6DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR EL METODO D ACIDO SULFURICO

- FENOL

JUAN DIEGO CARDENAS DURAN - 117003704

JHOAN NICOLAS VILLAREAL MORENO 11700350

Informe de Qumica Agroindustrial

Profesor, Miguel ngel Ramrez Nio, Qco-UIS, MSc-UPRM

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES
INGENIERA AGROINDUSTRIAL
VILLAVICENCIO META
2017
DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR EL METODO D ACIDO SULFURICO
FENOL

Objetivos:

Determinar el contenido de carbohidratos totales en una muestra de jugo o bebida

procesada.

Conocer la tcnica de espectroscopia visible como herramienta de anlisis qumico

de alimentos, y su utilizacin en la preparacin de curvas de calibracin.

Datos:

Tabla N1 Preparacin de la curva de calibracin a partir de las soluciones de glucosa

Volumen de solucin
Volumen de agua Concentracin de
Tubo stock de glucosa 1000
destilada (mL) glucosa (ug / mL)
(ug / mL)
1 0,00 2,0 0

2 0,20 1,8 10,0

3 0,40 1,6 20,0

4 0,60 1,4 30,0

5 0,80 1,2 40,0

6 1,00 1,0 50,0

7 1,20 0,8 60,0

8 1,40 0,6 70,0

9 1,60 0,4 80,0

10 1,80 0,2 90,0

Tabla N2 Datos de absorbancia de la curva de calibracin de las soluciones preparadas
de glucosa

Absorbancia (A) 490 nm Desviacin Coeficiente de

Tubo Promedio variacin
N1 N2 N3 estndar

1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0%

0,78%
2 0,127 0,127 0,128 0,127 0,001

0%
3 0,247 0,247 0,247 0,247 0,000

0,45%
4 0,446 0,444 0,443 0,444 0,002

0,96%
5 0,516 0,525 0,517 0,519 0,005

0,15%
6 0,641 0,642 0,642 0,641 0,001

0,12%
7 0,773 0,774 0,774 0,773 0,001

0,21%
8 0,923 0,922 0,926 0,923 0,002

0,09%
9 1,017 1,017 1,016 1,016 0,001

0%
10 1,062 1,062 1,062 1,062 0,000

Tabla N1 Preparacin de la muestras de jugo (Soka)

Variable Valor
Peso total del jugo de 300 mL contenido
284,3442 g
neto.
Peso de la muestra de jugo para preparar
3,0152 g
una solucin de 250 mL
Carbohidratos totales reportados en la
23 g
etiqueta nutricional
Preparacin de la solucin en un matraz de
Una alcuota de 10 mL
100 mL
Tabla N1 Preparacin de la las soluciones de muestras de jugo (Soka)

Volumen de la
solucin de la Volumen de agua Volumen de Volumen de
Tubo
muestra de jugo destilada (mL) [H2SO4] Fenol (5%)
preparada
1 0,2 mL 1,8 5 mL 1 mL

2 0,4 mL 1,6 5 mL 1 mL

3 0,6 mL 1,4 5 mL 1 mL

Tabla N2 Datos de absorbancia de la curva de calibracin de las soluciones preparadas

de glucosa

Absorbancia (A) 490 nm Desviacin Coeficiente de

Tubo Promedio
N1 N2 N3 estndar variacin
1 0,094 0,096 0,096 0,095 0,001 1,05%
1,47%
2 0,203 0,202 0,207 0,204 0,003
0,30%
3 0,322 0,324 0,324 0,323 0,001

Clculos:

Concentraciones muestras de patrn glucosa para la curva de calibracin

Vsp = Volumen solucin de patrn glucosa 100g/mL
Vadd = Volumen de agua destilada

Concentracin 1: Concentracin 3:

Vsp = 0,00mL Vsp = 0,4mL

Vadd = 2,00mL Vadd = 1,6mL
0,00100/ 0,40100/
2 = = 0,0/ 2 = = 20,0/
2,00 1,60
Concentracin 2: Concentracin 4:

Vsp = 0,2mL Vsp = 0,6mL

Vadd = 1,8mL Vadd = 1,4mL

0,20100 0,60100

2 = = 10,0 2 = = 30,0
2,00 1,40
 Concentracin 5: Concentracin 8:

Vsp = 0,8mL Vsp = 1,4mL

Vadd = 1,2mL Vadd = 0,6mL
0,80100/ 1,40100/
2 = = 40,0/ 2 = = 70,0/
1,20 0,60
Concentracin 6: Concentracin 9:

