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CURSOS BASICOS
LABORATORIO DE
PROTEINAS
LABORATORIO ORGANICA
Laboratorio de protenas
I. Objetivos de la practica
Objetivo general :
o Analizar y reconocer protenas, considerando las caractersticas que
presenta despus de los cambios producidos por agentes fsicos o
qumicos.
Objetivos especficos:
o Estudiar la desnaturalizacin de la protena.
o Detencin de protenas azufradas.
o Verificar la reaccin de Biuret.
o Determinar las reacciones xantoproteicas.
o Simular la digestin de protenas.
A. Protena
Las protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. El nombre
protena proviene de la palabra griega ("proteios"), que significa "primario" o del dios,
por la cantidad de formas que pueden tomar.
Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y son las biomolculas ms
verstiles y ms diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una
enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:
Las protenas de todos los seres vivos estn determinadas mayoritariamente por su gentica (con
excepcin de algunos pptidos antimicrobianos de sntesis no ribosomal), es decir, la
informacin gentica determina en gran medida qu protenas tiene una clula, un tejido y un
organismo.
Las protenas se sintetizan dependiendo de cmo se encuentren regulados los genes que las
codifican. Por lo tanto, son susceptibles a seales o factores externos. El conjunto de las
protenas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteoma.
Caractersticas
Los prtidos o protenas son biopolmeros, es decir, estn constituidas por gran nmero de
unidades estructurales simples repetitivas (monmeros). Debido a su gran tamao, cuando estas
molculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman siempre dispersiones coloidales, con
caractersticas que las diferencian de las disoluciones de molculas ms pequeas.
Todas las protenas tienen carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno y casi todas poseen tambin
azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes protenas, el contenido de nitrgeno
representa, por trmino medio, 16% de la masa total de la molcula; es decir, cada 6,25 g de
protena contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza para estimar la cantidad de protena
existente en una muestra a partir de la medicin de N de la misma.
La sntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las clulas segn las directrices de la
informacin suministrada por los genes.
Las protenas son largas cadenas de aminocidos unidas por enlaces peptdicos entre el grupo
carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminocido adyacentes. La
secuencia de aminocidos en una protena est codificada en su gen (una porcin de ADN)
mediante el cdigo gentico. Aunque este cdigo gentico especifica los 20 aminocidos
"estndar" ms la selenocistena y en ciertos Archaea la pirrolisina, los residuos en una
protena sufren a veces modificaciones qumicas en la modificacin postraduccional: antes de
que la protena sea funcional en la clula, o como parte de mecanismos de control. Las protenas
tambin pueden trabajar juntas para cumplir una funcin particular, a menudo asocindose para
formar complejos proteicos estables.
Funciones
Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas constituyentes de los
seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los procesos biolgicos dependen de la
presencia o la actividad de este tipo de molculas. Bastan algunos ejemplos para dar idea de la
variedad y trascendencia de las funciones que desempean. Son protenas:
Los receptores de las clulas, a los cuales se fijan molculas capaces de desencadenar
una respuesta determinada;
La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del msculo durante la
contraccin;
El colgeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostn.
Estructura
Es la manera como se organiza una protena para adquirir cierta forma. Presentan una
disposicin caracterstica en condiciones fisiolgicas, pero si se cambian estas condiciones
como temperatura, pH, etc. pierde la conformacin y su funcin, proceso denominado
desnaturalizacin. La funcin depende de la conformacin y sta viene determinada por la
secuencia de aminocidos.
Estructura primaria.
Estructura secundaria.
o Nivel de dominio.
Estructura terciaria.
Estructura cuaternaria.
Reacciones de reconocimiento
Reaccin de Biuret
El reactivo de Biuret est formado por una disolucin de sulfato de cobre en medio alcalino,
este reconoce el enlace peptdico de las protenas mediante la formacin de un complejo de
coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que
forma parte de los enlaces peptdicos, lo que produce una coloracin rojo-violeta.
Reaccin de Millon
Reconoce residuos fenlicos, o sea aquellas protenas que contengan tirosina. Las protenas se
precipitan por accin de los cidos inorgnicos fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco
que se vuelve gradualmente rojo al calentar.
Reaccin xantoproteica
Reconoce grupos aromticos, o sea aquellas protenas que contengan tirosina o fenilalanina, con
las cuales el cido ntrico forma compuestos nitrados amarillos.
