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Licence dInformatique Anne 2001-2002

Option: Introduction la biologie molculaire Principes


ORGANISME
VECTEUR
DONNEUR
Extraction et coupure de lADN Ou transporteur dADN.
en fragment contenant de un Cest un fragment dADN
plusieurs fragments dintrt. capable de rplication autonome.
C lonage et vecteur de clonage
ou insertion individuelle de chaque
fragment dA D N dans une molcule
Technologie de lADN de vecteur.

recom b inant
Obtention de l ADN recombinant
Nouvelle combinaison de lA D N d un gnome donneur (qui peut tre
de nimporte quel organisme) avec lADN dun vecteur qui peut tre
dorigine compltement diffrente.

Obtention de lA D N recombinant

Le clonage permet linsertion dun fragment dADN dans


un vecteur permettant ainsi den obtenir plusieurs copies

An Introduction to Genetic Analysis


Procdure complte Questions?
Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ?
Quelles informations porte cet AD N ?
Comment slectionner le fragment dADN voulu?
Quest ce quune enzyme de restriction?

Quels sont les vecteurs de clonage?

Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?

Les cellules htes

Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte


et comment celle-ci se multiplie?

Les intrts du clonage?

Molecular Cell Biology

Questions? Obtention de lA D N de lorganisme donneur


Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ?
Quelles informations porte cet AD N ? A partir de lADN gnomique:
Comment slectionner le fragment dADN voulu? L ADN gnomique est obtenu partir de lignes cellulaires, de
Quest ce quune enzyme de restriction? tissus ou dorganismes entiers en fonction de la taille de lorganisme.

Quels sont les vecteurs de clonage? Pour un organisme donn on part de nimporte quel lot de cellules,
lADN gnomique sera le mme.
Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?

Les cellules htes

Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte


et comment celle-ci se multiplie?

Les intrts du clonage?


Ordre dide de la taille des gnomes
Obtention de lA D N de lorganisme donneur

A partir de lARN:

Principe de la reverse transcription:

Homme/Souris 3,000 M b
Nematode 97 M b
Drosophile 160 M b
S. cer evisiae 12 M b
Nombre de gnes
Homme /Souris 30 000
Nematode 20 000 An Introduction to Genetic Analysis

Drosophile 14 000
Dans ce cas l, quel matriel de dpart prendriez-vous?
S. cer evisiae 6 200
Toutes les cellules expriment-elles le mme gne?

Obtention de lA D N de lorganisme donneur Informations portes par lA D N donneur

A partir de lARN:

Comme pour lADN gnomique, lARN est obtenu partir de lignes

cellulaires, de tissus ou dorganismes entiers. Mais chaque type


Quelles sont ces informations?
cellulaire exprime un lot donn de gnes donc pour un organisme donn

on part dun lot judicieux de cellules; lARN est diffrent pour chaque

type cellulaire.

Donnez un exem p le.


Informations portes par lA D N donneur
Slection du fragment dADN voulu
Sur lADN gnomique:

rgion codante et non codante


(rgions promotrices, rgulatrices)

D iffrentes possibilits sont envisageables; lune


Sur lAD N complmentaire:
dentre elles est le criblage de banque.
rgion codante,
mais il y a aussi les rgions (5et 3 non traduites)

Questions? Les enzymes de restrictions


Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ? Dfinition: les enzymes de restriction sont des enzymes bactriennes
Quelles informations porte cet AD N ? qui reconnaissent des squences spcifiques sur lADN de 4 8
Comment slectionner le fragment dADN voulu? paires de bases, et qui clivent lA D N sur les deux brins au niveau de
Quest ce quune enzyme de restriction? ces sites. Elles coupent lADN au niveau des ponts phosphodiesters.

Quels sont les vecteurs de clonage?

Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis? OH

Les cellules htes


OH
Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte
et comment celle-ci se multiplie?

Les intrts du clonage?


