Japj Tecnologia Enzimatica

PROTENA
RECOMBINANTE
Tecnologa enzimtica I
Universidad Tecnolgica de Corregidora

Prof. Dra. Mandujano Gonzlez Virginia
Perea Jimnez Jazmn Alejandra

QUI 402
1
Jazmn Alejandra Perea Jimnez QUI402
Enzima Amilasa Dictyoglomus

turgidum
El genoma completo de D. thermophilum an no se ha secuenciado por completo.
Desde el ao 2006, los genetistas del Instituto de Investigacin Genmica (TIGR)
han estado llevando a cabo una secuencia de escopetas "al azar" en un intento de
construir el genoma completo del organismo. La falta de informacin ha dificultado
que los microbilogos aslen numerosas protenas y enzimas sintetizadas por este
organismo. La enzima amilasa dictyoglomus turgidum es una bacteria que se
caracteriza por ser hipertermfilo, quimiorganotrofo y anaerobio. Se ha llegado a
describir como Gram negativo o que significa que contiene una membrana celular
interna y externa) con una pared de tres capas, suele ser un organismo de gran
inters ya que puede llegar a elaborar la xilanosa que es de gran inters a nivel
industrial, al igual acta en la fermentacin de la celulosa produciendo etanol e
hidrogeno, esta enzima cuenta con una temperatura ptima de 78.
A) ARTCULO
Enzima: ADN Amilasa
Organismo: Dictyoglomus turgidum
Artculo:
Tecnologa enzimtica 2
Protena Recombinante
La eleccin de esta enzima se bas en la informacion que nos proporcionan dos

artculos que son: Cloning and nucleotide sequence of a heat-stable amylase gene
from an anaerobic thermophile, Dictyoglomus thermophihm e Ingeniera De
Enzimas Con La Xilanasa, los cuales hablan sobre las propiedades de dicha
enzima y su gran inters que tiene
gracias a las diversas funciones
que desempea a nivel industrial.
Digiere el xilano,
un heteropolmero de
la pentosa xilosa. Pretratando la
pulpa de madera con esta enzima,
los fabricantes de papel pueden
alcanzar niveles de blanco
comparables con mucho
menos cloro. Son bacilos
anaerobios estrictos sin movilidad
y sin formacin de esporas, que se
aislaron en fuentes termales. Su
temperatura ptima es de 78C.2
El genoma de D. turgidum DSM
6724 consiste en un nico cromosoma de 1.855.560 pb y no contiene plsmidos
ni elementos extracromosmicos. El contenido de GC del cromosoma es 33,96%
basado en la secuencia del genoma y se prev que contenga 1813 genes de
codificacin de protenas y 52 genes de ARN.
B)SECUENCIA
Aqu presentamos la secuencia completa del genoma de la bacteria
quimioorganotrfica extremadamente termfila, Dictyoglomus turgidum, que es una
bacteria Gram negativa estrictamente anaerbica. Este genoma es altamente
sintnico. Puede crecer en una amplia variedad de sustratos de polisacridos
debido a su compromiso genmico significativo con las glicosil hidrolasas.
1. Para buscar tu secuencia debes de ingresar a la pgina web de NCBI

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
En la cual aadirs el nombre de tu enzima y lo buscaras.
2. En el caso de DNA Amylase Dictyoglomus turgidum, aparecern 4

resultados, por lo que escogimos el primer resultado.
3. Damos click en el primer resultado, y nos paarecera toda la informacin

general de nuestra enzima, vamos a bajar a nuestra pantalla hasta encontrar
el punto que diga genomic regions, transcripts, and products. Dando click en
FASTA.
4. Al momento de dar click en FASTA te aparecer tu secuencia.
Teniendo en cuenta su crecimiento ptimo a 72 C, D. turgidum tiene un contenido

