Objetivos

Manipula e identifica los microorganismos en funcin a su comportamiento bioqumico

Marco terico

El trmino metabolismo se refiere al conjunto dereacciones qumicas que tiene lugar en la clula, y
tiene tres funciones especficas:

1. obtener energa qumica del entorno, almacenarla, para utilizar luego en diferentes funciones
celulares.

2. convertir los nutrientes exgenos en unidadesprecursoras de los componentes macromoleculares

de la clula bacteriana.

3. formar y degradar molculas necesarias para funcionescelulares especficas, como por ejemplo,
movilidad ycaptacin de nutrientes.

El metabolismo tiene lugar a travs de secuencias dereacciones catalizadas enzimticamente, y se

divide enanabolismo y catabolismo. El proceso por el cual laclula bacteriana sintetiza sus propios
componentes se conoce como anabolismo, y como resulta en laproduccin de nuevo material celular,
tambin se
denomina biosntesis.

La biosntesis es un proceso que requiere energa, por lotanto las bacterias deben ser capaces de
obtenerla de suentorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. Elconjunto de reacciones
degradativas de los nutrientes para obtener energa o para convertirlos en unidadesprecursoras de la
biosntesis, se conoce como catabolismo.

La diversidad metablica que presentan las bacterias permite ayudar con su identificacin a nivel de
gnero y especie, gracias a que los sustratos que utilizan, ya que son especficos de ciertas enzimas
genticamente determinadas.

De esta manera surgen los medios de cultivo bacteriano selectivos en el laboratorio como lo son:

Medios generales: Permiten el crecimiento de la mayora de las bacterias presentes en la muestra.

(Agar sangre, agar chocolate, agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo cerebro corazn)...

Medios selectivos: Permiten el crecimiento de slo determinado tipo de bacteria presente en la

muestra, impidiendo el desarrollo de otras debido a que contienen sustancias (antibiticos, colorantes,
sales,) que inhiben el desarrollo de ciertas bacterias. (Agar manitol salado (alta concentracin de
NaCl), Agar Thayer-Martin (presencia de antibiticos), agar EMB (contiene eosina y azul de metileno
que inhiben a las bacterias gram positivas)

Medios diferenciales: Poseen sustancias que permiten diferenciar entre grupos bacterianos segn
determinadas caractersticas biolgicas (hemlisis, fermentacin de azcares, precipitacin de
sales,) y permiten realizar una identificacin presuntiva inicial de las bacterias presentes en la
muestra. (agar sangre (hemlisis), agar EMB (fermentacin de lactosa),).

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales

Placas con agar nutritivo con 1% de almidn

Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR VP (Rojo de Metilo Voges Proskauer), caldo
lactosado con indicador de Andrade.
Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado y . .
con TSA.
Cultivos de: E. coli, B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter, Proteus vulgaris, Staphylococcus.
aureus, Streptococcus viridans.
Lugol.
Reactivos de: kovacs, rojo de metilo, Voges Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol amlico,
KOH creatina al 40%
Tiras de papel de filtro impregnadas con solucin saturada de acetato de plomo.
Perxido de hidrgeno al 3%.
Campanas de Durham y pipetas Pasteur.

Procedimiento

1. Accin sobre los hidratos de carbono

Fermentacin de hidratos de carbono:
Primer da
- Inocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli, S.aureus, P.vulgaris.
- Toma un cuarto tubo sin sembrar como control.
- Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Despus del perodo de incubacin, compara cada uno de los tubos inoculados, con el tubo
control.
- Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de carbono (lactosa), se detecta por la inclusin del
indicador de Andrade.
- Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metablico a CO2 e H+
se observar la presencia de gas, en forma de burbujas.
 Produccin de cidos y acetil-metil-carbinol (acetona):

Prueba de Voges Proskauer (VP)

Primer da
Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.
Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
A cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH
creatina.
Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto.
Deja en reposo durante 15 minutos.
La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o en todo
el tubo dentro de los primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetil-metil-carbinol.
Si la lectura se realiza despus de 1 hora, los cultivos pueden presentar una coloracin cobriza,
siendo esta una respuesta falsa positiva.
La reaccin es negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.