La estabilidad de una protena es una medida de la energa que diferencia al estado nativo de
otros estados "no nativos" o desnaturalizados. Hablaremos de estabilidad termodinmica cuando
podamos hacer la diferencia de energa entre el estado nativo y el desnaturalizado, para lo cual
se requiere reversibilidad en el proceso de desnaturalizacin. Y hablaremos de estabilidad
cintica cuando, dado que la protena desnaturaliza irreversiblemente, slo podemos diferenciar
energticamente la protena nativa del estado de transicin (el estado limitante en el proceso de
desnaturalizacin) que da lugar al estado final. En el caso de las protenas reversibles, tambin
se puede hablar de estabilidad cintica, puesto que el proceso de desnaturalizacin tambin
presenta un estado limitante. Actualmente se ha demostrado que algunas protenas reversibles
pueden carecer de dicho estado limitante, si bien es un tema an controvertido en la bibliografa
cientfica.
El resto de tcnicas miden propiedades de las protenas que son distintas en el estado nativo y en
el estado desplegado. Entre ellas se podran citar la fluorescencia de triptfanos y tirosinas, el
dicrosmo circular, radio hidrodinmico, espectroscopia infrarroja, resonancia magntica
nuclear, etc. Una vez hemos elegido la propiedad que vamos a medir para seguir la
desnaturalizacin de la protena, podemos distinguir dos modalidades: Aquellas que usan como
agente desnaturalizante el incremento de temperatura y aquellas que hacen uso de agentes
qumicos (como urea, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, alcoholes, etc.). Estas
ltimas relacionan la concentracin del agente utilizado con la energa necesaria para la
desnaturalizacin. Una de las ltimas tcnicas que han emergido en el estudio de las protenas es
la microscopa de fuerza atmica. Esta tcnica es cualitativamente distinta de las dems, puesto
que no trabaja con sistemas macroscpicos sino con molculas individuales. Mide la estabilidad
de la protena a travs del trabajo necesario para desnaturalizarla cuando se aplica una fuerza
por un extremo mientras se mantiene el otro extremo fijo a una superficie.
Clasificacin
a) Segn su forma
Fibrosas: presentan cadenas polipeptdicas largas y una estructura secundaria atpica.
Son insolubles en agua y en disoluciones acuosas. Algunos ejemplos de stas son
queratina, colgeno y fibrina.
Globulares: se caracterizan por doblar sus cadenas en una forma esfrica apretada o
compacta dejando grupos hidrfobos hacia adentro de la protena y grupos hidrfilos
hacia afuera, lo que hace que sean solubles en disolventes polares como el agua. La
mayora de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas y protenas de transporte, son
ejemplos de protenas globulares.
Mixtas: posee una parte fibrilar (comnmente en el centro de la protena) y otra parte
globular (en los extremos).
Fuentes de protenas
Las fuentes dietticas de protenas incluyen carne, huevos, soja, granos, legumbres y productos
lcteos tales como queso o yogurt. Las fuentes animales de protenas poseen los 20
aminocidos. Las fuentes vegetales son deficientes en aminocidos y se dice que sus protenas
son incompletas. Por ejemplo, la mayora de las legumbres tpicamente carecen de cuatro
aminocidos incluyendo el aminocido esencial metionina, mientras los granos carecen de dos,
tres o cuatro aminocidos incluyendo el aminocido esencial lisina.
Deficiencia de protenas
Deficiencia de protenas en el tercer mundo La deficiencia de protena es una causa
importante de enfermedad y muerte en el tercer mundo. La deficiencia de protena juega una
parte en la enfermedad conocida como kwashiorkor. La guerra, la hambruna, la sobrepoblacin
y otros factores incrementaron la tasa de malnutricin y deficiencia de protenas. La deficiencia
de protena puede conducir a una inteligencia reducida o retardo mental. La malnutricin
proteico calrica afecta a 500 millones de personas y ms de 10 millones anualmente. En casos
severos el nmero de clulas blancas disminuye, de la misma manera se ve reducida
drsticamente la habilidad de los leucocitos de combatir una infeccin.
Algunos sospechan que el consumo excesivo de protenas est ligado a varios problemas:
Las protenas son frecuentemente causa de alergias y reacciones alrgicas a ciertos alimentos.
