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Je suis un microbe dans le lac, me

voyez-vous ?
cologie microbienne aquatique

Prsent par
Nala Barbosa da Costa, Paula Reis et Patricia Tran

Les Ateliers Automnaux GRIL-EcoLac 2017

clipart: https://thenounproject.com/term/microbe/
Quest-ce quun microbe ?
Microbe: organisme microscopique

Virus
0.01 - 0.2 m
Eukaryotes
Protistes flagells et cilis, microalgues
1 - 200 m
Bactries
1 - 2 m

Arches
Quest-ce quun microbe ?
Microbe: organisme microscopique

Virus
0.01 - 0.2 m
Eukaryotes
Protistes flagells et cilis, microalgues
1 - 200 m
Bactries
1 - 2 m

Arches
Outline
Intro l'cologie microbienne

Focus sur les bactries dans les lacs:


Que font-elles ?
Diversit de mtabolismes
Sont-elles actives ?
Dtecter leur activit Belles bactries mthanotrophes
Les identifier (qui sont-elles ?)
Mthodes traditionnelles (DNA sequencing)
Mthodes NGS (next-generation sequencing)
Diffrents rgulateurs d'abondances bactriennes
Diffrents rgulateurs d'abondances bactriennes
CH4
CH4

CH4

CH4

CH4
CH4
Diffrents rgulateurs d'abondances bactriennes
CH4
CH4

CH4

CH4

CH4
CH4
Temperature
Diffrents rgulateurs d'abondances bactriennes
CH4
CH4

CH4

CH4

CH4
CH4
Temperature
Diffrents rgulateurs d'abondances bactriennes
CH4
CH4

CH4

CH4

CH4
CH4
Temperature
Diffrents rgulateurs d'abondances bactriennes
CH4
CH4

CH4

CH4

CH4
CH4
Temperature
Les chelles

Gnomique

Population

Communaut

cosystme

Paysage
Questions et approches
Niveau de la communaut

Sont-elles
actives?

Little et al. 2008


Pourquoi sont-elles importantes ?
Bactries
htrotrophes

OD
Bactries
htrotrophes
CO2
Composs organiques

OD
Bactries
mthanotrophes CH4

MO CH4

Arches
mthanognes
NO3-
Bactries
nitrifiantes
NO2-
Bactries
nitrifiantes
NH3
I bacteria!
Chez les bactries, le mtabolisme est trs vari!

Sources
d'nergie et de
carbone
Chez les bactries, le mtabolisme est trs vari!

Le mtabolisme peut tre associ ou non avec laffiliation


phylogntique.

Bac 1 Bac 1
Bac 2 Bac 2
Bac 3 Bac 3
Bac 4 Bac 4
Bac 5 Bac 5
Bac 6 Bac 6

Bac 7 Bac 7
Bac 8 Bac 8
Lactivit microbienne au centre des processus de l
cosystme
Quest ce qui rgule leur prsence, abondance, et activit ?

Comment est-ce que laffiliation taxonomique est relie les


processus/fonctions ?

Comprendre ces mcanismes est important pour prdire les


changements dans lcosystme d plusieurs facteurs dimpacts :
leutrophisation, le rchauffement climatique, la construction de
barrages, linvasion despces exotiques, etc
Mesurer le microbiome DAPI

Quantifier les bactries:

Microscopie
DAPI - toutes les cellules
FISH groupes spcifiques
FISH
Mesurer le microbiome DAPI

Quantifier les bactries:

Microscopie
DAPI - toutes les cellules
FISH groupes spcifiques
FISH
Mesurer le microbiome

Quantifier les bactries:

Microscopie
DAPI
FISH groupes spcifiques

Cytomtre de flux

http://a.static-abcam.com/CmsMedia/Media/flowcytometry01472px.jpg
Mesurer le microbiome

Mesurer lactivit microbienne:

Transcritption des gnes


fonctionnels

qPCR quantifier la transcription


des gnes

http://cedvaledoamanhecer1d.blogspot.ca/p/ribosso.html
Les techniques de marquage peuvent cibler diffrents
processus cellulaires

Synthse dADN
Biosynthse de lipide/
carbohydrate/ acides amins
Synthse dARNm (transcription)
Synthse de protines
(traduction)

Singer et al. 2017. ISME.


