PRACTICA No 4 A

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO MTODOS DE AISLAMIENTO,

Las bacterias son organismos supremamente adaptables a diferentes
sustratos. Con base en sus requerimientos nutricionales se consideran como
exigentes y no exigentes. Su estudio se ha hecho posible gracias a la
implementacin de los medios de cultivo que le suministran a los organismos
los elementos necesarios para su crecimiento. Los medios de cultivo son
preparaciones utilizadas para muchos propsitos.

1. Aislamiento e identificacin de microorganismos

2. Pruebas de esterilidad
3. Anlisis de agua, ambientales, alimentos y productos bacteriolgicos
4. Pruebas de sensibilidad a los antibiticos

Las bacterias auttrofas pueden utilizar el nitrgeno libre, amoniaco o nitrato de

tal manera que los medios pueden se muy simples; los hetertrofos son de
capacidad sinttica ms limitada; requieren compuestos ms complejos debido
a que las clulas no pueden obtener sus requerimientos de nitrgeno
directamente de las protenas, estas deben estar hidrolizadas en compuestos
nitrogenados ms disponibles; estos hidrolizados son conocidos como
peptonas, derivados de las protenas por medio de cidos, lcalis o enzimas y
son solubles en agua.

Composicin de los medios de cultivo:

Aunque los diferentes medios contienen gran cantidad de sustancias

dependiendo del microorganismo que se desee aislar, bsicamente estn
compuestos de:

Peptonas:
Varan de pureza y calidad dependiendo del tipo de hidrlisis realizado. Los
lcalis tienden a destruir el contenido vitamnico de la protena y tambin hacen
perder parte de los aminocidos; la hidrlisis enzimtica conserva las vitaminas
y aminocidos; la casena pura no contiene carbohidratos y tiene alto contenido
vitamnico y de triptfano. Ej.: Una peptona, casena digerida digerida por la
tripsina no sirve para pruebas de fermentacin, pero s para detectar
produccin de indol, la casena hidrolizada por cido no contiene triptofano ni
carbohidratos y puede utilizarse en ensayos de contenido vitamnico en suero
por no tener vitaminas; la peptona de la gelatina obtenida por accin enzimtica
no tiene carbohidratos ni triptfano puesto que no estn presentes en la
gelatina pura. Las peptonas de leche, carne y levaduras contienen
carbohidratos respectivos, presentes en el material original y por lo tanto no
deben utilizarse en pruebas de fermentacin.

Infusin y extractos:
Son de carne y otros tejidos; se trata del material de origen proteico, soluble en
agua, sin accin enzimtica. Las protenas mismas se desnaturalizan por el
calor, afortunadamente la accin enzimtica microbiana y el tiempo de
incubacin aumentan la facilidad de utilizacin.

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Agentes solidificantes:
Agar, gelatina, agarosa, agar nutritivo.

Agentes selectivos:
Colorantes: Cristal violeta o brillante, inhiben Gram positivos.
NaCl, Azida de sodio, Citrato de sodio, telurito de potasio, lauril sulfato
de sodio.
PH 8.0-9.0 es selectivo para bacterias como Vibrio cholerae
Agentes antimicrobianos.

Otros componentes:
Indicadores de pH.
Indicadores de xido-reduccin: azul de metileno.