V isualisation
des fragments
de restriction

An Introduction to Genetic Analysis An Introduction to Genetic Analysis

Les enzymes de restriction


Caractristiques:

la plupart des sites sont des squences inverses rptes:

cas de EcoRI: 5 GAATTC 3


3 CTTAAG 5

Coupure avec formation de bouts collants ou bouts francs:

5 rentrant 5 sortant bout franc

5 3 5 3 5 3

3 5 3 5 3 5

EcoRI PstI SmaI


Enzyme Organism from which derived Target sequence
(cut at *)
5' -->3' Questions?
Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Comment obtenir lADN de l organisme donneur ?
Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T
Quelles informations porte cet AD N ?
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Comment slectionner le fragment dADN voulu?
Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G
Hae III Haemophilus aegyptius GG*CC Quest ce quune enzyme de restriction?
Hha I Haemophilus haemolyticus GCG*C
Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T Quels sont les vecteurs de clonage?
Hpa I Haemophilus parainflenzae GTT*AAC
Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?
Kpn I Klebsiella pneumoniae GGTAC*C
Mbo I Moraxella bovis *G A T C Les cellules htes
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
Pst I Providencia stuartii CTGCA*G
Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte
Sma I Serratia marcescens CCC*GGG et comment celle-ci se multiplie?
SstI Streptomyces stanford GAGCT*C
Les intrts du clonage?
Sal I Streptomyces albus G G*TCGAC
Taq I Thermophilus aquaticus T*CGA
Xma I Xanthamonas malvacearum C*CCGGG

Proprits des vecteurs de clonage Diffrents vecteurs de clonage


capables de rplication autonome dans une cellule hte donne
(origine de rplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)

Taille maximum approximative du fragment dADN qui peut tre


clon dans chaque vecteur

Type de vecteur ADN clon en kb


Plasmide 20
Molecular Cell Biology
Phage lambda 25
possde un polylinker ou site multiple de clonage
Cosmide 45
Phage P1 100
BAC(bacterial artificial chromo some) 300
YAC (yeast artificial chromo some) 1000
Molecular Cell Biology

supporte linsertion dun fragment dADN plus ou moins grand


Les plasm ides com m e vecteurs de clonage Les plasm ides com m e vecteur de clonage

M o lcule dADN de taille rduite

M o lcule dA D N circulaire

Peut tre considre com m e un m inichromosome capable de


rplication autonome

Permet la rsistance un antibiotique

Molecular Cell Biology

Quel type dorigine de rplication choisiriez vous? Quelles molcules sont capables de se rpliquer?

Les cosmides comme vecteurs de clonage


Les phages com m e vecteurs de clonage

Molecular Cell Biology


Molecular Cell Biology
Les Y A C s com m e vecteurs de clonage Questions?
Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ?
Quelles informations porte cet AD N ?
Comment slectionner le fragment dADN voulu?
Quest ce quune enzyme de restriction?

Quels sont les vecteurs de clonage?

Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?

Les cellules htes

Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte


et comment celle-ci se multiplie?

Les intrts du clonage?

La ligation Questions?
Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ?
Quelles informations porte cet AD N ?
Comment slectionner le fragment dADN voulu?
Quest ce quune enzyme de restriction?

Une enzyme, la ligase, est capable Quels sont les vecteurs de clonage?

de lier de faon covalente deux Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?

molcules dAD N en une. Les cellules htes

Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte


et comment celle-ci se multiplie?

Les intrts du clonage?


Molecular Cell Biology
Les cellules htes Questions?
Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ?
Quelles informations porte cet AD N ?
Quelles types de cellules connaissez vous?
Comment slectionner le fragment dADN voulu?
Quest ce quune enzyme de restriction?

Quels sont les vecteurs de clonage?

Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?

Les cellules htes

Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte


et comment celle-ci se multiplie?

Les intrts du clonage?

Introduction de lAD N recombinant dans les cellules htes Introduction de lAD N recombinant dans les cellules htes

De type procaryotique: De type procaryotique:

Cas dun vecteur plasm idique: lADN est introduit dans les Cas dun vecteur plasm idique:
bactries traites spcialement le plus souvent par choc therm ique
ou par choc lectrique.
Slection des clones intressants Slection des clones intressants

Dans ce cas les bactries transformes avec le vecteur ne possdant pas et possdant linsert sont Dans ces deux cas pouvez vous diffrencier les clones intressants?
slectionnes.