The Great Plate Count Anomaly
Mthodes qui dpendent de la cultivation
1
Seulement une fraction des bactries sont cultivables
chantillon
environnemental Squenage Gnomes

Bottleneck (-99%)

Mthodes de squences qui ne


2
dpendent pas de la cultivation

Parks D. 2017 Nature Microbiology: Behind the paper. Available here.


Mthodes indpendantes de la culture
Bass sur la squenage dADN
Dpendre dextraction dADN ou ARN
ADN: composition de la communaut biologiques, relations
volutives et phylogntiques
ARN: expression gntique

http://cedvaledoamanhecer1d.blogspot.ca/p/ribosso.html
Mthodes bases sur le squenage dADN
Squenage traditionnel (Sanger)
Une squence la fois
Isolation des squences diffrentes avant le squenage

https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/what-is-accuracy-in-next-generation-sequencing-ngs/
Mthodes bases sur le squenage dADN
Next Generation Sequencing (NGS)
Toutes les squences en mme temps (sequencing-by-synthesis)
Lisolation des squences est faite aprs le squenage (bioinformatique)

https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/what-is-accuracy-in-next-generation-sequencing-ngs/
Mthodes bases sur le squenage dADN
Bass sur lamplification par PCR en gnral
PCR de langlais Polymerase Chain Reaction
Amplification des squences cibles dADN
Amplification prfrentielle des + abondantes semi-quantitative

https://www.abmgood.com/marketing/knowledge_base/polymerase_chain_reaction_introduction.php
Quelle rgion amplifier?
Il faut choisir un gne:
Prsent dans tous les organismes
Conserv dans lespce, mais avec des rgions variables travers les
espces

&
Exemple de rgions cibles pour les tudes de diversit

23S

16S
http://biologianet.uol.com.br/biologia-celular/ribossomos.htm
https://en.wikipedia.org/wiki/Prokaryote
Squences les plus utilises

Pour les organismes prokaryotes


Le gne de la sous-unit 16S dARNr
Le 16S-23S ITS (Internal Transcribed Spacer)

23S

16S

http://biologianet.uol.com.br/biologia-celular/ribossomos.htm
https://www.quora.com/How-does-respiration-occur-in-the-Euglena
Squences les plus utilises

Pour les microorganismes eukaryotes


Le gne de la sous-unit 18S dARNr
Le ITS (Internal Transcribed Spacer)
Le COI (cytochrome c oxidase I) de lADN mitochondrial

28S

18S

http://biologianet.uol.com.br/biologia-celular/ribossomos.htm

http://www.emforma.net/11966-mitocondria
Mthodes disolation des
squences dADN

Aprs lamplification dune rgion spcifique du gnome trouv dans


tous les individus dans la communaut
Mthodes disolation des
squences dADN

Aprs lamplification dune rgion spcifique du gnome trouv dans


tous les individus dans la communaut
Il faut sparer les espces diffrentes

Community fingerprinting
Community fingerprinting

Examples: DGGE/TGGE, ARDRA, RFLP, T-RFLP, ARISA...


chantillons
Espces

https://en.wikipedia.org/wiki/Temperature_gradient_gel_electrophoresis
Les mthodes travers le temps
Le squenage est de moins en moins cher!
Squenage de lADN haut dbit (HTS:
High-throughput sequencing)
Aussi appel NGS pour Next Generation Sequencing

Les diffrentes mthodes varient par leur:

Longueur de lecture (longueur de la squence)


Prcision (base)
Lecture par exprience (combien de squences)
Temps de lecture (la dure)
Cot ($$!)

Chaque mthode a des avantages et inconvnients.


Deux mthodes populaires: 16S et la mtagnomique

1) chantillonnage:
environnement de votre choix
2) Squenage NGS (high-throughput)

3) Amplification des squences laide


du PCR

4) Analyses

Laksen & McLean. Nat. Reviews Genetics (2014)


Squenage de lARNr 16S
(16S rRNA)
Quest-ce que cest?
l'ARN ribosomique constituant la petite
sous-unit des ribosomes des procaryotes.
Les eukaryotes ont le 18S.

