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INFORME DE LABORATORIO No.

5 CULTIVO DE YEMAS Y
MERISTEMOS, VA ORGANOGNESIS DIRECTA.
ESTABLECIMIENTO DE ROSAS Y PIA

Becerra Francisco1, Daz Mayari2, Pineda Bryan

16106841,16105842, 16108643

Biotecnologa vegetal, Msc. Alina Sigarroa Rieche.

Resumen

Con el objetivo de generar destreza en la extraccin de meristemos en especies de inters por


sus cualidades de propagacin, se realiz este practica de laboratorio; inicialmente realizamos
una prctica de ensayo en la que practicamos la extraccin en pia y rosa; con especies de
clavel y caa no se hizo el procedimiento porque no fue posible encontrar buen material para
practicar. Posteriormente hicimos la practica real sembrando en medios MS en cabina de flujo
laminar llevando a cabo los respectivos procedimientos de desinfeccin y finalmente la
evaluacin del crecimiento en cada uno de los frascos cultivados

Palabras clave: Meristemos, extraccin, primordios, yemas, organognesis directa.

INTRODUCCIN
de que se presente variacin de algn tipo,
La organognesis directa en trminos sobre toso variaciones somaclonales por la
generales es la formacin de un primordio sucesiva divisin celular a la que se
unipolar a partir de una yema con el someten en procedimientos de formacin
subsecuente desarrollo de este en un brote de callos.
vegetativo, existiendo siempre una
conexin entre los nuevos brotes y el tejido
madre. Estos brotes vegetativos son
posteriormente puestos a enraizar en otra
etapa, va formacin de primordios de
races y el subsecuente enraizamiento
final.

Se produce una formacin directa de


rganos sobre la superficie del medio a
partir de un explante tipo yema o meristemo
sin que sea necesaria la induccin de Imagen 1: regeneracin vegetal va
callos, con esto se reduce la probabilidad organognesis directa.
Facultad de ciencias agrarias y del ambiente
Ingeniera Biotecnolgica
2015
INFORME DE LABORATORIO No. 5 CULTIVO DE YEMAS Y
MERISTEMOS, VA ORGANOGNESIS DIRECTA.
ESTABLECIMIENTO DE ROSAS Y PIA

Con la organognesis se conduce a la En trminos generales el procedimiento a


diferenciacin de meritemos que originarn que se llev a cabo fue:
tallos o races adventicias, respectivamente,
Pia
hay que regenerar la planta
Quitarle a las coronas de pia las hojas.
(organognesis). Cojo yemas auxiliares,
Cortar las coronas hasta que queden en
para conseguir una planta clnica. Es un
cubos de dos centmetros con las
proceso rpido, muy til para plantas de
ltimas hojas de la corona.
mucho valor (slo se obtiene tantas plantas
Colocar los cubos de pia en el
como yemas hay). Estas yemas en un
estereoscopio y con la ayuda de una
medio adecuado dan tallos.
aguja quitar las ltimas hojas hasta
llegar al meristemo.
A continuacin describimos el
procedimiento realizado desde la extraccin
Rosa
de los meristemos de pia y la obtencin de
Cortar los tallos de rosa en fragmentos
las yemas de rosa hasta la siembra en
en donde se encuentres los meristemos.
medios de cultivo y finalmente la evaluacin
Llevar los fragmentos al estereoscopio.
de crecimiento que se present tras haber
Quitar los primordios foliares, hasta
hecho la siembra, identificando viabilidad y
llegar al meristemo.
frascos contaminados.

OBJETIVOS Fase preparativa


Dominar la etapa I fase de Se escogieron las yemas de rosa y se
establecimiento de rosas y de pia, va separaron los segmentos con yemas
Organognesis Directa, mediante el axilares, se sumergieron en solucin
cultivo de yemas y meristemos. antioxidante.
Continuar adquiriendo habilidades en Se limpi y rebano los cogollos de pia
el trabajo de cultivo de tejidos, al tiempo que se iban preparando las
especialmente en siembra de material soluciones desinfectantes
vegetal.
Llevamos a cabo el proceso de
desinfeccin como se describe a
continuacin:
MATERIALES Y METODOS
Desinfeccin de yemas de rosa
Instrumentos de diseccin
Fragmentos de tallos de rosas que rea no estril
contengan yemas axilares de tamao 5 minutos en la solucin jabonosa.
grande. Enjuagamos 3 veces con agua destilada
Cogollos de pia. estril.
Papel Aluminio
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rea estril RESULTADOS


5 minutos en la solucin de alcohol al 70 %.
Enjuagamos 3 veces con agua destilada
estril.
8 minutos en la solucin de hipoclorito de
Sodio al 3 %