Prueba de rojo de metilo:

Primer da
- Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
- Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo
correspondiente.
- Incuba a 37C por 48 a 72 horas.
Segundo da
- Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH
4.4 (rojo) y 6.0 (amarillo).
- La prueba es negativa si da una coloracin amarillo naranja.
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable.

Principios bioqumicos de las reacciones en TSI:

Primer da
- Con el asa de siembra, inocula una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estra
la superficie del pico de flauta.
- Rotula e incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.
- Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa (que se
encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la cantidad
de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la
utilizacin de las peptonas. Estos procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie del
medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxgeno, solo hay fermentacin
y el medio permanece cido.
- Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentacin de la glucosa y
alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cido, por lo que el tubo
permanece amarillo.
- No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta nicamente utilizacin
oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.
- Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
2. Accin sobre las protenas

Produccin de indol:
Primer da
- Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis.
- Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.
- Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
- Agrega 4 gotas del reactivo de Kovacs, dejando resbalar por la pared interna de cada tubo
que presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.
- La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior
del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo.
- Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol, permanecern sin
cambio alguno (reaccin negativa).

Produccin de sulfuro de hidrgeno:

Primer da
- Por la tcnica de puntura y estra, siembra separadamente en el medio TSA las cepas de E.
coli y P. vulgaris.
- Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo.
- Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
- Observa el ennegrecimiento del papel de filtro, por la produccin del sulfuro de hidrgeno
(reaccin positiva).
-
3. Pruebas bioqumicas diferenciales

Utilizacin del citrato:

Primer da
- Siembra por la tcnica de estra en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter
aerogenes.
- Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en
24 a 48 horas.
- Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.

Hidrlisis de la rea:
Primer da
- Por la tcnica de estra, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris. No
inocular el fondo.
- Rotula e incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
- La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el tubo.
- La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.
 Prueba de la catalasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de
Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inculo a un portaobjetos
limpio.
- Aade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
- Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.

Reaccin de la citocromo oxidasa:

- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de
E.coli o Ps. aeruginosa, y transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.
Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo intensa en la tira,
en un mximo de 5 segundos.

Resultados

METABOLISMO BACTERIANO

Familia Kliger H2 GA CITRA SIM AGAR CALD

Enterobacteria S S TO DE BLANDO O
ceae (O2 SIMON UREA
Fon Inclina ) S IND MOTILID UREA
do do OL AD SA
3. K K - + + - + v
Pseudomona
aeuruginosa
6. Shigella sp A K - + - - V v

V: variable dudosa K: alcalino A: cido

Discusin de resultados

La prueba de Kliger dio como resultado (k, k) ya que el medio se torn ms rojizo (alcalino), lo
que indica que nuestra bacteria es no puede realizar fermentacin anaerbica de la glucosa o
la lactosa, porque si as fuera se visualizara amarilla al adquirir un carcter acido.

Para la prueba citrato de Simons nuestra bacteria dio positivo ya que el medio cambio su color
inicial a uno azul rey, por ende la bacteria nmero tres posee la enzima citrato permeasa que le
permite desdoblar el citrato y alcalinizar el medio.
 En la prueba de hidrolisis de la urea dio V ya que el medio pareca conservar su color inicial, sin
embargo puede que la bacteria si posea la enzima ureasa y como su sustrato se encontraba
presente en el medio en muy bajas concentraciones el cambio de color no sea perceptible.