Esto ocurre porque la estructura de cada forma de protena es ligeramente diferente. Algunas
pueden desencadenar una respuesta a partir del sistema inmune, mientras que otras permanecen
perfectamente seguras. Muchas personas son alrgicas a la casena (la protena en la leche), al
gluten (la protena en el trigo) y otros granos, a la protena particular encontrada en el man o
aquellas encontradas en mariscos y otras comidas marinas.
Es extremadamente inusual que una misma persona reaccione adversamente a ms de dos tipos
diferentes de protenas, debido a la diversidad entre los tipos de protenas o aminocidos. Aparte
de eso, las protenas ayudan a la formacin de la masa muscular, para todas aquellas personas
que les guste hacer ejercicio, en cuyo caso se recomienda la pechuga de pollo salcochado debido
al alto ndice de protena que tiene (no se debe consumir la grasa).[3]
El nico componente de la mayora de los alimentos que contiene nitrgeno son las protenas
(las grasas, los carbohidratos y la fibra diettica no contienen nitrgeno). Si la cantidad de
nitrgeno es multiplicada por un factor dependiente del tipo de protena esperada en el alimento,
la cantidad total de protenas puede ser determinada. En las etiquetas de los alimentos, la
protena es expresada como el nitrgeno multiplicado por 6,25, porque el contenido de
nitrgeno promedio de las protenas es de aproximadamente 16%. El mtodo de Kjeldahl es
usado porque es el mtodo que la AOAC International ha adoptado y por lo tanto es usado por
varias agencias alimentarias alrededor del mundo.
Digestin de protenas
La digestin de las protenas se inicia tpicamente en el estmago, cuando el pepsingeno es
convertido a pepsina por la accin del cido clorhdrico, y contina por la accin de la tripsina y
la quimotripsina en el intestino. Las protenas de la dieta son degradadas a pptidos cada vez
ms pequeos, y stos hasta aminocidos y sus derivados, que son absorbidos por el epitelio
gastrointestinal. La tasa de absorcin de los aminocidos individuales es altamente dependiente
de la fuente de protenas. Por ejemplo, la digestibilidad de muchos aminocidos en humanos
difiere entre la protena de la soja y la protena de la leche2 y entre protenas de la leche
individuales, como beta-lactoglobulina y casena.3 Para las protenas de la leche,
aproximadamente el 50% de la protena ingerida se absorbe en el estmago o el yeyuno, y el
90% se ha absorbido ya cuando los alimentos ingeridos alcanzan el leon.4
Adems de su rol en la sntesis de protenas, los aminocidos tambin son una importante fuente
nutricional de nitrgeno. Las protenas, al igual que los carbohidratos, contienen cuatro
kilocaloras por gramo, mientras que los lpidos contienen nueve kcal., y los alcoholes, siete
kcal. Los aminocidos pueden ser convertidos en glucosa a travs de un proceso llamado
gluconeognesis
B. Aminoacidos
Un aminocido, como su nombre indica, es una molcula orgnica con un grupo amino (-NH2)
y un grupo carboxlico (-COOH; cido). Los aminocidos ms frecuentes y de mayor inters
son aquellos que forman parte de las protenas. Dos aminocidos se combinan en una reaccin
de condensacin que libera agua formando un enlace peptdico. Estos dos "residuos"
aminoacdicos forman un dipptido. Si se une un tercer aminocido se forma un tripptido y as,
sucesivamente, para formar un polipptido. Esta reaccin ocurre de manera natural en los
ribosomas, tanto los que estn libres en el citosol como los asociados al retculo
endoplasmtico.
Todos los aminocidos componentes de las protenas son alfa-aminocidos. Por lo tanto, estn
formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrgeno y a
una cadena (habitualmente denominada R) de estructura variable, que determina la identidad y
las propiedades de los diferentes aminocidos; existen cientos de cadenas R por lo que se
conocen cientos de aminocidos diferentes, pero slo 20 forman parte de las protenas y tienen
codones especficos en el cdigo gentico.
"R" representa la cadena lateral, especfica para cada aminocido. Tcnicamente hablando, se
los denomina alfa-aminocidos, debido a que el grupo amino (NH2) se encuentra a un tomo
de distancia del grupo carboxilo (COOH). Como dichos grupos funcionales poseen H en sus
estructuras qumicas, son grupos susceptibles a los cambios de pH; por eso, al pH de la clula
prcticamente ningn aminocido se encuentra de esa forma, sino que se encuentra ionizado.