Cuidado y recomendaciones:
Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus componentes o
segn las recomendaciones del fabricante, cuando este se consigue
comercialmente hay varias reglas que se deben guardar para asegurar
la buena calidad del medio preparado.
El agua utilizada debe ser destilada o desmineralizada, bidestilada o
desmineralizada, proveniente de un sistema adecuado de destilacin; su
medida debe ser exacta y en ningn momento con aproximaciones que
generalmente traducen en una alteracin de la consistencia del medio,
especialmente cuando se trata de agares.
Si los ingredientes necesarios para preparar el medio de cultivo son
deshidratados deben permanecer en remojo durante 15 minutos, con la
finalidad de permitir una deshidratacin total de las molculas, lo cual
facilita el calentamiento excesivo que condice generalmente a
evaporacin y descomposicin del medio.
Antes de someterse a la accin de la autoclave el medio debe estar
completamente disuelto. No disolviendo con la temperatura del
autoclave, pues generalmente el exceso de calor produce un medio con
grumos debido a una deficiente disolucin.
Los medios de cultivo que contienen yema de huevo, carbohidratos,
urea o cualquier otro nutriente, no pueden ser esterilizados en autoclave;
estos medios se preparan esterilizando por separado lo que conocemos
como base (se esteriliza en autoclave) y los suplementos por filtracin o
vapor fluente; la mezcla de los componentes se efecta cuando la base
se ha enfriado entre 45 y 50oC
Algunos medios presentan un precipitado despus de prepararlos, ste
debe separarse por centrifugacin o evitar que el flote y sea vertido en la
caja de petri, lo cual dificulta la visualizacin de las colonias.
Los medios Agar SS, bismuto de sulfito y otros no pueden ser
esterilizados en autoclave.
Todos los medios de cultivo despus de preparalos y vertirlos en la caja
de petri estriles, deben ser secados, con la finalidad de eliminar el
exceso de agua que queda en la superficie para evitar la condensacin y
mezcla de las colonias cuando se hace la siembra. El secado de la

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 superficie tambin previene la contaminacin; se lleva a cabo en la
estufa incubadora a 37oC durante 20 minutos aproximadamente,
quitando la tapa de la caja y colocando el medio con una superficie hacia
abajo. Despus del secado las cajas de petri se pueden guardar en
refrigeracin envueltas en bolsas plsticas hasta por tres meses,
dependiendo del medio de cultivo. Los medios que contienen antibiticos
deben ser utilizados en corto tiempo.

Clasificacin de los medios:

a. Slidos: Aquellos que contienen agar, gelatina o huevo coagulado.

b. Lquidos: son los tambin llamados calos de cultivo

c. Selectivos: Poseen sustancias que favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos, Ej.: Mc Conkey
d. Diferenciales: Son aquellos donde el metabolismo bacteriano produce
cambios en el medio, lo cual permite la diferenciacin de la bacterias.
e. Mantenimiento: Son preparaciones utilizadas para conservar cepas
bacterianas. Ej.: BAB y agar blanco para enterobacterias.
f. Medios no selectivos: Permiten el desarrollo de diversos tipos
microbianos. Ej.: Caldo nutritivo y agar nutritivo.
g. Enriquecidos: Contienen sangre, leche, suero, extracto de animales o
vegetales; los cuales incrementan el nmero de bacterias deseadas.
Estos medios de cultivo y su utilizacin se basan en el aprovechamiento
ptimo de nutrientes combinados con temperaturas y pH adecuado. Por
Ej.: Agar sangre.

OBJETIVO

Aplicar tcnicas para el desarrollo de los medios de cultivo y la importancia de

sus componentes para crecimiento bacteriano.

MATERIALES Y METODOS

Observacin de los medios deshidratados comerciales. Para cada uno de los

medios que estn dispuestos en exhibicin, anotar los siguientes datos:
nombre, composicin, usos, preparacin. Destapar el envase y determinar (sin
tocar el contenido): Color, olor, textura(cristales, grnulos, polvo)

Preparacin de medios de cultivo comerciales: Hacer el clculo de material

necesario de acuerdo a lo recomendado por el fabricante y la cantidad que se
va a preparar.

Agar nutritivo: preparacin para caja de petri para siembra en superficie, y

tubo en columna
Caldo nutritivo:
Medios para dilucin (agua peptonada)

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

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La observacin e interpretacin de los cultivos primarios (24 a 48 horas)
despus de la incubacin es el paso definitivo en la decisin de continuar o no
con la identificacin de los microorganismos aislados. La decisin se basa en la
observacin de las caractersticas, nmero de cada tipo de colonia, grado de
pureza, coloracin de Gram y los cambios en el medio de cultivo que rodea la
colonia (los cuales reflejan la actividad metablica de la bacteria aislada,
elemento de importancia en la identificacin.

Caractersticas del crecimiento. Se debe tener en cuenta el aspecto que

presente, el tamao, elevacin, margen, superficie, consistencia y forma
(puntiforme, circular, filamentosa, rizoide, etc.)