Cabina de flujo laminar


Enjuague 3 veces con agua destilada estril

Desinfeccin de yemas de pia

rea no estril
5 minutos en la solucin jabonosa
Enjuagamos 3 veces con agua destilada
estril Corona de pia con las hojas
del centro
rea estril
5 minutos en la solucin de alcohol al 70 %.
Enjuagamos 3 veces con agua destilada
estril.
6 minutos en la solucin de hipoclorito de
Sodio al 3 %. Ultimas
Hojas, listo
Cabina de flujo laminar para llevar
Enjuague 3 veces con agua destilada estril
al estreo,
terminar de
limpiar y
Fase de establecimiento sembrar.
Dentro de la cabina de flujo laminar, con
la ayuda de los instrumentos de diseccin, y
sobre papel estril, hicimos la diseccin de
la yema y la obtencin del meristemo,
cortamos y sembramos en el medio de
cultivo apropiado para cada especie
vegetal. Meristemo
de pia
Finalmente cerramos los frascos con observado
aluminio y envoplast, rotulamos y dejamos en el
incubando. estreos-
copio.

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Primordio rosal

Frascos sembrados con yemas de


Fragmentos de rosa en el rosa y meristemos de pia.
estereoscopio.

Cultivo de explantes

Primera semana
Contaminacin Muerte por Crecimiento Observaciones
Frasco End. Exo. desinfeccin

Yemas de rosa

1 - - - - Ligera Fenolizacin

2 - - - - Ligera Fenolizacin

3 - - - - -

- - - - -
4

Meristemos de pia
1 - - - - -

- - - - -
2
- - - - -
3
- - - - Se observan puntos
4 claros en el medio
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Segunda semana
Contaminacin Muerte por Crecimiento Observaciones
Frasco End. Exo. desinfeccin

Yemas de rosa
1 - - - - La Fenolizacin
disminuye
- - - -
2 La Fenolizacin
disminuye
- - - -
3 Yemas ms verdes
- - - -
4 Yemas ms verdes

Meristemos de pia
1 - - - -

- - - - -
2
- - - - -
3
- X - - Descarte
4

Tercera semana
Contaminacin Muerte por Crecimiento Observaciones
Frasco End. Exo. desinfeccin

Yemas de rosa

1 - - - X Se observan brotes
foliares

2 - - - X Se observan brotes
foliares

3 - - - X Se observan brotes
foliares

4 - - - X Se observan brotes
foliares
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Meristemos de pia

1 - - - - No hay crecimiento

2 - - - - No hay crecimiento

3 - - - - No hay crecimiento

Cuarta semana
Contaminacin Muerte por Crecimiento Observaciones
Frasco End. Exo. desinfeccin

Yemas de rosa

1 - - - X Se observan brotes
foliares

2 - - - X Se observan brotes
foliares

3 - - - X Se observan brotes
foliares

4 - - - X Se observan brotes
foliares

Meristemos de pia

1 - - X - Descarte

2 - - X - Descarte

3 - - X - Descarte

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Vitroplantas de rosa a las dos semanas de haberse sembrado y meristemos de


pia sin crecimiento.

DISCUSIONES CONCLUSIONES

La regeneracin va organognesis Con esta prctica de laboratorio


directa que se llev a cabo nos permiti logramos aprender la extraccin de
obtener plantas completas de rosa a partir meristemos de Pia y Rosa para
de yemas seleccionadas de tallos de las obtener material listo para propagar en
mismas; por el lado de la pia, no fue
medios de cultivo; tambin logramos
posible obtener crecimiento de la vitroplanta
dilucidar lo complejo que es hacer la
porque creemos hubo algn error en el
proceso de desinfeccin ya que ninguno de
extraccin y la importancia de estar
los cuatro frascos presento crecimiento. concentrado y dispuesto a realizar las
cosas de la mejor manera ya que exigen
Respecto a la contaminacin, el bastante destreza y prctica.
protocolo que realizamos fue muy bueno ya
que solo un frasco de pia (N4) presento Los explantes tomados de plantas
contaminacin exgena, los dems frascos
jvenes o zonas de crecimiento activas
sembrados no presentaron contaminacin
tienen un mejor desarrollo que aquellos
pero tampoco exhibieron crecimiento; el
motivo aparente es que hubo algn error en tomados de plantas adultas o yemas en
el proceso de desinfeccin, probablemente reposo. A medida de que es ms joven
nos excedimos en el tiempo de aplicacin y menos diferenciado el tejido que se va
de algn desinfectante y por ello los a implantar, mejor ser la respuesta in
meristemos perdieron su viabilidad. vitro.