de G + C anmalamente bajo de 39.9% que puede explicar la presencia de girasa
inversa, generalmente asociada con hipertermfilos.
TMtemperatura de fusin
T2
A2
G4
C4
Al igual se te muestra la ubicacin de tu gen.
C)PRIMERS
5ATGGAGAAAGGCATATATTTTTCTTTGGGGATTCACAATCATCAAC
CTGTAGGGAATTTTGATTTTGTAA
TTGAAAAGGCTTATGAGATGAGTTATAAGCCTCTTATTGATTTCTTTT
TTAAATATCCTGACTTTCCTAT
AAATGTTCATTTTTCGGGTTTTTTATTACTTTGGCTTGAAAGGAATCA
TCCCGAATACTTTGAAAAATTA
AAGATCATGGCAGAGAGAGGACAGGTTGAATTTGTAAGCGGGGGCTT
TTATGAACCAATCTTGCCTATAA
TACCTGATAAAGATAAGGTGCAACAAATAATAAAGCTAAATAAATAC
ATATATGATAAATTTGGACAAAA
TCCTAAAGGAATGTGGCTTGCCGAAAGGGTATGGGAACCTCATCTTGT
TAAATACATTGCAGAGGCAGGT
ATAGAGTATGTGGTAGTAGATGATGCCCATTTCTTTTCCGTAGGATT
AAAAGAAGAAGATCTTTTTGGGT
ATTATCTAATGGAAGAACAAGGATATAAGCTTGCTGTATTTCCTATA
AGTATGAAGTTGCGTTATTTAAT
ACCTTTTGCTAACCCTGAAGAAACCATTACTTATCTTAATAAATTTGC
CTCGGAAGATAAAAGTAAAATT
GCCCTTCTTTTTGATGATGGAGAGAAATTTGGATTATGGCCTGATACT
TATAAGACAGTATATGAGGATG
GATGGTTAGAAAGATTTGTGAATAAAATAAAAGAAAATTTTTTATTA
GTAACACCTGTTAATTTGTATAC
CTATATGAAGAAGGTGAAGCCAAAGGGAAGAATATATCTTCCTACAG
CTTCTTATAGAGAGATGATGGAA
TGGGTTTTATTTCCTGAAGCTCAAAAAGACCTTGAGGATCTTATGGA
AAAACTTAAAAGTGAAAGCTTAT
GGGATAAGTTTTCTCCTTATGTAAAGGGCGGATTTTGGAGAAACTTC
CTTGCTAAGTACGATGAATCTAA
TCATATGCAGAAGAAGATGCTCTATGTATGGAGTAAAGTTCAAAACT
ATCCTGATGGGGAGATTAAAGAT
AAGGCTGAAGAAGAAGTCTTTCAGGGACAGGCAAATGATGCATATTG
GCATGGTATTTTTGGAGGGCTTT
ATCTTCCTCACTTAAGGACTGCCATATACGAACATTTGATTAAAGCAG
AAAATTATATTGAAAATTATGA
CCTGCATTATAAGATTTTTGACTTGGATTGTGATGGAAATGATGAGT
TAATTCTTGAATCTCCTACTTTT
AATTTGTATCTCTCTCCTATGCATGGAGGATCACTCCTTGAATGGGAT
TTTAGACCTAAAGCTTTCAATC
TAACTAATACTTTAACTAGAAGAAAAGAAGCATATCATTCTAAATTA
TCTCAGGTAAGCTCTGATGTTCA
AGGAAAGAGTATACATGAAAGATGGAGTACAAAAGAGGAGGGCTTA
GAAAAAATACTCTTTTATGATAAC
CATAGAAGGGTTTCTTTTATTGAGAGAATTTTTAAAAAAGAGCCTAC
CCTTGAAGATTTATGGAAGAATA
GCTTAAAAGCCGAAGTTGACAGTTTTTATAAAGAATACGAATATGAA
ATAAGTAAAGATGAGAAGAAAAT
CGTAGTATCTTTTAAAGGAGATTATAAAGATTTTGAAATCCATAAAA
GATATCTTCTTTATAAGAATGAG
CCTTTTATTGATGTGGTTTATGAAATTAAAAATATCTCCAAAGAACCT
ATAACTTTAAACTTTGGATGGG
AGATAAATATTAACTTTTTAGCACCAAATCATCCTGATTACTACTTTT
TAATAAGAGATCAAAAATATCC
TCTCTCTTCTTTTGGAGTTGAAAAAGTTAATAATTGGAAAGTATTTTC
GGGTATAGGAATAGAATTGGAA
TGTTCTTTAGATATGGAAACTATTTTGTATAGATATCCTATAGAAAC
GGTGTCTCTTTCTGAGGAAGGAT
TTGAAAAAGTTTATCAAGGAAGTGCTCTCCTTCATTTTTATAAGATA
GATTTGCCCATTGACTTTAACTG
GAAGACCTCAATAAGATTTTTAGTTAAATAG 3
Nombre de oligonucletido Secuencia (5 a 3)