Cambios en medios diferenciales: Varios colorantes indicadores de pH

evidencian la actividad metablica y ayudan a identificar las colonias aisladas.

OBJETIVOS

Aplicar los mtodos bacteriolgicos ms usuales para el crecimiento y

aislamiento de microorganismos.

MATERIALES

- Cajas de petri con agar nutritivo

- Cajas de petri vacas y estriles
- Tubos de ensayo con 9 mL de agua peptonada
- Tubos de ensayo con agar nutritivo fundido y enfriado a 45 oC
- Tubos de ensayo con agar nutritivo inclinado

METODO DE SIEMBRA

Caractersticas de los cultivos bacterianos y fngicos en medio lquido,

caja de petri y agar inclinado.

* Esterilice el asa en la llama del mechero calentndola completamente hasta el

rojo vivo.
* Con el asa siembre una muestra de los microorganismos entregados para la
prctica. En un tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado introduzca el asa en
lnea recta; en otro tubo inocule la superficie del tubo. Flamee la boca del tubo
y tpelo. Flamee nuevamente el asa y repita el procedimiento con cada uno de
los tubos con microorganismos entregados y con los sembrados.
* Obtenga una segunda muestra de cada cultivo bacteriano y raye nuevamente
de manera horizontal en zig-zag sobre la superficie del agar contenido en las
cajas de petri. Tape flamee el borde de la caja, esterilice el asa y repita la
operacin con las otras cajas a sembrar.
* Inocule de manera similar las bacterias disponibles en caldo de cultivo,
agitando bien el asa dentro del caldo. (Ver figuras)

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 Toma de muestra

Tcnica de siembra en caldo

Siembra en caldo de cultivo

TECNICA DE SIEMBRA EN PLACA DE PETRI

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 Siembra en caja de petri

TECNICA DE SIEMBRA EN TUBO INCLINADO

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 Prueba de motilidad en agar. 1. Microorganismo mvil
2. Microorganismo inmvil. 3. Tubo control sin inculo

Obtencin de cultivos axnicos

a. En superficie

Con el asa bacteriolgica tomar una muestra de un tubo que contiene un

cultivo bacteriano mixto, sembrar por estras sobre un tercio de la caja
de petri que contiene agar nutritivo,
Flamee el asa
En un extremo de la caja con agar realice rayados suaves en forma
horizontal sobre la superficie del agar utilizando el asa (formando
estras) para realizar el primer aislamiento bacteriano, gire la caja 90 o y
flamee el asa; contine el aislamiento en los tres extremos restantes de
la caja realizando el mismo procedimiento en los tres extremos restantes
de la caja. En el ltimo extremo, cuando est realizando la estriacin,
tenga cuidado de no tocar con el asa el primer aislamiento que realiz,
(ver esquema)-

Tcnica de siembra en superfcie

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 Aislamiento por estras en superfcie

b. En profundidad

Tcnica usada para hacer recuento a partir de diluciones. Con este mtodo de
siembra es ms fcil observar reacciones metablicas bacterianas, tales como
liplisis, protelisis etc.

El medio de cultivo preparado en tubos debe estar fundido y a 45 oC

Se le agrega 1 mL de la dilucin a sembrar en el centro de la caja de
petri estril.
Verter el medio de cultivo en la caja de petri y homogenizar por
movimientos giratorios horizontales en varias direcciones, teniendo
cuidado de no formar burbujas. Dejar solidificar e incubar. (Ver
esquema).

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 Tcnica de siembra en profundidad

c. Por dilucin en agar

Este mtodo se basa en la siembra de la muestra directamente en el

tubo de agar fundido y enfriado a 45 oC, coloque la muestra tomada con
el asa, agite por rotacin suave para mezclar el inculo.
Con el asa estril tome una muestra del tubo No1 y simbrela en el tubo
No2 ,mezclar como en el paso anterior.
Proceda a depositar el contenido del tubo No1 en la caja de petri vaca y
estril.
Con el asa estril tome una muestra del tubo No2 y siembre en el tubo
No3; vierta el contenido del tubo No2 en una caja de petri vaca, haga
igualmente con el tubo No3.
Lleve las cajas debidamente marcadas a la incubadora.