Vsp = 1,0mL Vsp = 1,6mL

Vadd = 1,0mL Vadd = 0,4mL
1,00100/ 1,60100/
2 = = 50,0/ 2 = = 80,0/
1,00 0,40
Concentracin 7: Concentracin 10:

Vsp = 1,20mL Vsp = 1,8mL

Vadd = 0,80mL Vadd = 0,2mL
1,20100/ 1,80100/
2 = = 60/ 2 = = 90,0/
0,80 0,20

Tratamiento de datos a la observancia de las muestras de jugo

Promedio

=1
=

Desviacin estndar

( )2
=
1

Coeficiente de variacin

% . = 100%

 Tubo N1 Muestra de jugo

0,094 + 0,096 + 0,096

= = 0,095
3
(0,094 0,095 )2 + (0,096 0,095 )2 + (0,096 0,095 )2
= = 0,003
2

0,001
% . = 100% = 1,05 %
0,095

Tubo N2 Muestra de jugo

0, + 0,096 + 0,096
= = 0.204
3

(0,203 0.204 )2 + (0,202 0.204 )2 + (0,207 0.204 )2

= = 0.001
2

0,001
% . = 100% = 1,05 %
0,095

Tubo N3 Muestra de jugo

0,094 + 0,096 + 0,096

= = 0.323
3

(0,094 0,095 )2 + (0,096 0,095 )2 + (0,096 0,095 )2

= = 0.001
2

0,001
% . = 100% = 1,05 %
0,095
Grafica N1 Curva para cuantificar carbohidratos totales

Absorvancia Vs Concentracion
1
y = 0.013x + 0.0031
0.8 R = 0.9955
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Concetracion(ug / mL)

Absorvancia Vs Concentracion Linear (Absorvancia Vs Concentracion)

Nota: La ecuacin de linealidad que arroje la grfica de la curva patrn se tomara como
referencia para hallar matemticamente la concentracin del azcar presente en la
muestra.
Concentracin de los 3 tubos de ensayo con la muestra de jugo Soka

2 = 0,9955

= 0,013 + 0,0031

= +

= =

Concentracin del tubo N1

0,095 0,0031
0,095 = 0,013 + 0,0031 = = 7,06 3

0,013
/

3 . 3
2 . 2 = 3 . 3 2 =
2

7,06 . 2
2 = = 70,06
0,2
 2 . 2
1 . 1 = 2 . 2 1 =
1

70,06 . 100
1 = = 706
10

250 1
706 = 0,1765 0,2
1 1106

0,1765
100 % = 5,85 %
3,0152

0,1765
284,3442 = 16,6445 300
3,0152

Concentracin del tubo N2

0,204 0,0031
0,204 = 0,013 + 0,0031 = = 15,45 /

0,013
/

3 . 3
2 . 2 = 3 . 3 2 =
2

15,45 . 2
2 = = 145,5
0,2

2 . 2
1 . 1 = 2 . 2 1 =
1

154,5 . 100
1 = = 1545
10

250 1
1545 = 0,3862 0,4
1 1106

0,3862
100 % = 12,81 %
3,0152

0,3862
284,3442 = 36,4200 300
3,0152
 Concentracin del tubo N3

0,323 0,0031
0,323 = 0,013 + 0,0031 = = 24,60 /
0,013/

3 . 3
2 . 2 = 3 . 3 2 =
2

24,60 . 2
2 = = 246
0,2

2 . 2
1 . 1 = 2 . 2 1 =
1

246 . 100
1 = = 2460
10

250 1
2460 = 0,6150 0,6
1 1106

0,6150
100 % = 20,39 %
3,0152

0,6150
284,3442 = 57,9967 300
3,0152

Tratamiento de datos

Promedio

=1
=

16,6445 + 36,4200 + 57,9967

= = 37,0204
3

Desviacin estndar
( )2
=
1
 (16,6445 37,0204)2 + (36,4200 37,0204)2 + (57,9967 37,0204)2
=
2
= 16,8873

Coeficiente de variacin

% . = 100%

16,8873
% . = 100% = 45,61 %
37,0204
Error relativo

. = 100%

37,0204 17,0000
. = 100% = %
17,0000

Resultados de clculos

Tabla N5 Contenido de carbohidratos totales en la disoluciones preparadas

Volumen Utilizado de la Contenido de

Tubo Concentracin
muestra carbohidratos
1 706 ug/ mL 0,2 mL 0,1765 g
0,3862 g
2 1545 ug mL 0,4 mL

3 2460 ug/ mL 0,6 mL 0,6150 g

Tabla N5 Contenido de carbohidratos totales en la Muestra de jugo Soka de 300 mL

Carbohidratos
totales en los 300 Desviacin Coeficiente de
Tubo Error relativo
mL de jugo estndar variacin
(Promedio)
1, 2, 3 37,0204 g 16,8873 45,61 %
Anlisis de Resultados

