Prctica de laboratorio de bioqumica: espectrofotmetro

INTRODUCCIN:

La Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la Deteccin

especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su Aplicabilidad a molculas
de distinta naturaleza (contaminantes, biomolecular, etc) y Estado de agregacin (slido, lquido,
gas). Los fundamentos fsico-qumicos de la Espectrofotometra son relativamente sencillos.

Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa Interna. Esto
permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosntesis en
plantas y bacterias. La Mecnica Cuntica nos dice que la luz est Compuesta de fotones cada uno
de los cules tiene una energa:

Efotn = h = hc/ ,

Donde c es la velocidad de la luz, es su frecuencia, su longitud de onda y

h= 6.6 10 -34

Js es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia qumica

absorbe luz de longitud de onda , esto significa que las molculas de esa sustancia absorben
fotones de esa longitud de onda.

En esta prctica estudiaremos la absorcin de luz en el ultravioleta cercano (325-420nm) y en el

visible (420-900 nm). Cuando una molcula absorbe un fotn en este intervalo espectral, se
excita pasando un electrn de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energa
superior. De est manera la molcula almacena la energa del fotn:

A + h A*E(A*) = E(A) + Efotn

Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado fundamental de lamolcula

(A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energa del fotn. Es decir, una
molcula slo puede absorber fotones cuya energa h sea igual a la energa de un estado
molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados.

FUNDAMENTO TERICO:

Espectrofotometra ultravioleta visible. Ley de Lambert-Beer. Los mtodos espectroscpicos de

anlisis estn basados en la medida de la radiacin electromagntica que es absorbida o emitida
por una sustancia. En funcin de ello se clasifican fundamentalmente en:

Mtodos de absorcin: Se basan en la disminucin de la potencia de un haz de radiacin

electromagntica al interaccionar con una sustancia.
 Mtodos de emisin: Se basan en la radiacin que emite una sustancia cuando es excitada
previamente por medio de otro tipo de energa (trmica, elctrica).

Mtodos de fluorescencia: Se basan en la radiacin que emite la sustancia cuando es excitada

previamente por un haz de radiacin electromagntica.

Otras clasificaciones de los mtodos espectroscpicos se establecen en funcin de la regin del

espectro electromagntico que interviene en la tcnica. As, pueden utilizarse regiones como rayos
X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. En la Figura 1 pueden verse las regiones del
espectro electromagntico, en funcin de los valores de la longitud de onda () de cada radiacin:

En esta figura puede tambin observarse como la luz visible para el ojo humano constituye
nicamente una pequea parte del espectro electromagntico. Dado que los primeros mtodos
espectroscpicos desarrollados corresponden a la regin del visible recibieron la denominacin de
mtodos pticos, la cual se utiliza todava con frecuencia. A continuacin, se ofrece una breve
informacin sobre la ley de Lambert-Beer y la espectrofotometra de absorcin en la regin visible
del espectro. Si se considera que se dispone de una fuente de radiacin que hace llegar a la
muestra un haz de radiacin, de longitud de onda previamente seleccionada, cuya potencia es P0
T=P/P , la muestra de espesor b absorbe una parte de esa radiacin incidente, de forma que la
potencia del haz disminuye despus de atravesar la muestra siendo su nueva potencia P. El
cociente entre la potencia de la radiacin que sale de la muestra y la de la que incidi sobre ella,
se define como transmitancia: 0 La transmitancia tambin puede expresarse en tanto por ciento,
multiplicando el cociente anterior por 100. Es ms frecuente utilizar el concepto de absorbancia, o
densidad ptica, que se define como el logaritmo de la transmitancia cambiado de signo: . A = log
(P0 De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiacin, P y P /P) = - log T 0
coinciden, por lo tanto A=0, y se transmite toda la radiacin T=1 (100% de transmitancia). Si, en
otro caso, se transmite solo un 1% de radiacin (T=0.01), P=P0 Al incidir radiacin
electromagntica visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o totalmente reflejada.
En el primer caso el objeto aparecer de color negro y en el segundo de color blanco. Puesto que
nosotros percibimos los objetos por medio de la luz reflejada, si hacemos incidir un haz de luz
blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, ste absorber ciertas
longitudes de onda y reflejar otras, siendo stas ltimas las responsables del color. Se dice que
este color (observado) es complementario del que se percibira si la luz absorbida se pudiera
detectar. Dado que en la parte experimental de esta prctica las medidas van a realizarse con
espectrofotometra visible, es conveniente conocer para qu longitud de onda tiene cada color su
mxima absorcin, lo que se muestra en la tabla siguiente:

Para medir los valores de absorbancia y transmitancia de una disolucin se utilizan

espectrofotmetros UV-Vis, que, como puede verse en la Figura 2, se componen de cinco
elementos principales:

Una fuente de radiacin que suele ser una lmpara de filamento de wolframio

Un monocromador que permite seleccionar una longitud de onda determinada originando un

haz monocromtico.

Un recipiente para contener la muestra denominado cubeta fabricado con un material que
permite el paso de la radiacin en la regin del espectro de inters. Suelen ser de vidrio, plstico o
cuarzo. El espesor de la cubeta ms habitual es 1 cm.

Un detector que convierte la energa radiante en una seal elctrica.

Una pantalla de visualizacin