Prueba con perxido al agregar (H2O2) a la bacteria se gener un burbujeo (O2) moderado lo
que indica que esta posee la enzima peroxidasa

En la prueba de amilasa al agregar lugol al cultivo el borde que rodeaba la bacteria se torn
oscuro por ende esta no posee esta enzima. Esta misma se le realizo a las bacterias de la boca
dando como resultado positivo lo que indica que estas presentan la enzima amilasa

En la prueba de SIM

1. En donde se comprobaba si la bacteria poda generar cido sulfhdrico a partir de

aminocidos azufrados resulto negativa ya que no se observ un precipitado negro por que
no se produjo sulfato ferroso,

2. prueba de INDOL al adicionar el reactivo de Kovacs no se produjo el anillo rojo violeta por
consiguiente se puede deducir que la bacteria no posee la triptofanasa para degradar el
triptfano.

3. En la prueba de motilidad nuestra bacteria dio positivo ya que se pudo observar un patrn
de crecimiento segregado a partir de la siembra.

La prueba de Kliger dio como resultado (A, k) ya que el medio se torn un poco ms rojizo (alcalino
k) y en el extremo inferior solo un tanto amarilloso (cido A), lo que indica que nuestra bacteria
es Gram negativa debido a la fermentacin anaerbica de la glucosa, pues dicho tono se puede
observar gracias a la formacin de productos terminales cidos estables y por lo tanto pH cido.

Para la prueba citrato de Simons la bacteria seis dio negativo ya que el medio no cambio su
color inicial, por ende la bacteria no es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono.

En la prueba de hidrolisis de la urea dio V ya que el medio pareca conservar su color inicial, sin
embargo puede que la bacteria si posea la enzima ureasa y como su sustrato se encontraba
presente en el medio en muy bajas concentraciones el cambio de color no sea perceptible.

Prueba con perxido al agregar (H2O2) a la bacteria se gener un burbujeo (O 2) moderado lo

que indica que esta posee la enzima peroxidasa
 En la prueba de amilasa al agregar lugol al cultivo el borde que rodeaba la bacteria se torn
oscuro por ende esta no degrada el almidn.

En la prueba de SIM

1. En donde se comprobaba si la bacteria poda generar cido sulfhdrico a partir de

aminocidos azufrados resulto negativa ya que no se observ un precipitado negro por que
no se produjo sulfato ferroso.

2. prueba de INDOL al adicionar el reactivo de Kovacs no se produjo el anillo rojo violeta por
consiguiente se puede deducir que la bacteria no posee la triptofanasa para degradar el
triptfano.

3. En la prueba de motilidad nuestra bacteria dio V ya que no se hizo bien la siembra debido
al mal pulso del estudiante.

Prueba de fermentacin de carbohidratos Se sembr E. coli y Staphylococcus aureus, dando como

resultado un cambio de color de naranja a amarillo brillante en el tubo que contena la muestra de
S. aureus y un amarillo opaco para E. coli, ya que no obtuvimos produccin de gases en ninguna
de las dos y no podemos contrastar con un control, deducimos que para E. coli la muestra resulta
positiva pues se produjo un precipitado blanco. A estas dos bacterias tambin se les realizo la
prueba del perxido, obteniendo una mayor produccin de O2 en S. aureus.

Conclusin

A partir de estos resultados se pudo llegar a la conclusin que la bacteria problema nmero
seis es Shigella sp.

A partir de estos resultados se pudo llegar a la conclusin que la bacteria problema nmero
tres es Pseudomona aeuruginosa.

El hecho de saber un poco a cerca de la diversidad metablica presente en bacterias ha

permitido durante muchos aos su cultivo, aislamiento y explotacin en diferentes reas de
la industria y la medicina, sin embargo es largo el camino por recorrer la meta a alcanzar es
lograr cultivar en el laboratorio muchsimas veces ms ese pequeo 1% que hasta el
momento sea logrado.

Referencias Bibliograficas

Prescott L / Harley J, / Klein D. Microbiologa 576/P 85, 2000

Mac faddin, Jean F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia
clnica. Madrid. 574.19285/412. 2003