Pr0001 ATGGAGAAAGGCATATAT
Pr0002 CTATTTAACTAAAAATCT
Para nuestro primer nmero 1, se tomarn las primeras 18 bases nitrogenadas que
van de 5 a 3, estas 18 letras la vamos a agregar a nuestro primer list al igual le
podemos dar el nombre que nosotros queramos, debe de ser corto y entendible,
AmplyfX nos lanzara los datos de nuestro primer como es la temperatura, Q y L, nos
da nuestros valores con mayor exactitud y nos evitamos errores aleatorios.
El segundo primer se hace de manera diferente ya que consta de tres pasos;

1) Vas a ubicar tus primeras dieciocho bases nitrogenadas de 3 a 5.
Ejemplo. 3 AGATTTTTAGTTAAATAG 5
2) Ahora se escribe al contrario de la cadenita de bases nitrogenadas que

sacaste.
Ejemplo. GATAAATTGATTTTTAGA
3) Vamos a sustituir las letras por la base nitrogenada con la que se unen.
Ejemplo. CTATTTAACTAAAAATC
D) MEZCLA DE REACCIN Y PCR

PCR:
Mezcla Volumen
de (l) CONDICIONES TIEMPO C
reaccin Iniciacin 5 min 95
Reg KCL 1 Desnaturalizacin 45 seg 95
10X
MgCl2 50 0.7 Alineamiento 45 seg 40.5
M
Extensin 1.586min 64.23
Pr0001M 0.2
Pr0002M 0.2 # de ciclos 30
ADN 1
Extensin final 5min 72
Taq pol 0.2
dNTPs 10 0.2
M
H2O 6.50
TOTAL: 10 La Temperatura de Fusin, Tm, de un
oligonucletido es un valor de crtica importancia. Su determinacin ms confiable
y exacta es emprica.
En este caso el aliamiento y la extensin se calcularon por medio de frmulas,
arriesgndonos a tener errores aleatorios.
Para lograr calcular el alineamiento se calcularon la temperatura promedio de
ambos primers.
0001+0002 44+37
T= = =40.5
2 2
En extensin, se realiz el clculo de la temperatura basado en los nucletidos, es
importante dejar en claro que por cada 1000Kb corresponde a 1 minuto (60s).
# 1586
= = = 1.586
1000 1000
Amylase chain reaction (PCR)

5AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGGAGAAAGGCATATATTTTTCTTT
GGGGATTCACAATCATCAACCTGTAGGGAATTTTGATTTTGTAA
TTGAAAAGGCTTATGAGATGAGTTATAAGCCTCTTATTGATTTCTTTT
TTAAATATCCTGACTTTCCTAT
AAATGTTCATTTTTCGGGTTTTTTATTACTTTGGCTTGAAAGGAATCA
TCCCGAATACTTTGAAAAATTA
AAGATCATGGCAGAGAGAGGACAGGTTGAATTTGTAAGCGGGGGCTT
TTATGAACCAATCTTGCCTATAA
TACCTGATAAAGATAAGGTGCAACAAATAATAAAGCTAAATAAATAC
ATATATGATAAATTTGGACAAAA
TCCTAAAGGAATGTGGCTTGCCGAAAGGGTATGGGAACCTCATCTTGT
TAAATACATTGCAGAGGCAGGT
ATAGAGTATGTGGTAGTAGATGATGCCCATTTCTTTTCCGTAGGATT
AAAAGAAGAAGATCTTTTTGGGT
ATTATCTAATGGAAGAACAAGGATATAAGCTTGCTGTATTTCCTATA
AGTATGAAGTTGCGTTATTTAAT
ACCTTTTGCTAACCCTGAAGAAACCATTACTTATCTTAATAAATTTGC
CTCGGAAGATAAAAGTAAAATT
GCCCTTCTTTTTGATGATGGAGAGAAATTTGGATTATGGCCTGATACT
TATAAGACAGTATATGAGGATG
GATGGTTAGAAAGATTTGTGAATAAAATAAAAGAAAATTTTTTATTA
GTAACACCTGTTAATTTGTATAC
CTATATGAAGAAGGTGAAGCCAAAGGGAAGAATATATCTTCCTACAG
CTTCTTATAGAGAGATGATGGAA
TGGGTTTTATTTCCTGAAGCTCAAAAAGACCTTGAGGATCTTATGGA
AAAACTTAAAAGTGAAAGCTTAT
GGGATAAGTTTTCTCCTTATGTAAAGGGCGGATTTTGGAGAAACTTC
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TCATATGCAGAAGAAGATGCTCTATGTATGGAGTAAAGTTCAAAACT
ATCCTGATGGGGAGATTAAAGAT
AAGGCTGAAGAAGAAGTCTTTCAGGGACAGGCAAATGATGCATATTG
GCATGGTATTTTTGGAGGGCTTT
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CCTGCATTATAAGATTTTTGACTTGGATTGTGATGGAAATGATGAGT
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TTTAGACCTAAAGCTTTCAATC
TAACTAATACTTTAACTAGAAGAAAAGAAGCATATCATTCTAAATTA
TCTCAGGTAAGCTCTGATGTTCA
AGGAAAGAGTATACATGAAAGATGGAGTACAAAAGAGGAGGGCTTA
GAAAAAATACTCTTTTATGATAAC
CATAGAAGGGTTTCTTTTATTGAGAGAATTTTTAAAAAAGAGCCTAC
CCTTGAAGATTTATGGAAGAATA
GCTTAAAAGCCGAAGTTGACAGTTTTTATAAAGAATACGAATATGAA
ATAAGTAAAGATGAGAAGAAAAT
CGTAGTATCTTTTAAAGGAGATTATAAAGATTTTGAAATCCATAAAA
GATATCTTCTTTATAAGAATGAG
CCTTTTATTGATGTGGTTTATGAAATTAAAAATATCTCCAAAGAACCT
ATAACTTTAAACTTTGGATGGG
AGATAAATATTAACTTTTTAGCACCAAATCATCCTGATTACTACTTTT
TAATAAGAGATCAAAAATATCC
TCTCTCTTCTTTTGGAGTTGAAAAAGTTAATAATTGGAAAGTATTTTC
GGGTATAGGAATAGAATTGGAA
TGTTCTTTAGATATGGAAACTATTTTGTATAGATATCCTATAGAAAC
GGTGTCTCTTTCTGAGGAAGGAT
TTGAAAAAGTTTATCAAGGAAGTGCTCTCCTTCATTTTTATAAGATA
GATTTGCCCATTGACTTTAACTG
GAAGACCTCAATAAGATTTTTAGTTAAATAGAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAA3
E)CLONACIN
Protocolo de ligadura:
1- Centrifugue brevemente los tubos de ADN de pGEM-T o pGEM-T-Easy