El estado de desarrollo de la planta


El tamao del explante es un factor
madre y la edad fisiolgica del explante, as
como su tamao, son de gran influencia en
importante que influye en la
el xito del cultivo in vitro.(Hernndez, desinfeccin y regeneracin de plantas,
1997). a medida que el explante es ms
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pequeo es menor el riesgo de 3. Enumere las caractersticas


contaminacin y ms fcil la (anatmicas y fisiolgicas) principales
regeneracin, mientras que con el de las clulas que conforman este tipo
aumento del tamao del explante es de tejido vegetal.
mayor el peligro de contaminacin.
Las clulas son pequeas y regulares.
con pequeas vacuolas
presentan un ncleo grande
pared celular muy fina que les permite
CUESTIONARIO
dividirse continuamente, dando clulas
superiores an embrionarias y clulas
1. Por qu se suele utilizar tejido
inferiores que se diferencian en los
meristemtico como explante inicial en
distintos tejidos de la planta segn su
los cultivos in vitro? Justifique
posicin.
ampliamente su respuesta.
De esta forma, la planta tiene un
Se utiliza este tipo tejido debido a que
crecimiento continuo.
en este hay clulas con alto potencial
totipotente, las cuales pueden dar
origen una planta completa a travs de MERISTEMOS
la organognesis directa, sin la PRIMARIOS
formacin de callo; las plantas que se
obtienen son idnticas genticamente a
proviene
la planta madre; tambin porque este directamente de clulas
tejido se encuentra bastante protegido y TOTIPOTENTES.
por tanto existe menos riesgo de
contaminacin.
MERISTEMOS
APICALES
MERISTEMOS
2. Cul es la funcin principal de este INTERCALARES
tejido en la planta
PROTODERMIS
El tejido meristematico tiene como
funcin dividirse para formar los tejidos PROCAMBIUM
adultos diferenciados de la planta y formar Da origen a la
MERISTEMO
EPIDERMIS
otras clulas meristematicas. Tambin tiene FUNDAMENTAL
como funcin producir el crecimiento Forma tejidos
longitudinal y lateral del organismo vegetal; conductores
primarios da lugar al resto
tambin es imprtate en la regeneracin de de tejidos.
la planta.

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MERISTEMOS Tejidos meristematicos, botanicafesi,


SECUNDARIOS meristemos y tejidos secundarios,
consultado noviembre de 2015, disponible
en:
se origina a partir de
clulas diferenciadas https://sites.google.com/site/botanic
que conservan su afesi/i--meristemas-y-tejidos-
capacidad de divisin.
(PLURIPOTENTES) secundarios

CAMBIUM FELOGENO
VASCULAR Propagacin a travs de yemas,
Propagacin de plantas por cultivo in
Origina la vitro: una Biotecnologa que nos
responsable PERIDERMIS acompaa hace mucho tiempo,
del crecimiento
secundario en inia.org.uy, consultado noviembre de 2015,
grosor de los disponible en:
tallos www.inia.org.uy/publicaciones/docu
mentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf+PRO
PAGACION+YEMAS+ROSA+IN+VIT
RO&hl=es&ct=clnk&cd=3&gl=co&lr=l
BIBLIOGRAFA ang_es

SIGARROA, Alina. Guas de laboratorio


de biotecnologa vegetal. Universidad Produccin de vitroplantas,
Francisco de Paula Santander. establecimiento de cultivos de tejidos
vegetales in vitro, exa.unne.edu.ar,
Prez Ponce, J.N. Propagacin y consultado noviembre de 2015, disponible
mejora gentica de plantas por en:
biotecnologa. Instituto de Biotecnologa http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologi
de las Plantas. Volumen 1. 1988 a.vegetal/Cultivo%20de%20Tejidos%2
0en%20la%20Agricultura/capitulo2.pdf
Libro fisiologa vegetal vol. 2 Lincon
Taiz, & Eduardo Zeiger. Pag. 656
Propagacin de rosa, el cultivo de rosas y
Gutirrez Martha, tejido su propagacin, redalyc.org, consultado
meristematicas, todo sobre los noviembre de 2015, disponible en:
meristemos vegetales, consultado http://www.redalyc.org/pdf/1932/19321
noviembre de 2015; disponible en: 7832008.pd
http://slideplayer.es/slide/130198/

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ANEXO: CUESTIONARIO PRACTICA 5

1. Cules son las condiciones ambientales que deben ser reguladas para el crecimiento de los
explantes sembrados?

Las condiciones ambientales a tener en cuenta son:

Medio de cultivo:

Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y
nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. Tambin se debe aadir
azcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente
autotrficas cuando se desarrollan en estas condiciones.

pH

El pH final del medio de cultivo es un factor importante por diversas razones:

Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificacin de los agentes gelificantes


aadidos a los medios slidos Si la evolucin del pH del medio lo hace bajar por debajo
de 3.5 se puede producir su licuacin.