Clasificacin
Existen muchas formas de clasificar los aminocidos; las tres formas que se presentan a
continuacin son las ms comunes.
Neutros polares, polares o hidrfilos : Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Cistena (Cys,
C), Asparagina (Asn, N), Glutamina (Gln, Q) y Tirosina (Tyr, Y).
Neutros no polares, apolares o hidrfobos: Glicina (Gly, G), Alanina (Ala, A), Valina
(Val, V), Leucina (Leu, L), Isoleucina (Ile, I), Metionina (Met, M), Prolina (Pro, P),
Fenilalanina (Phe, F) y Triptfano (Trp, W).
Con carga negativa, o cidos: cido asprtico (Asp, D) y cido glutmico (Glu, E).
Con carga positiva, o bsicos: Lisina (Lys, K), Arginina (Arg, R) e Histidina (His,H)
[Segn su obtencin
A los aminocidos que necesitan ser ingeridos por el cuerpo para obtenerlos se los llama
esenciales; la carencia de estos aminocidos en la dieta limita el desarrollo del organismo, ya
que no es posible reponer las clulas de los tejidos que mueren o crear tejidos nuevos, en el caso
del crecimiento. Para el ser humano, los aminocidos esenciales son:
Valina (Val)
Leucina (Leu)
Treonina (Thr)
Lisina (Lys)
Triptfano (Trp)
Histidina (His) *
Fenilalanina (Phe)
Isoleucina (Ile)
Arginina (Arg) *
Metionina (Met)
A los aminocidos que pueden ser sintetizados por el cuerpo se los conoce como no esenciales y
son:
Alanina (Ala)
Prolina (Pro)
Glicina (Gly)
Serina (Ser)
Cistena (Cys) **
Asparagina (Asn)
Glutamina (Gln)
Tirosina (Tyr) **
cido asprtico (Asp)
cido glutmico (Glu)
*Aminocidos esenciales slo para los nios. **Aminocidos semiesenciales (Los necesitan
infantes prematuros y adultos con enfermedades especficas).
Propiedades
cido-bsicas.
Cuando una molcula presenta carga neta cero est en su punto isoelctrico. Si un
aminocido tiene un punto isoelctrico de 6,1 su carga neta ser cero cuando el pH sea
6,1.
pticas.
Todos los aminocidos excepto la glicina tienen el carbono alfa asimtrico, lo que les
confiere actividad ptica; esto es, sus disoluciones desvan el plano de polarizacin
cuando un rayo de luz polarizada las atraviesa. Si el desvo del plano de polarizacin es
hacia la derecha (en sentido horario), el compuesto se denomina dextrgiro, mientras
que si se desva a la izquierda (sentido antihorario) se denomina levgiro. Un
aminocido puede en principio existir en sus dos formas enantiomricas (una dextrgira
y otra levgira), pero en la naturaleza lo habitual es encontrar slo una de ellas.
Qumicas.
C. Pptidos
Los pptidos son un tipo de molculas formadas por la unin de varios aminocidos mediante
enlaces peptdicos, o enlace triple con una conjugacion de ADN (cido desoxirribonucleico)
Los pptidos, al igual que las protenas, estn presentes en la naturaleza y son responsables por
un gran nmero de funciones, muchas de las cuales todava no se conocen.
Los pptidos se diferencian de las protenas en que son ms pequeos (tienen menos de diez mil
o doce mil Daltons) y que las protenas pueden estr formadas por la nin de varios
polipptidos y a veces grupos prostticos. Un ejemplo de polipptido es la insulina, compuesta
de 55 aminocidos y conocida como una hormona de acuerdo a la funcin que tiene en el
organismo de los seres humanos.
Los pptidos, al igual que aminocidos y protenas son biomolculas con un caracter anftero
que permiten la regulacin homeosttica de los organismos.
Es de destacar este comportamiento en las enzimas, pptidos que funcionan como catalizadores
biolgicos de las reacciones metablicas, ya que tienen una valencia de actuacin dentro de
ciertos niveles de pH. En caso de superarse se produce una descompensacin de cargas en la
superficie de la enzima, que pierde su estructura y su funcin
Desnaturalizacin
En bioqumica, la desnaturalizacin es un cambio estructural de las protenas o cidos
nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su ptimo funcionamiento y a
veces tambin cambian sus propiedades fsico-qumicas.
Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia especfica. Son
creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinacin
requerida de aminocidos por la instruccin gentica. Las protenas recin creadas experimentan
una modificacin en la que se agregan tomos o molculas adicionales, como el cobre, zinc y
hierro. Una vez que finaliza este proceso, la protena comienza a plegarse sin alterar su
secuencia (espontneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos
hidrfobos de la protena quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrfilos
quedan expuestos al exterior. La forma final de la protena determina cmo interaccionar con
el entorno.
Si la forma de la protena es alterada por algn factor externo (por ejemplo, aplicndole calor,
cidos o lcalis), no es capaz de cumplir su funcin celular. ste es el proceso llamado
desnaturalizacin.
Prdida de funcin
La mayora de las protenas pierden su funcin biolgica cuando estn desnaturalizadas, por
ejemplo, las enzimas pierden su actividad cataltica, porque los sustratos no pueden unirse ms
al centro activo, y porque los residuos del aminocido implicados en la estabilizacin de los
sustratos no estn posicionados para hacerlo.
Reversibilidad e irreversibilidad
En muchas protenas la desnaturalizacion no es reversible; esto depende del grado de
modificacin de las estructuras de la protena.Aunque se ha podido revertir procesos de
desnaturalizacin quitando el agente desnaturalizante, en un proceso que puede tardar varias
horas incluso das; esto se debe a que el proceso de reestructuracin de la protena es tentativo,
es decir, no asume su forma original inmediatamente, as muchas veces se obtienen protenas
distintas a la inicial, adems con otras caractersticas como insolubilidad (debido a los
agregados polares que puedan unrsele). Recientemente se ha descubierto que, para una correcta
renaturalizacin, es necesario agregar trazas del agente desnaturalizante. Esto fue importante
histricamente, porque condujo a la nocin de que toda la informacin necesaria para que la
protena adopte su forma nativa se encuentra en la estructura primaria de la protena, y por lo
tanto en el ADN que la codifica.
Factores desnaturalizantes
Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes
desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes, disolventes
orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es
reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en:
Tubo 1
o Solucin de albumina + acido actico =solucin (mezclar)
Solucin es de color blanco (leche), Viscoso y presenta
pequeas burbujas dado en dos fases
Tubo 2
o Solucin de albumina + etanol = solucin (agitar)
Solucin presentada en dos 2 fases liquida y solida de dolor
blanco leche
Tubo 3
o Solucin de albumina + agua destilada + HCl = solucin (agitar)
Solucin dada en dos fases liquida y solida( partculas
granuladas) , blancas solidas la solucin presenta en la parte
superior espuma viscosa
Tubo 4
o Solucin de albumina + hidrxido de sodio = solucin (agitar)
La solucin se desnaturaliza a la presencia de una base fuerte
tambin por el grado de exotermicidad, la temperatura hace
que se produzca el fenmeno, es de color perla blanquecina,
estado de colgeno, presenta pequeas burbujas
17 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRS FACULTAD DE INGENIERA
LABORATORIO DE PROTEINAS
LABORATORIO ORGANICA
Hecho por: Juan Pablo Zarate Yavi
Reaccin de Biuret
Reaccin xantoproteica
Tubo 1
o Solucin de albumina +acido ntrico +calor = disolucin (agitar)
Solucin es de dos fases liquido incoloro o colgeno, amarillo
colgeno, blanco leche
Disolucin + hidrxido de sodio + no reacciona para nada
Tubo 2
o lana sinttica +acido ntrico +calor = solucin
Solucin sigue presentando la lana se torna de un color
verdoso
Reaccin + hidrxido de sodio= y no reacciona esta operacin
nos indica la presencia sinttica de la lana
Tubo 3
o Lana natural + acido ntrico + calor = solucin
Solucin ha comparacin de la anterior es la misma pero se
torna de un color caf
Solucin + hidrxido de sodio = se forma 2 fases caf claro
precipitado solido
Digestin artificial
Bibliografa:
WIKIPEDIA .COM
RESPUESTAS YAHOO
GUA DE LABORATORIO
MORRISON (PROTENAS)
QUIMINET.COM