Vector y control insertar para recoger el contenido ene l fondo de los tubos.
2- Centrifugue las reacciones de ligacin como se describir a continuacin.
NOTA: Use tubos de 0.5 ml que se sabe que tiene la capacidad de unin al
ADN (p. Ej. VWR Cat.#20170-310) Vortex el tampn de ligadura rpida 2X
vigorosamente antes de cada uso.
3- Mezcle las reacciones pipeteando. Incubar las reacciones durante 1 hora a
temperatura. Alternativaamente, si se requiere el nmero mximo de
transformantes, incube las reacciones durante la noche a 4C.
Notas:
1. Utilice nicamente la T4 DNA Ligase suministrada con este sistema para realizar
pGEM-T y pGEM-T Easy Vector ligaciones. Otras preparaciones comerciales de
T4 ADN ligasa pueden contener actividades de exonucleasa que pueden eliminar la
terminal desoxitimidinas del vector.
2. 2X Rapid Ligation Buffer contiene ATP, que se degrada durante las fluctuaciones
de temperatura. Evitar mltiples Freezethaw ciclos y exposicin a cambios
frecuentes al hacer alcuotas de un solo uso del buffer.
3. Tiempos de incubacin ms largos aumentarn la cantidad de transformantes.
En general, la incubacin durante la noche a 4 C produce la cantidad mxima de
transformantes.
4. Una alcuota de la reaccin de PCR debe analizarse en un gel de agarosa antes
de su uso en la reaccin de ligacin para verificar
que la reaccin produjo el producto deseado. El producto de PCR a ligar puede
purificarse en gel o purificarse directamente de la amplificacin por PCR usando el
gel SV Wizard y el sistema de limpieza de PCR (Cat. # A9281). Limpiar de
reacciones antes de la ligadura se recomienda para eliminar los dmeros de
cebadores u otros productos de reaccin no deseados, y para mejorar la eficacia de
la ligadura. La exposicin de los productos de PCR a la luz ultravioleta de onda corta
se debe minimizar para evitar la formacin de dmeros de pirimidina.
Secuencia y sitio de clonacin mltiple del vector

pGEM-T
El vector pGEM-T se deriva del vector pGEM-5Zf (+) (nmero de acceso X65308
de GenBank). El pGEM-T. El vector se cre linealizando el vector pGEM-5Zf
(+) con EcoRV en la base 51 y aadiendo una T a ambos extremos 3 '. El sitio
EcoRV no se recuperar tras la ligadura del vector y la insercin.
Figura 1. El promotor y la secuencia de clonacin mltiple del vector pGEM-T.

La cadena superior corresponde al ARN sintetizado por la ARN polimerasa T7. La
cadena inferior corresponde al ARN sintetizado por la ARN polimerasa SP6.
F) TRANSFORMACIN
G) EXTRACCIN DE ADN PLASMIDICO

Los plsmidos son molculas de DNA
extracomosomal los cuales estn presentes en
algunas clulas bacterianas, levaduras y
hongos.
Cuando se desea introducir un gen para
expresin en bacterias, es necesario que este
gen se encuentre en el vector adecuado para
que se obtengan los niveles de expresin
deseados. El vector que se va a utilizar es
generalmente amplificado en una cepa de E.
coli a partir de la cual se purifica. Los plsmidos
tienen una conformacin variable que puede ser lineal, circular o con estructura
superenrrollada (supercoiled DNA).
Protocolo de extraccin de Plsmidos (Mini-prep)

Da # 1 Inocular la bacteria deseada (contiene plsmido) en caldo nutritivo por 24
horas. Recordar que si el plsmido tiene algn gen de seleccin, como por ejemplo
resistencia a algn antibitico, se debe inocular la bacteria en un medio nutritivo que
contenga ese antibitico.
Da # 2 Transferir 1.5 ml de la bacteria en un microtubo (1.5ml) estril y centrifugar
a 13,000 rpm (revoluciones por minuto) por 2 minutos para formar un pellet de
bacterias. Descartar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 100 l de la
solucin I e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Recordar que la Sol. I
debe estar en hielo.
Aadir 200 l de la Solucin II (fra) y mezclar bien invirtiendo el microtubo.