El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de


cultivo

El valor del pH puede afectar a la absorcin de determinados nutrientes por parte del
explante ( la absorcin de iones NO3-aumenta con la acidez del medio)

El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a la
actividad de muchos enzimas

Por todas estas razones conviene optimizar el pH del medio para cada caso en concreto. En
general, no obstante, en la mayora de situaciones se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.

La temperatura

El control de la temperatura no es solamente importante porque pueda afectar al crecimiento


del cultivo sino tambin porque puede ser un factor que induzca determinados procesos
fisiolgicos. As, temperaturas bajas (del orden de 4-50C) permiten superar los periodos de

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dormicin de algunas leosas y la conservacin prolongada de determinados cultivos in vitro;


mientras que una temperatura constante de 200 C induce la formacin de races en la mayora
de conferas.

La luz

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos
auttrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro.

Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:

La cantidad de luz: la irradiacin


La calidad de la luz: El espectro
La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: el fotoperiodo

Detalle en qu condiciones quedaron creciendo los explantes que usted sembr:

Crecieron en medio slido que incluye sales inorgnicas, carbohidratos y vitaminas y


aminocidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algn
regulador de crecimiento.
Con un fotoperiodo de 16 horas luz y 4 horas oscuridad.
Una temperatura de 22 C mxima y 12 C mnima.

2. Qu tipo de crecimiento debe esperarse de acuerdo al explante usado y a la composicin


del medio del cultivo? (Seale la composicin del medio utilizado). Que factores podran afectar
ese crecimiento.

De acuerdo al explante se debe esperar la formacin de tallos.

Los factores que afectan el crecimiento son.

Contaminacin del medio


Contaminacin endgena
El tamao del explante
El origen del explante.
Mal manejo del protocolo de desinfeccin.

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composicin del medio MS

3. Proponga y elabore un esquema o diagrama con todo el proceso de micropropagacin de


rosas, a partir de yemas axilares. Especifique, por separado, medios de cultivo, mtodos de
desinfeccin, condiciones ambientales de crecimiento y otros factores que considere de inters
particular, en cada fasede la propagacin.

FASE 0: PREPARACIN DE LA PLANTA MADRE

Es recomendable mantener a las plantas madre un perodo de tiempo, en un


invernadero, en condiciones sanitarias ptimas

Se toman las inflorescencias jvenes que sirven de explantes

Se separan las yemas axilares y se sumergen en solucin antioxidante

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FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA

Se hace la desinfeccin de las yemas


Se lavan con agua y jabn azul
Se sumergen en una solucin de hipoclorito de sodio comercial, a una concentracin
final del 1%, bajo la accin de una bomba de vaco por 15 min
Se trasladan a la cmara de flujo laminar donde se lavan tres veces con agua destilada
estril.

El material as preparado se corta en segmentos de 1 cm aproximadamente, los cuales se


sumergen rpidamente en una solucin de alcohol al 70% y luego se siembran en en el medio
de cultivo MS.

FASE II: MULTIPLICACIN DE LOS BROTES

(Medio de cultivo)Para la determinacin del medio nutritivo adecuado en el


establecimiento del cultivo se realizan pruebas usando las sales MURASHIGE y
SKOOG (1962) (MS), suplementadas con tiamina 0,4 mg/l, mioinositol 100 mg/l,
sacarosa (30 g/l). As mismo se puede probar diferentes combinaciones de sustancias
de crecimiento (benciladenina BA, cido naftalenoactico ANA, cido 2,4
diclorofenoxiactico 2,4-D).
Para el desarrollo de los brotes se emple el medio MS suplementado con
combinaciones de BA y ANA

FASE III: ELECCIN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTES

En la etapa de enraizamiento se utilizaron medios libres de sustancias de crecimiento


con sacarosa 20 y 30 g/l.
Para el desarrollo de los brotes, los cultivos se transfirieron a medio fresco y la
incubacin fue realizada bajo luz continua (5 000 lux) a temperatura de 27 1oC.

5 FASE IV: ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTES ENRAIZADOS

La aclimatacin en condiciones de vivero se realiza utilizando como sustrato una mezcla


de suelo y turba en una proporcin 1:1 y abonada con un fertilizante comercial, de
frmula NPK(15-15-15).

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