Molecular Cell Biology

An Introduction to Genetic Analysis

Procdure complte Introduction de lAD N recombinant dans les cellules htes

De type procaryotique:

Cas dun vecteur plasm idique

Cas dun vecteur phagique:


Introduction de lAD N recombinant dans les cellules htes
Introduction de lAD N recombinant dans les cellules htes

De type procaryotique:

Cas dun vecteur plasm idique

Cas dun vecteur phagique

De type eucaryotique:

A votre avis?

An Introduction to Genetic Analysis

Production de protines
Questions? Utilisation de vecteur dexpression

Comment obtenir lADN de lorganisme donneur ?


Quelles informations porte cet AD N ?
Comment slectionner le fragment dADN voulu?
Quest ce quune enzyme de restriction?

Quels sont les vecteurs de clonage?

Comment lADN dintrt et le vecteur sont-ils lis?

Les cellules htes

Comment lA D N recombinant est introduit dans une cellule hte

et comment celle-ci se multiplie?


Molecular Cell Biology
Les intrts du clonage, quelques exemples?
Quelles types de protines chercheriez vous produire?
Exemple de linsuline Problme de la maturation protique

An Introduction to Genetic Analysis

Cration de plantes transgniques


Problme de la maturation protique

Que suggriez vous pour passer outre ce problme?

An Introduction to Genetic Analysis


Cration danimaux transgniques

Des questions?

Licence dInformatique Anne 2001-2002


Option: Introduction la biologie molculaire

Banques dADN

Que chercheriez-vous cloner?


Banques dADN
Banque dADN gnom ique Comment dfinir si une banque est suffisam m ent grande
pour esprer trouver un fragment dintrt?

Calcul afin de dfinir la probabilit de trouver une squence donne


en fonction de:

Quels peuvent-tre votre avis les facteurs prendre en


compte pour ce calcul?

Molecular Cell Biology

Comment dfinir si une banque est suffisam m ent grande Taille de diffrentes banques
pour esprer trouver un fragment dintrt?

Calcul afin de dfinir la probabilit de trouver une squence donne


dans une banque.
N:nombre de colonie
Taille
P=1-(1-f) N Source moyenne des P=0.90 P=0.95 P=0.99
d'ADN fragments
f est fonction de la taille du gnome, de sa complexit et de la taille dADN clons
du fragment clon. E.coli 8,5 106 720 940 1440

N est le nombre de colonies


Cette formule nest valable que si la taille du fragment x isoler est
Yeast 1 107 2300 3000 4600
petite en comparaison de la taille L du fragment qui est clon dans
le vecteur de clonage.
Drosophile 1 107 23 000 30 000 46 000
Sinon il faut utiliser une valeur corrige

f =f(1-x/L))
Criblage dune banque phagique
Banque dADNc

Le problme ici est


lobtention de clone dit
full lenght.

Quel est le matriel de dpart?

An Introduction to Genetic Analysis

Exemples de dmarches suivre afin disoler un gne Exemples de dmarches suivre afin disoler un gne

Dpend du matriel de dpart:


Que proposeriez-vous?
Si squence rgulatrice: criblage dune banque dA D N
gnomique puis une banque dADNc

Si squence codante: criblage directement dune banque


dA D N c
Rfrences
G r iffiths , Anthony J.F., M iller , Jeffrey H., Suzuki , David,
Lewontin , Richard C., Gelbart , William M., An introduction to
genetic analysis, 7/e, 2000, W .H. Freeman.

Chapitre 12 et 13
http://ww w .ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View ..ShowSection&rid=i
ga

Lodish, Berk, Zipursky Matsudaira, Baltimore, Darnell,


Molecular Cell Biology

Chapitre 7
http://ww w .ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mc
b.TOC

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