Incubar en hielo por 5 minutos.
Aadir 150 l de las Solucin III y mezclar mediante vortex. Incubar en hielo
por 5 minutos.
Nuevamente vortex varios segundos y centrifugar por 5 minutos a 13,000
rpm.
Transferir el sobrenadante a un microtubo estril. Aadir 1 volumen de
phenol/cloroformo/alcohol isoamlico (1:1:4), vortex y centrifugar 1 minuto a
13,000 rpm.
Transferir la fase acuosa (arriba) a un microtubo estril y aadir 2 volumenes
de alcohol absoluto (etanol 100%). Mezclar invirtiendo el tubo y dejar
incubando por 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar por 5minutos a 13,000 rpm y descartar el sobrenadante.
Lavar el sedimento aadiendo1ml de alcohol al 70 % (etanol) y mezclar
invirtiendo
Dejar secar el sedimento no mas de 5 min.
Resuspender el sedimento en 50 l de TE 1X y aadir 1 l de RNAasa A.
Guardar a -200 C.
BIBLIOGRAFA:
Experimento, O. D. E. L. (n.d.). Extraccin adn plasmdico.
Gibbs, M. D., & Reeves, R. A. (1995). Cloning , Sequencing , and Expression of a

Xylanase Gene from the Extreme Thermophile Dictyoglomus thermophilum
Rt46B . 1 and Activity of the Enzyme on Fiber-Bound Substrate, 61(12), 4403
4408.
Lpez, R. R. (n.d.). Gentica de Bacterias.
Corporation, P. (n.d.). pGEM(R)-T and pGEM(R)-T Easy Vector Systems Technical

Manual TM042.
Promega. (2010). pGEM- T and pGEM- T Easy Vector Systems. Technical

Manual, 128. Retrieved from
https://www.promega.co.uk/~/media/files/resources/protocols/technical
manuals/0/pgem-t and pgem-t easy vector systems protocol.pdf
Ingeniera, B., Enzimas, D., & Paenibacillus, X. B. De. (2014). Caracterizacin de

Nuevas Xilanasas scar Gallardo Romn, (December 2007).
https://doi.org/10.13140/2.1.2606.5927

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Nombre de oligonucletido Secuencia (5 a 3)

El segundo primer se hace de manera diferente ya que consta de tres pasos;

2) Ahora se escribe al contrario de la cadenita de bases nitrogenadas que

D) MEZCLA DE REACCIN Y PCR

Amylase chain reaction (PCR)

1- Centrifugue brevemente los tubos de ADN de pGEM-T o pGEM-T-Easy

Secuencia y sitio de clonacin mltiple del vector

Figura 1. El promotor y la secuencia de clonacin mltiple del vector pGEM-T.

G) EXTRACCIN DE ADN PLASMIDICO

Protocolo de extraccin de Plsmidos (Mini-prep)

Aadir 200 l de la Solucin II (fra) y mezclar bien invirtiendo el microtubo.

Gibbs, M. D., & Reeves, R. A. (1995). Cloning , Sequencing , and Expression of a

Lpez, R. R. (n.d.). Gentica de Bacterias.

Corporation, P. (n.d.). pGEM(R)-T and pGEM(R)-T Easy Vector Systems Technical

Promega. (2010). pGEM- T and pGEM- T Easy Vector Systems. Technical

Ingeniera, B., Enzimas, D., & Paenibacillus, X. B. De. (2014). Caracterizacin de

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