PRACTICA N1 DE TERCERA FASE

PRUEBA DE ELISA INDIRECTA

INTRODUCCION:
La tcnica ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ensayo por
inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno
inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un
producto detectable, como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir
los costes del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al
antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima
anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante
espectrofotometra el antgeno en la muestra.
Como tcnica inmunoquimica se basa en reaccin especifica antgeno anticuerpo, que en este
caso es el tipo primario es decir el reconocimiento especifico y combinacin entre ambas
molculas simplemente.
En esta prctica trabajaremos para la deteccin del virus de PRR (Sndrome respiratorio y
reproductivo porcino)

FUNDAMENTOS:
El ELISA se basa y el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de
los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un
soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto,
ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima
producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin:
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich

Antgeno marcado

ELISA competitivo

ELISA Directo: Consta de las siguientes etapas:

1. Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar
los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos
reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto:
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de
estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
3. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA Sndwich DAS: (Double Antibody Sandwich).

Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar
especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una
enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y
que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA Sndwich HADAS:

Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar
especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales
reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan
reaccionado.
 4. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el
paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
5. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
6. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA Competitivo:
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado
en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de
estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso
anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan
reaccionado.
3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a
estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte.
Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est
relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la
diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema
en la muestra.

OBJETIVO:
Conocer y saber el mtodo de ELISA para el diagnstico de PRRS.
Conocer y poder realizar este mtodo rpido y fcil

MATERIALES:
kits
Diluyente especial
Solucin de conjugado
Solucin sustrato gromo gnico
Solucin de frenado
26 pocillos (6)

Materiales
Puntas de pipetas
Micropipetas
Espectrofotmetro
PROCEDIMIENTO:
1. Sacar de la bolsa la placa con las tiras que van a ser utilizadas. Guardar en la bolsa el
resto de tiras. Atemperar todos los reactivos, patrones, muestras y tiras que van a ser
utilizados en el ensayo en este caso solo utilizamos (6).
Dispensar 100 ul de control (-) sin diluir en el pocillo lo mismo hacemos con el (+)
Dispersar 100 ul de muestra diluida en los pocillos correspondientes
Dejar incubar 18 C por 30 minutos
Dejamos a las 9:04 y lo sacamos a las 9:39

2. Luego que hemos encubado a medio ambiente

3. Lavamos 4 veces con 300ul de sol. Lavado
4. Dispensar 100ul de conjugado y emcubar 30 min

5. Lavar 4 veces con 300 ul de sol. De lavado

6. Despesar 100 ul de sustrato de TMB a cada pocillo dejar por 15 minutos
7. Frenar con 100 ul de solucin de frenado a cada pocillo
8. Lectura a 650 nm