Pourquoi?
Un gne marqueur phylogntique cause de
sa conservation travers les domaines de la
vie, mais juste assez variable entre les espces
Metagnomique
Dfinition: ltude du contenu
gntique dchantillons issus
denvironnement complexes.

Contrairement la mthode du
aRNA 16S, cette mthode ne
cible pas seulement un gne,
mais tout lADN contenu. Cette
mthode permet dtudier tout
le potentiel gnomique et
mtabolique dun chantillon
environnemental.

Identification Fonction
MAG = Metagenome-assembled genomes

Kang et al., 2015; PeerJ. DOI: 10.7717/peerj.1165/fig-1


Metagenomic binning: la classification des squences dans des paniers
afin de reconstituer des gnomes.

Classification
de novo

Bas sur la
ressemblance
entres les
squences et leur
abondance
travers les
chantillons

Metagenome-Assembled-Genomes (MAG) aussi appel bin


(comme un panier)
Atelier pratique
Choisissez votre propre aventure!
3 scnarios, des vraies donnes 16S
rRNA provenant de:
1) Lac tempr et lac tropical
2) Photosynthse oxygnique et
anoxignique
3) Lac des statut trophique diffrent
(eutrophique et oligotrophique)

Suivez le tutoriel ici!


github.com/patriciatran/MicrobialEcologyWorkshop
Merci! Antoine, la bactrie
mthanotrophique

Julie, la bactrie
sulfureuse

Marie, la bactrie Fred, la bactrie


photosynthtique fixeuse dazote
Introduction to the scenarios
(Workshop Session)
Go to this page:

Suivez le tutoriel ici!


github.com/patriciatran/MicrobialEcologyWorkshop
Scenario 1: Temperate versus tropical lakes

Quels sont les facteurs qui pourraient influencer la distribution des


bactries dans ces 2 cosystmes?

- Saisonnalit
- Temperature
- Quantit de nutriments (phosphore, azote) (oligotrophique,
mesotrophique, eutrophique)
Scenario 1: Temperate versus tropical lakes

Lac Croche est un lac tempr, avec un forte Lac Carioca is a mesotrophic lake. Mixes once
stratification durant lt, et un hypolimnion a year in the dry-season (winter). It never
anoxique la fin de lt. Ce lac est dimictique, freezes! 12m depth, like Croche. It is strongly
une fois au printemps aprs la fonte des glaces stratified, and like Croche, it also gets anoxic
et une fois en automne. Couvert de glace en almost year-round, except during mixing.
hiver.
Scenario 2: Exploring anoxygenic and oxygenic photosynthesis

CO2
Photosynthetic organism use sunlight as an
energy source and CO2 as a carbon source

In oxygenic photosynthesis, water is


hydrolysed, oxygen is released as a by
product
Scenario 2: Exploring anoxygenic and oxygenic photosynthesis

CO2
Photosynthetic organism use sunlight as an
energy source and CO2 as a carbon source

But in anoxygenic photosynthesis, it is a cyclic


process. Oxygen is not released, water is not
used as an electron donor among other
differences.
Scenario 2: Exploring anoxygenic and oxygenic photosynthesis

Only 1
bacterial A lot more
group: it diversity
should cluster
in the tree
Scenario 2: Exploring anoxygenic and oxygenic photosynthesis

Purple sulfur bacteria: Chromatiales (Order)

Purple non sulfur bacteria: Rhodospirillaceae (Family)

Green sulfur bacteria: Chlorobi (family)

Green non sulfur bacteria: Chloroflexi (Class)

Heliobacteria: Heliobacteriaceae (Family)

Acidobacteria: Acidobacteria (Phylum)


Scenario 3: Healthy versus unhealthy lakes

Lake Erie under cyano bloom

http://beachchairscientist.com/2013/02/28/did-you-kn
ow-what-we-add-to-our-garden-affects-the-ocean/
Scenarios

- References : sequences of known origin (cultures, other studies, etc.)


to compare your unknown sequences to
- Outgroup : point of comparison for the ingroup, the set of organisms
under study that specifically allows the phylogeny to be rooted
- Scenario 1 (sequences obtained from a sample 1)
- Scenario 2 (sequences obtained from a sample 2)
How to retrieve sequences: 16S rRNA database

https://www.arb-silva.de/