El metodo por espectrofotometria UV hace referencia al uso de la luz para medir las
concentraciones de ciertas sustancias qumicas. Para que este fenmeno pueda llegar a
medirse se debe tener presente la concentracin de las especies absorbentes dado a que esta
es proporcional a la absorbancia segn la ley de lamber-bee

La reaccion de color para medir la concetracion de carbohidratos solubles por

espectrofotometria se basa en la utilizacion del metodo colorimetrico de fenol-sulfurico que
depende de la deshidratacion de sacaridos derivados de hidrolisados a furfural que transcurre
en el proceso de la reaccion. Los derivados del furfural con las formas del fenol coloreado
abdorbe la luz en el rango visible a una longitud de onda de 490 nm. Reaccion: FENOL+ H2SO4
(concentrado) + CARBOHIDRATO HMF (amarillo naranja) Para hexosas (hidroximetil furfural)
Para pentosas (metil furfural)

Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario contruir una curva de calibracion
o curva patron a diferentes concentraciones con el carbohidrato de interes (disacaridos y
monosacaridos) para determinar la absorbancia. Para calibrar el espectrofotometro se procede
a ubicar el blanco que se tiene provisto en la celda, ajustandolo al 100% de transmitancia y
0,000 de absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentracion, se grafica sobre
excel o una hoja de papel milimetrado absorvancia vs concentracion de cada solucion
preparada. La ecuacion de linealidad que arroje la grafica de la curva patron se tomara como
referencia para hallar matematicamente la concentracion del azucar presente en la muestra.
Luego se procede a medir la absorbancia de la muestra de interes. Entonces: Se tiene que Y=
mx+b (ecuacion de linealidad expresada en la curva patron) Donde Y es la absorbancia del
analito m. es la pendiente (valor numerico) que tomo de la ecuacion de linealidad de la curva
patron x, es el dato que no conozco b. es el intercepto (valor numerico) que tomo de la ecuacion
de linealidad de la curva patron teniendo en cuenta los datos de la ecuacion lineal despejamos
X (lo tomamos como concentracion del analito). Como obtenemos la concentracion diluida en
ppm se realizan los calculos necesarios para determinar la concentracion en gramos de la
muestra analizada en determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos
cuando medimos la muestra se interpola o extrapola en la grafica segn el valor arrojado.

Cuantificacin de azcares totales La concentracin de azcares totales se determin a

travs de una curva de calibracin de la absorbancia en funcin de la concentracin
para la cual se prepararon soluciones de 10-70 mg/L utilizando manosa como estndar.
Como blanco para las lecturas se utiliz agua destilada aplicndole el mismo
tratamiento. Para la aplicacin del mtodo Dubois [9] (Mtodo Fenol-Sulfrico), se
mezclaron 2 mL de muestra con 2 mL de fenol al 5% en tubos digestores y se colocaron
en una gradilla sumergida en un bao de agua fra. A los tubos se les aadieron 5 mL de
H2SO4, se dejaron reposar por 15 min y se analizaron en un espectrofotmetro
(Genesys 10vis) a una longitud de onda de 490 nm. Los ensayos se realizaron por
triplicado para obtener valores promedios. Las desviaciones estndar fueron menores
al 5%.
Cuantificacin de azcares totales El contenido de azcares totales se determin
aplicando el mtodo Dubois [9], utilizando manosa como estndar (10-70 mg/mL). En
la Figura 1 puede verse la curva patrn construida para cuantificar los azcares totales
y en la Tabla 1 los resultados para cada muestra, las cuales fueron diluidas para su
lectura y luego multiplicadas por el factor de dilucin 104. Estos resultados indican que
la menor concentracin de azcares totales se encuentra en las hojas, la pia cruda
tiene una concentracin ms elevada y la mayor concentracin se presenta en la pia
cocida.
Mtodo de fenol-sulfrico Los carbohidratos sern destruidos por calor y por cido, son
particularmente sensible a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones
una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin
simples, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados
del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir
compuestos obscuros o compuestos coloridos producto de la condensacin de
compuestos fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La
condensacin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los
azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando
que estos bajo hidrlisis cida producen monosacridos. La forma en que procede la
reaccin no es estequiometrica y depende de la estructura del azcar, por lo tanto se
realiza una curva patrn. (Nielsen, 1998)

