permitieron

identificar a la muestra analizada como Auricularia fuscosuccinea. El ADN lineal de

Auri1 present una longitud de 636 pb, calidad del 71,5 % e identidad gentica del

99 %, un valor demasiado alto, teniendo en cuenta que existen precedentes de que

la diversidad gentica en especies nativas es alta.

El cuerpo fructfero de Auri1 posee una elevada concentracin de protenas y

polisacridos, por lo que fue necesario el uso de tratamientos enzimticos

adicionales a los mtodos convencionales de extraccin de ADN, que permitieran

la obtencin de ADN de alta calidad, til para la identificacin de la especie.

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