Todos los carbohidratos tanto oligosacridos como polisacridos pueden ser determinados,
pues bajo hidrolisis acida producen monosacridos. La adicin de algunos cidos minerales
a las soluciones acuosas de carbohidratos, como el cido sulfrico, provoca la
deshidratacin de los carbohidratos con la eliminacin de tres moles de agua. Con esta
reaccin se forman derivados del furfural, y el 5-hidroximetilfurfural (HMF), el cual es de
gran importancia como precursor de otras biomoleculas tiles en la industria alimentaria y
energtica. En el caso de pentosas, se produce una deshidratacin a furfural y en las hexosas
a HMF. La presencia del fenol y su interaccin con el HMF facilita la formacin de complejos
que permiten la coloracin de la solucin y en consecuencia facilitan la cuantificacin de los
carbohidratos a travs de la espectrofotometra. Los derivados del furfural con las formas
del fenol coloreado absorbe la luz en el rango visible a una longitud de onda de 490 nm.
Reaccin:

FENOL+ H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO HMF (amarillo naranja)

Para hexosas (hidroximetil furfural)
Para pentosas (meti furfural)

Se prepara una solucin patrn a partir de glucosa. Posteriormente se toman alcuotas de

0.1; 0.2; 0.3 y se completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada se adiciona 1 mL fenol
al 5% y 5 mL de cido sulfrico concentrado, se deja reposar y se agitan por 30 s en el vortex,
se colocaron en bao de agua fra. Finalmente se lleva a una celda donde se deposita en el
espectrofotmetro para programar la longitud de onda a 490 nm y se procede a leer la
absorbancia. Al tener la curva patrn se procede a determinar los carbohidratos del jugo de
Soka (mandarina), a 2 mL de alcuota de una solucin de carbohidratos se mezcla con 1 ml
de solucin acuosa al 5% de fenol en un tubo de ensayo. Posteriormente se aade 5 ml de
cido sulfrico concentrado, rpidamente a la mezcla. Luego se repite la metodologa
anterior, se colocan durante 15 mins en un bao de agua fra para el desarrollo del color.

A partir de los diferentes volmenes utilizados de patrn glucosa en las soluciones hallamos
la concentracin de cada una de las muestras, obteniendo una concentracin a medida que
el volumen de patrn glucosa en las soluciones aumenta. Con las soluciones que pueden o
no estar bien preparadas, utilizamos como herramienta un espectrofotmetro para medir
por triplicado la absorbancia de cada una de estas soluciones para obtener datos ms
precisos.

Teniendo la concentracin y la promediacin de absorbancia de cada una de la soluciones

hicimos la curva de calibracin Absorbancia vs Concentracin de la cual obtuvimos una
curva ascendente con una linealidad precisa, con una valor de R2 de 0.9908, ya que es una
valor muy cercano a 1, y obteniendo la ecuacin de la recta y=0.0096x-0.0363 de la cual (y)
es la absorbancia y (x) la concentracin.

Despus de la preparacin de la muestra, se tomaron tres muestras de la solucin

resultante, la cuales fueron de 0.2ml, 0.4ml y 0.6ml, de las cuales se tomaron tambin tres
datos de absorbancia a cada muestra, hallando el promedio. Tomando el promedio de
concentracin de cada una de las tres muestras, el cual por medio de los clculos se logra
hallar los valores de cada Dilusion y luego, lo multiplicamos por los 250 ml de la solucin
principal para hallar los microgramos de carbohidratos en las muestras, los cuales equivalen
a 0.48075 g de carbohidratos en la muestra.

Para hallar los carbohidratos totales dividimos los gramos de carbohidratos en la muestra
sobre los gramos de muestra utilizados por el peso total de la muestra, para obtener un
total gramos de carbohidratos totales con un %p/p de 15,94%, con estos resultados
podemos deducir que la prctica no fue llevada a cabo correctamente ya que los datos
tericos de carbohidratos presentes en la muestra son de 26 g, obteniendo en la practica
un error relativo del 2,18, esto podra ser atribuido a la mala preparacin de las disoluciones
de la curva de calibracin, ya que posiblemente los reactivos estaban contaminados y/o mal
preparados.

Conclusiones

Hay que tener cuidado de la cantidad de muestra diluda ya que esta depende del
resultado ptimo de la prctica.
 El azcar es deshidratado debido a la presencia del cido fenol-sulfrico.

La temperatura de las soluciones influye positivamente o negativamente, segn

los otros compuestos.

Bibliografas

CHRISTIAN, Gary. Qumica Analtica. 6 ed. Mxico.: Mc Graw Hill, 2009

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/FUNDAMENTOSYTECNICASDEANALIS
ISDEALIMENTOS_12286.pdf

http://www.redalyc.org/pdf/904/90424216002.pdf

http://scielo.sld.cu/pdf/ind/v29n2/ind02217.pdf